一種高產(chǎn)間苯三酚基因工程菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)間苯三酚基因工程菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]間苯三酚是一種重要的精細(xì)化工產(chǎn)品，是合成黃酮、異黃酮類藥物的中間體，間苯三酚本身可作為一種優(yōu)良的平滑肌解痙藥物，廣泛應(yīng)用于臨床。間苯三酚還能抑制過氧化物酶活性，具有抗炎抗氧化作用，它可催化H2O2分解為分子氧和水，是一種重要的抗氧化酶。此外，間苯三酚還是一種性能優(yōu)越的抗養(yǎng)護劑、穩(wěn)定劑、燃料偶合劑、輪胎增粘劑等，具有廣闊的市場需求。目前，間苯三酚的工業(yè)化生產(chǎn)方法主要為化學(xué)合成法，包括三硝基甲苯(TNT)法、異丙基苯法、氯代苯法和苯胺法。化學(xué)合成法存在多種弊端，如原料來源困難、副產(chǎn)物較多、分離提純困難、環(huán)境污染嚴(yán)重等。以微生物發(fā)酵生產(chǎn)間苯三酚，可以克服化學(xué)法的多種弊端，并且生物法合成間苯三酚周期短，安全環(huán)保。
[0003]異源表達(dá)焚光假單胞菌聚酮合成酶基因phlD可以合成間苯三酸(JihaneAchkar, Mo Xian, Huimin Zhao, J.ff.Frost.B1synthesis of phloroglucinol[J].Journalof the American Chemical Society, 2005, 127(15):5332-5333.；ffenjuan Zha, SherylB.Rubin-Pitel, Huimin Zha0.Characterizat1n of the substrate specificity ofPhlD, a type III polyketide synthase from Pseudomonas fluorescens[J].Journalof B1logical Chemistry, 2006，281 (42):32036-32047.)。在此基礎(chǔ)上表達(dá)多重抗性激活因子marA，增強大腸桿菌對間苯三酚的耐受性，表達(dá)大腸桿菌自身的乙酰CoA羧化酶基因(Accase)，細(xì)胞內(nèi)丙二酸單酰CoA的水平為原始菌株的3.6倍(Yujin Cao, XinglinJiang, Rubing Zhang, Mo Xian.1mproved phloroglucinol product1n by metabolicallyengineered Escherichia coli[J].Appl Microb1l B1technol,2011，91:1545 - 1552.)。然而，間苯三酚目前的產(chǎn)量、產(chǎn)率仍然偏低，難以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。需要進一步對工程菌株進行基因改造，以期提高間苯三酚的合成能力。
[0004]大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)包含數(shù)百種代謝物，這些代謝物通過大量的生化和調(diào)節(jié)反應(yīng)相互關(guān)聯(lián)。代謝流的調(diào)控可在轉(zhuǎn)錄水平，轉(zhuǎn)錄后水平，酶活動力學(xué)等不同水平通過多種復(fù)雜機制實現(xiàn)。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是大腸桿菌最重要的調(diào)節(jié)模式。iclR是大腸桿菌的一種局部調(diào)控因子，能夠抑制aceBAK操作子的表達(dá)。aceBAK操作子主要負(fù)責(zé)編碼乙醛酸循環(huán)的相關(guān)酶，異檸檬酸裂解酶、蘋果酸合酶和異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸化酶(Hendrik ffaegeman, Stijn De Lausnay, Joeri Beauprez, Jo Maer tens, Marjan De Meyand Wim Soetaert.1ncreasing recombinant protein product1n in Escherichia coliK12through metabolic engineering.New B1technology.2013，2 (30): 255-261.)。敲除iclR能夠提高乙醛酸循環(huán)的活性，促進乙酸的利用。乙酰輔酶A合成酶(ACS)是細(xì)胞內(nèi)同化乙酸的主要途徑，ACS通過兩步酶促反應(yīng)催化乙酸合成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A經(jīng)過乙醛酸循環(huán)和TCA循環(huán)，提供細(xì)胞合成的前體物質(zhì)和能量。研宄表明，過表達(dá)acs能夠促進乙酸同化，降低乙酸的積累(Lin H, Castro NM, Bennett GN, San KY:Acetyl-CoA synthetaseoverexpress1n in Escherichia coli demonstrates more efficient acetateassimilat1n and lower acetate accumulat1n:a potential tool in metabolicengineering.Appl Microb1l B1technol 2006，71 (6):870-874.)。
[0005]過表達(dá)phlD、Accase等基因可提高間苯三酚產(chǎn)量，但目前間苯三酚的產(chǎn)量和產(chǎn)率仍無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。iclR是大腸桿菌內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，敲除iclR能夠顯著提高乙醛酸循環(huán)的活性。過表達(dá)acs能夠促進乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，提高乙酸的同化能力。敲除調(diào)控因子iclR同時過表達(dá)acs的基因改造方法對間苯三酚發(fā)酵生產(chǎn)的影響暫無報道，通過活化乙醛酸循環(huán)，促進乙酸同化提高間苯三酚產(chǎn)量的基因改造方法也無報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)間苯三酚基因工程菌的構(gòu)建方法，所采取的技術(shù)方案如下:
[0007]本發(fā)明的一個目的在于提供一種高產(chǎn)間苯三酚基因工程菌的構(gòu)建方法，該方法是敲除出發(fā)菌株的轉(zhuǎn)錄控制因子iclR基因獲得突變菌株，再將突變菌株轉(zhuǎn)為感受態(tài)后導(dǎo)入含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因Accase、乙酰輔酶A合成酶基因acs的重組質(zhì)粒，獲得重組細(xì)胞。
[0008]所述方法的步驟如下:
[0009]I)利用Pl噬菌體侵染供體菌，制備噬菌體的溶菌產(chǎn)物，再利用所得溶菌產(chǎn)物侵染出發(fā)菌，獲得侵染菌株；
[0010]2)制備步驟I)所得侵染菌株的感受態(tài)細(xì)胞，并導(dǎo)入質(zhì)粒PCP20，敲除卡那霉素抗性基因，獲得突變菌株；
[0011]3)制備含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因Accase、乙酰輔酶A合成酶基因acs的重組質(zhì)粒；
[0012]4)制備步驟2)所得突變菌株的感受態(tài)細(xì)胞，并導(dǎo)入步驟3)所得的重組質(zhì)粒，獲得重組菌。
[0013]優(yōu)選地，步驟I)所述供體菌，是大腸桿菌E.coli BW25113iclR:Kan。
[0014]優(yōu)選地，步驟I)所述出發(fā)菌，是大腸桿菌。更優(yōu)選地，所述大腸桿菌，是大腸桿菌E.coliBL21(DE3)。
[0015]優(yōu)選地，步驟3)所述聚酮合成酶基因phlD，來源于焚光假單胞菌Pseudomonasfluorescens, Genebank ID: 11830552 ;所述多重抗性激活因子marA，來源于大腸桿菌Escherichia coli,Genebank ID:6060688 ;所述乙醜 CoA 幾化酶基因 Accase 四個亞基，來源于大腸桿菌 Escherichia coli, accA 的 Genebank ID:6062185, accB 的 Genebank ID:6058890，accC 的 Genebank ID:6058863, accD 的 Genebank ID:6059083 ;乙酰輔酶 A 合成酶 acs，來源于大腸桿菌 Escherichia coli, Genebank ID:948572。
[0016]所述方法的具體步驟如下:
[0017]I)利用Pl噬菌體侵染大腸桿菌E.coli BW25113iclR:Kan,制備噬菌體的溶菌產(chǎn)物，再利用所得溶菌產(chǎn)物侵染大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)，獲得侵染菌株E.coli (DE3)iclR:Kan ；
[0018]2)制備步驟I)所得侵染菌株的感受態(tài)細(xì)胞，并導(dǎo)入質(zhì)粒pcp20，消除卡那霉素抗性基因，獲得突變菌株E.coli(DE3) AiclR;
[0019]3)將聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰輔酶A合成酶基因acs連接到載體pET30a上，獲得重組質(zhì)粒pET-phlD-marA-acs ；乙酰CoA羧化酶基因Accase連接到載體PACYC上，獲得重組質(zhì)粒pACYC-accADBC ;所述聚酮合成酶基因phlD，來源于焚光假單胞菌 Pseudomonas fluorescens, Genebank ID:11830552 ;所述多重抗性激活因子 marA，來源于大腸桿菌 Escherichia coli, Genebank ID:6060688 ;所述乙醜 CoA 幾化酶基因Accase四個亞基，來源于大腸桿菌Escherichia coli, accA的Genebank ID:6062185，accB 的 Genebank ID:6058890，accC 的 Genebank ID:6058863，accD 的 GenebankID:6059083 ;乙醜輔酶 A 合成酶 acs，來源于大腸桿菌 Escherichia coli, Genebank ID:948572 ；
[0020]4)制備步驟2)所得突變菌株E.coli (DE3) Δ iclR的感受態(tài)細(xì)胞，并將步驟3)所得的重組質(zhì)粒 pET-phlD-marA-acs 和 pACYC-accADBC 導(dǎo)入到突變菌株E.coli (DE3) Δ iclR的感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組菌。
[0021]所述任一方法用于獲得高產(chǎn)間苯三酚的基因工程菌和生產(chǎn)間苯三酚。
[0022]本發(fā)明的另一目的在于提供了一種利用所述方法生產(chǎn)間苯三酚的方法，該方法的步驟如下:
[0023]I)利用Pl噬菌體侵染大腸桿菌E.coli BW25113iclR:Kan,制備噬菌體的溶菌產(chǎn)物，再利用所得溶菌產(chǎn)物侵染大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)，獲得侵染菌株E.coli (DE3)iclR:Kan ；
[0024]2)制備步驟I)所得侵染菌株的感受態(tài)細(xì)胞，并導(dǎo)入質(zhì)粒pcp20，消除卡那霉素抗性基因，獲得突變菌株E.coli(DE3) AiclR;
[0025]3)將聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰輔酶A合成酶基因acs連接到載體pET30a上，獲得重組質(zhì)粒pET-phlD-marA-acs ；乙酰CoA羧化酶基因Accase連接到載體PACYC上，獲得重組質(zhì)粒pACYC-accADBC ;所述聚酮合成酶基因phlD，來源于焚光假單胞菌 Pseudomonas fluorescens, Genebank ID:11830552 ;所述多重抗性激活因子 marA，來源于大腸桿菌 Escherichia coli, Genebank I