一種基于施氏假單胞菌細(xì)胞催化的柚皮苷羥基保護(hù)反應(yīng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物催化及生物醫(yī)藥合成與控制領(lǐng)域，具體涉及一種基于施氏假單胞 菌細(xì)胞催化的柚皮苷羥基保護(hù)反應(yīng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃酮類化合物是兩個(gè)苯環(huán)通過(guò)三個(gè)碳原子相互連接而形成的一系列重要的多酚 類化合物，廣泛存在于幾乎所有的植物，尤其是蔬菜和水果；在醫(yī)藥、食品和化妝品上有很 大的應(yīng)用價(jià)值。黃酮有多種生物活性包括抗氧化活性，抗炎，抗癌的，抗菌，抗過(guò)敏和抗 病毒等，然而，由于其多羥基結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，大部分黃酮生物活性受限于其低脂溶性或水溶 性。位于苯環(huán)或配糖體骨架上的羥基對(duì)黃酮的生物和化學(xué)活性有重要的影響。黃酮的酯化 被認(rèn)為是一種很有前景的方法，能用于提高黃酮的溶解度，從而使黃酮展示出更多的生理 活性。已有研究表明，有選擇地修飾黃酮類化合物結(jié)構(gòu)不僅可以提高物理化學(xué)屬性，如， 熱穩(wěn)定性和脂溶性；而且能增強(qiáng)其生物活性，如抗氧化活性、抗菌活性、細(xì)胞滲透能力、減 肥和降血脂功能。
[0003] 柚皮苷是黃酮苷中的一種，在醫(yī)藥上具有降低膽固醇，抗炎止血等功效，也可以作 為抗氧化劑添加到食品中。柚皮苷有8個(gè)羥基，分布在苯環(huán)或者糖環(huán)上。環(huán)上的羥基對(duì)其 活性有重要的影響，因此選擇性的對(duì)柚皮苷的羥基進(jìn)行酯化具有重要的意義，即可以保持 其活性又可以提高其脂溶性來(lái)增加其他方面的活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明利用傳統(tǒng)的化學(xué)方法通常難以對(duì)特定的羥基進(jìn)行保護(hù)，本發(fā)明目的在于開(kāi) 發(fā)一種基于施氏假單胞菌細(xì)胞催化的柚皮苷羥基保護(hù)反應(yīng)方法。施氏假單胞菌細(xì)胞促柚皮 苷水合物?；磻?yīng)的最適有機(jī)溶劑、?；w、酰基供體與柚皮苷水合物摩爾比、初始水含 量、施氏假單胞菌細(xì)胞催化劑、反應(yīng)溫度和振蕩速度分別為叔戊醇、丙酸乙烯酯（VP)、20:1、 0%(￥八）、4011^/1^、40°(：和180印111，反應(yīng)2411后產(chǎn)率可達(dá)到70.8%。反應(yīng)條件對(duì)施氏假單胞 菌細(xì)胞在柚皮苷丙?；磻?yīng)中的區(qū)域選擇性影響不大，6~_區(qū)域選擇性保持在99%以上。
[0005] 該方法催化劑制備簡(jiǎn)單易操作，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率高，初速度快，羥基保護(hù)區(qū)域 選擇性可控制，克服了傳統(tǒng)化學(xué)方法的選擇性低而導(dǎo)致底物利用率低，產(chǎn)物純度低，易生成 副產(chǎn)物等缺點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)： 一種基于施氏假單胞菌細(xì)胞催化的柚皮苷羥基保護(hù)反應(yīng)方法，包括以下步驟： 1) 制作施氏假單胞菌細(xì)胞催化劑：將細(xì)菌種子液接種至含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基 中，接種量為〇. 5%~20% (v/v)，培養(yǎng)條件為30°C~50°C，培養(yǎng)時(shí)間為12~144h;離心后收集 菌體，蒸餾水洗滌兩次，經(jīng)真空冷凍干燥12h-36h，收獲菌體干粉，即為細(xì)菌細(xì)胞催化劑； 2) 在帶塞三角瓶中加入有機(jī)溶劑； 3) 加入黃酮類化合物； 4) 加入?；w； 5) 在有機(jī)溶劑反應(yīng)體系中加入0~160yL水； 6) 加入施氏假單胞菌細(xì)胞催化劑使整個(gè)反應(yīng)體系最終質(zhì)量為20~160mg，混合均勻； 7) 置于水浴恒溫振蕩器反應(yīng)，速度為100~260rpm。
[0007] 進(jìn)一步地，可適當(dāng)改變步驟2)所述帶塞三角瓶的體積來(lái)放大或縮小反應(yīng)體系體 積； 步驟2)所述帶塞三角瓶體積為IOmL;所述有機(jī)溶劑是單一種類有機(jī)溶劑或混合有機(jī) 溶劑，其中單一種類有機(jī)溶劑是叔丁醇或叔戊醇，混合有機(jī)溶劑是乙腈-叔戊醇、吡啶-叔 戊醇等；有機(jī)溶劑的體積為2mL; 步驟3)所述黃酮類化合物為柚皮苷或秦皮甲水合物，其用量為10mmol-90mmol; 步驟4)所述?；w為用量為60 ~2400mmol的丙酸乙稀酯； 步驟5)所使用水為超純水或雙蒸水； 步驟7)所述反應(yīng)溫度控制方法為水浴搖床恒溫震蕩器水浴或恒溫?fù)u瓶柜氣浴等，反應(yīng) 溫度為 25°C~60°C。
[0008] 進(jìn)一步優(yōu)化地，所述方法包括以下步驟： 1) 制作施氏假單胞菌細(xì)胞催化劑； 2) 在IOmL帶塞三角瓶中加入2mL有機(jī)溶劑，可為純有機(jī)溶劑或混合有機(jī)溶劑； 3) 加入柚皮苷水合物； 4) 加入酰基供體丙酸乙烯酯，用量分別為60 ~2400mmol; 5) 在2mL叔戊醇反應(yīng)體系中加入0-160yL水； 6) 在2mL叔戊醇反應(yīng)體系中加入施氏假單胞菌細(xì)胞催化劑使整個(gè)反應(yīng)體系最終質(zhì)量 為 20~160mg; 7) 柚皮苷羥基保護(hù)時(shí)反應(yīng)溫度為25°C~60°C，于水浴恒溫振蕩器反應(yīng)； 8) 在水浴恒溫振蕩器振蕩反應(yīng)，震蕩速度為100~260rpm。
[0009] 步驟2)中反應(yīng)所使用的三角瓶體積不限于10mL，反應(yīng)體系可適當(dāng)放大或縮??；有 機(jī)溶劑是單一種類有機(jī)溶劑如吡啶或是混合有機(jī)溶劑，如乙腈-叔戊醇、叔丁醇-吡啶、叔 戊醇-吡啶；最佳混合有機(jī)溶劑為叔戊醇，但不限于此溶劑； 步驟5)中所使用水為超純水或雙蒸水； 步驟8)恒溫震蕩器不限于水浴搖床，如恒溫?fù)u瓶柜等氣浴條件也可。
[0010] 本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比具有如下的優(yōu)點(diǎn)： 1、利用生物催化劑施氏假單胞菌細(xì)胞作為催化劑，較之化學(xué)催化劑反應(yīng)條件溫和、環(huán) 境友好；較之酶催化劑成本低。
[0011] 2、該方法中催化劑制備簡(jiǎn)單易操作，酰基供體丙酸乙烯酯常用易購(gòu)買，反應(yīng)初速 度快，產(chǎn)率高，區(qū)域選擇性高，克服了傳統(tǒng)化學(xué)方法的選擇性低導(dǎo)致底物利用率低，產(chǎn)物純 度低，易生成副產(chǎn)物等缺點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施和保護(hù)范圍不限于 此。
[0013] 實(shí)施例I 在IOmL帶塞三角瓶中均加入2mL吡啶、60mmol柚皮苷水合物、1200mmol丙酸乙烯酯和SOmg施氏假單胞菌細(xì)胞催化劑，混合均勻，置于水浴恒溫振蕩器反應(yīng)（40°C、180r/min)， 定時(shí)取樣20yL，用60% (體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇-水混合溶液稀釋50倍，混合均勻后離心 (15, 000r/min)15min，自動(dòng)進(jìn)樣器取上清液20yL，供高效液相色譜分析。在純叔戊醇中施 氏假單胞菌細(xì)胞可以催化柚皮苷發(fā)生?；磻?yīng)，24h后產(chǎn)率分別為70. 8%，6' '區(qū)域選擇性 分別為99. 5%。
[0014] 菌種培養(yǎng)方法：斜面培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；種子液培養(yǎng)24h后接種到發(fā)酵培養(yǎng) 基中，接種量為2% (v/v)，180r/m，30°C，培養(yǎng)48h。種子液培養(yǎng)基（w/v)為1%葡萄糖，1% 牛肉膏，1% 蛋白胨，〇? 5%K2HPO4, 0? 02%MgSO4 ? 7H20,0. 5%NaCl，pH7. 0±0. 1 ;發(fā)酵培養(yǎng)基 (w/v)為 0? 5% 大豆油，0? 1% 酵母浸膏，0? 5% (NH4)2S04,0. 1%K2HPO4, 0? 02%MgSO4 ? 7H20。
[0015] 實(shí)施例2 在3個(gè)IOmL帶塞三角瓶中把60mmol柚皮苷水化合物、1200mmol丙酸乙烯酯分別和 2mL有機(jī)溶劑（四氫呋喃、叔丁醇、叔戊醇）混合，加入SOmg施氏假單胞菌細(xì)胞催化劑，混合 均勾，置于水浴恒溫振蕩器反應(yīng)（40°C、180r/min)，定時(shí)取樣10yL，用40%甲醇-水混合溶 液稀釋100倍，混合均勻后離心（15, 000r/min) 15min，自動(dòng)進(jìn)樣器取上清液20yL，供高效 液相色譜分析。反應(yīng)結(jié)果如表1。
表中，反應(yīng)條件：2mL有機(jī)溶劑，80mg施氏假單胞菌細(xì)胞催化劑，60mmol柚皮苷水合 物，1200mmol丙酸乙稀酯，40°C，180rpm，反應(yīng) 24h。
[0017] 實(shí)施例3 在8個(gè)IOmL帶塞三角瓶中均加入2mL叔戊醇，再向8個(gè)帶塞三角瓶中分別加入不同用 量的袖皮昔（IOnmiol、20mmol、40mmol、50mmol、60mmol、70mmol、80mmol、90mmol)，最后向 每個(gè)帶塞三角瓶中均