；在屯、肌組織中表 達出現(xiàn)顯著性差異（包括升高或者降低）的有74個miRNAs,而在外周血中表達出現(xiàn)顯 著性差異（包括升高或者降低）的有599個miRNAs,有25個miRNAs在兩種巧片中的 表達均發(fā)生改變，其中表達均升高的有6種（圖2A) 〇isa-miR-4491、hsa-miR-1285-3p、 hsa-miR-665、hsa-miR-660-：3p、hsa-miR-206 和hsa-miR-1268b)，表達均下降的有 2 種（圖 2B)化sa-miR-130a-化和hsa-miR-33〇-化），提不該8種miRNAs均可作為候選生物學標志 物用于慢性屯、力衰竭的診斷。由于循環(huán)miRNAs與組織miRNAs之間的表達分布受多種因 素影響，包括：組織生成、組織降解、組織攝取和組織分泌等，因此可能出現(xiàn)循環(huán)miRNAs和 組織miRNAs表達改變不一致的情況（Oncotarget. 2015Mar10.圧pub址eadofprint]， PMID:25860935)。并且由于慢性屯、力衰竭是由多種原因導致的全身多器官受累的疾病，其 他臟器功能也不同程度發(fā)生變化，循環(huán)miRNAs表達量不僅與屯、肌miRNAs表達量密切相關， 其他臟器功能也可能影響外周血miRNAs的表達（ClinChem. 2013Dec;59 (12) : 1742-52J HumHypedens. 2014May;28巧）：288-91)。因此只有該8種miRNAs是最可能和慢性屯、力 衰竭特異性相關的。
[0035] 實施例4.巧片結果Real-timePCR驗證
[0036] 在第二個獨立人群中，另外分別收集200例慢性屯、力衰竭患者和200例正常對照 人群外周血，按照上述方式提取RNA。
[0037] 采用廣州銳博公司miRNA檢測試劑盒對上述巧片初篩的在兩種巧片中的表達均 發(fā)生改變的8種miRNAs的表達在第二個獨立人群中進行real-time PCR檢測；
[003引 miRNAs逆轉錄；
[0039] 逆轉錄引物（RTPrimerMix)配置；
[0040] miRNARTPrimer1y1
[0041]U6RTPrimer1y1
[0042] RNasefree&0 78y1
[0043] 逆轉錄反應體系；
[0044] RNAtemplate2yg
[0045]RTPrimerMix4y1
[0046] RNasefree&0upto19y1
[0047]W上體系混勻后，瞬時離心7〇°C解育lOmin后，冰育2min，再加入W下試劑：
[0048] 2XTSreactionbuffer25y1
[0049]TSenzyme2. 5y1
[0050]RNasefree&0 3. 5y1
[0化1] 逆轉錄反應程序：
[0化引 42°C60min，70°ClOmin;停止后4°C備用，產物保存于-20°c。
[005引miRNAsreal-timePCR;
[0054]反應體系；2XSYBRGreenMix9y1 [0化5]RTproduct2y1
[0056] miRNA化風3'(1Primer2y1
[0057] miRNAReversePrimer2y1
[0化引RNase-free&0 5y1
[0059] 反應程序：
[0060] 95°C30sec-巧5°ClOsec-60°C20sec-70°CIsec)X40cycles-Melting Curve
[0061] 結果顯示；其中8種miRNAs,即miR-4491、miR-1285-3p、miR-665、miR-660-化、 miR-206、miR-1268b、miR-130a-化和miR-33〇-化表達的結果與巧片檢測結果一致，兩個慢 性屯、力衰竭患者人群的外周血中miRNAs變化趨勢結果相同（圖3)。表明8種miRNAs可作 為一類慢性屯、力衰竭診斷的候選生物標志物，realtimePCR檢測方法結果可靠。
[0062] 實施例5.差異性表達miRNAs診斷慢性屯、力衰竭的靈敏度
[0063] 收集200例慢性屯、力衰竭患者（取自2007-2014年武漢市醫(yī)院住院患者，每個病 例均由兩個或W上臨床醫(yī)師確診分類）和200例正常對照人群外周血。按照前述方法提取 RNA，并檢測實施例4中篩選出的8種miRNAs的表達，并進行R0C分析。
[0064] 結果顯示；患者外周血中miR-4491、miR-1285-3p、miR-665、miR-660-：3p、miR-206 和miR-1268b分別升高至對照組人群的約50倍、40倍、100倍、800倍、45倍和50倍，而 1111尺-1303-化和11111?-330-化分別下降至對照組人群的50%左右（圖3)。且11111?-4491、 miR-1285-3p、miR-665、miR-660-化、miR-206 和miR-1268b對診斷慢性屯、力衰竭具有高靈 敏度（AUOO. 9)(圖4A)，其中屯、肌高豐度的miR-1285-3p，miR-665和miR-660-化的表達 量與射血分數(shù)顯著相關（P<〇. 05)(圖4B)。
[0065] 目前，屯、臟射血分數(shù)是臨床上最常用的用于評估屯、臟功能指標，屯、臟射血分數(shù)越 低提示患者預后越差。表明miR-1285-3p，miR-665和miR-660-化可作為一種診斷和評估 慢性屯、力衰竭預后的生物標志物。
[0066] 實施例6.制備檢測慢性屯、力衰竭風險評估的試劑盒
[0067] 試劑盒成分；檢測試劑盒包括用于擴增8種miRNAs(miR-4491、miR-1285-3p、 miR-665、miR-66〇-3p、miR-206、miR-1268b、miR-130a-化和miR-33〇-化）的特異性逆轉 錄引物及real-timePCR引物對各一套；用于擴增對照RNA扣6)的特異性逆轉錄引物及 real-timePCR引物對一套及相關試劑，成分和含量如下（100次），保存于-20度。所述 引物根據下列引物設計原則獲得；1)基于莖凸環(huán)結構設計的的特異性逆轉錄引物與miRNA 3'端序列結合，在逆轉錄酶作用下進行針對特定miRNA的特異性逆轉錄反應；2)基于逆轉 錄引物序列設計的特異性正向PCR引物、通用反向引物。
[0068]
[0069]
[0070] W上試劑均由各來源公司提供，已經商品化。具體檢測方法及相關反應參數(shù)參照 實施例1。
[0071] 序列表；
[0072] miR-4491、miR-1285-3p、miR-665、miR-660-：3p、miR-206、miR-1268b、miR-130a-3p 和miR-330-化
[0073] hsa-miR-4491 核酸序列；
[0074] SequenceIDNo. 1:5'AAUGUGGACUGGUGUGACCAAA3'
[0075] hsa-miR-1285-化核酸序列；
[0076] SequenceIDNo. 2:5'UCUGGGCAACAAAGUGAGACCU3'
[0077] hsa-miR-665 核酸序列；
[0078] SequenceIDNo. 3:5-ACCAGGAGGCUGAGGCCCCU3-
[0079] hsa-miR-660-化核酸序列；
[0080] SequenceIDNo. 4:5'ACCUCCUGUGUGCAUGGAUUA3'
[OOW] hsa-miR-206 核酸序列；
[0082] SequenceIDNo. 5:5'UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG3'
[008引hsa-miR-1268b核酸序列；
[0084] SequenceIDNo. 65'CGGGCGUGGUGGUGGGGGUG3'
[0085] hsa-miR-130a-化核酸序列；
[0086] SequenceIDNo. 7:5'CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU3'
[0087] hsa-miR-330-化核酸序列；
[0088] SequenceIDNo. 8:5-GCAAAGCACACGGCCUGCAGAGA3-。
【主權項】
1. 一種診斷慢性心力衰竭或評估慢性心力衰竭預后的外周血miRNAs生物標志 物，其特征在于，所述生物標志物包括hsa-miR-4491、hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-665、 hsa-miR-660-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-1268b、hsa-miR-130a-3p 和 / 或 hsa_miR-33〇-3p， 其序列結構分別如SEQ ID No. 1-8所示。2. 如權利要求1所述的生物標志物，其特征在于，所述生物標志物包括 hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-665 和 / 或 hsa-miR-660-3p，其序列結構分別如 SEQ ID No. 2、 3和4所示。3. -種用于檢測下列miRNAs序列的試劑，其特征在于，所述序列包括SEQ ID No. 1，2， 3,4,5,6,7 和 / 或 8。4. 如權利要求3所述的試劑，其特征在于，所述試劑為所述miRNAs序列的逆轉錄引物 和擴增引物。5. 如權利要求3或4所述的試劑，其特征在于，所述miRNAs序列為SEQ ID No. 2、3和 /或4。6. 權利要求3-5任一所述的試劑在制備診斷或者評估慢性心力衰竭患者預后的試劑 盒中的用途。7. 如權利要求6所述的用途，其特征在于，所述的慢性心力衰竭包括先天性心臟病、冠 心病、急性心肌梗死、風心病、高血壓、心律失常、各種病因導致的心肌炎、心肌病等病因導 致的慢性心力衰竭。8. -種診斷或者評估慢性心力衰竭患者預后的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括 權利要求3-5任一所述的試劑。9. 如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的慢性心力衰竭包括先天性心臟病、 冠心病、急性心肌梗死、風心病、高血壓、心律失常、各種病因導致的心肌炎、心肌病等病因 導致的慢性心力衰竭。10. -種檢測權利要求1所述的miRNAs生物標志物的方法，其特征在于，用權利要求 3-5任一的試劑對所述miRNAs生物標志物進行檢測。
【專利摘要】慢性心力衰竭相關的血清miRNA及其應用。本發(fā)明提供一類外周血miRNAs在慢性心力衰竭的作為生物標志物風險評估/診斷和預后中的用途。其中，hsa-miR-4491、hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-665、hsa-miR-660-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-1268b、hsa-miR-130a-3p和hsa-miR-330-3p在慢性心力衰竭患者外周血中差異性表達；證明外周血hsa-miR-665等能特異性診斷慢性心力衰竭，并且其表達水平與射血分數(shù)呈相關性，具有評估預后的作用。從而，通過檢測上述miRNAs的表達水平可用來預測和協(xié)助診斷已經存在的慢性心力衰竭或評估慢性心力衰竭的預后。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/113
【公開號】CN104988216
【申請?zhí)枴緾N201510308334
【發(fā)明人】汪道文, 陳琛, 李華萍
【申請人】汪道文, 陳琛, 李華萍
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年6月8日