新型雜合幾丁質(zhì)酶的創(chuàng)制的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因重組【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種獲得產(chǎn)量提高、活性增強(qiáng)的雜合幾丁質(zhì)酶的方法。根據(jù)幾丁質(zhì)酶基因的全長序列設(shè)計(jì)引物，定向克隆到pET-30a載體獲得pETChiA，然后在幾丁質(zhì)酶羧基端插入幾丁質(zhì)結(jié)合域或者催化域，重組成表達(dá)載體；將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)，用Tris緩沖液重懸得到的菌體，超聲破碎，離心收集上清液；通過HIS鎳柱收集獲得含有重組幾丁質(zhì)酶的溶液，產(chǎn)品純度高，產(chǎn)量高，活性高，成本低，生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。
【專利說明】新型雜合幾丁質(zhì)酶的創(chuàng)制
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因重組【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種獲得產(chǎn)量提高、活性增強(qiáng)的雜合幾丁質(zhì)酶的方法。

二、【背景技術(shù)】
[0002]由于傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥存在靶標(biāo)生物抗性、非靶標(biāo)生物毒性等問題，人類迫切需要開發(fā)綠色農(nóng)藥。幾丁質(zhì)(chitin)是N-乙酰葡萄糖胺以β-1，4-糖苷鍵連接而成的線性多糖。由于幾丁質(zhì)是昆蟲體內(nèi)重要的結(jié)構(gòu)組分(外骨骼和圍食膜)而不存在于高等動(dòng)植物體內(nèi)，因此幾丁質(zhì)被認(rèn)為是綠色農(nóng)藥研發(fā)的獨(dú)特靶標(biāo)。其中幾丁質(zhì)酶(chitinase，EC3.2.1.14)在幾丁質(zhì)降解中發(fā)揮著重要作用，目前已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)。但是目前存在的一個(gè)突出問題就是幾丁質(zhì)酶活性不高，因此如何提高它們的酶活性就成為迫切需要解決的問題。
[0003]幾丁質(zhì)酶一般包括信號(hào)肽(signalpeptide)、催化域(catalytic domain)、幾丁質(zhì)結(jié)合域、粘蛋白III型同源區(qū)(Fibronectin typeIII like domain)及鉸鏈區(qū)等多個(gè)功能區(qū)。其中，催化域的相似性較高，而其他結(jié)構(gòu)域的差異較大。近年來，通過缺失結(jié)構(gòu)域等方法對(duì)各個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能進(jìn)行了一些研究，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)結(jié)合域?qū)锥≠|(zhì)酶活性影響巨大。
[0004]幾丁質(zhì)結(jié)合域能幫助幾丁質(zhì)酶結(jié)合到幾丁質(zhì)底物上，提高局部區(qū)域的酶濃度，同時(shí)還能部分破壞多糖分子之間的物理結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)對(duì)底物的降解。根據(jù)幾丁質(zhì)結(jié)合域三維結(jié)構(gòu)的不同，可以分成三類:1、11和III型。真菌和植物的幾丁質(zhì)結(jié)合域?qū)儆贗型；病毒和昆蟲的幾丁質(zhì)結(jié)合域?qū)儆贗I型；細(xì)菌的幾丁質(zhì)結(jié)合域?qū)儆贗II型。這三種類型的結(jié)合域在功能上是否存在差異，目前還不清楚，但大量的研究表明缺失幾丁質(zhì)結(jié)合域的幾丁質(zhì)酶對(duì)可溶性底物的水解能力沒有變化或變化不大，但是對(duì)不可溶幾丁質(zhì)的水解能力卻降低，并且抑菌效果、殺蟲效果也降低了。另一方面，在不具有幾丁質(zhì)結(jié)合域的幾丁質(zhì)酶上添加幾丁質(zhì)(或多糖)結(jié)合域可以增加幾丁質(zhì)酶在底物表面的濃度，從而提高分解幾丁質(zhì)的能力。如哈茲木霉的幾丁質(zhì)酶基因Chit42中沒有幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域，在該基因表達(dá)產(chǎn)物的C端添加幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域能顯著提高降解幾丁質(zhì)的速度，而且對(duì)玉米螟的殺蟲效果提高30%。西南大學(xué)范艷華等在球孢白僵菌幾丁質(zhì)酶Bbchitl的羧基端添加家蠶幾丁質(zhì)酶、蚜蟲幾丁質(zhì)酶以及苦瓜幾丁質(zhì)酶的幾丁質(zhì)結(jié)合域均增加了雜合酶對(duì)晶體幾丁質(zhì)的結(jié)合能力及水解活性。和缺失幾丁質(zhì)結(jié)合域的Bacillus licheniformis DSM13幾丁質(zhì)酶(含催化域和幾丁質(zhì)結(jié)合域)突變體BliGH相比，用纖維素結(jié)合域取代DSM13幾丁質(zhì)酶的幾丁質(zhì)結(jié)合域獲得的雜合幾丁質(zhì)酶BliGH-CeBD對(duì)膠體幾丁質(zhì)的吸附能力、催化能力及構(gòu)象的穩(wěn)定性都增強(qiáng)了。令人感興趣的是將幾丁質(zhì)結(jié)合域添加到蛋白酶中也能使蛋白酶獲得結(jié)合幾丁質(zhì)的能力。還應(yīng)該注意，在含有幾丁質(zhì)結(jié)合域的幾丁質(zhì)酶C端添加外源或自身的幾丁質(zhì)結(jié)合域仍然能夠提高幾丁質(zhì)酶活性。如在煙草葉蛾的幾丁質(zhì)酶尾部添加水稻幾丁質(zhì)酶的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)或再次添加原幾丁質(zhì)酶的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)都能提高其結(jié)合膠體幾丁質(zhì)的效率和降解幾丁質(zhì)的能力。并且發(fā)現(xiàn)，隨著幾丁質(zhì)結(jié)合域數(shù)目的增加，結(jié)合效率和降解效率都會(huì)進(jìn)一步提高，即表現(xiàn)出劑量效應(yīng)。劑量效應(yīng)在一些含有多個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域的幾丁質(zhì)酶中也被發(fā)現(xiàn)。如嗜水氣單孢菌JP1i幾丁質(zhì)酶92有兩個(gè)重復(fù)的幾丁質(zhì)結(jié)合域，在它們都存在的情況下，幾丁質(zhì)酶對(duì)粉末幾丁質(zhì)和膠體幾丁質(zhì)的結(jié)合能力分別是單個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域的12倍和10倍。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]技術(shù)問題
[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)目前幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量低、活性低、純度低等問題，提供一種新型雜合幾丁質(zhì)酶的創(chuàng)制方法。
[0007]技術(shù)方案
[0008]本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:(I)根據(jù)幾丁質(zhì)酶基因Chi (chitinase，簡稱Chi)的全長序列設(shè)計(jì)引物，在引物5’端增加酶切位點(diǎn)，將幾丁質(zhì)酶基因序列定向克隆進(jìn)入pET30a載體；然后在幾丁質(zhì)酶的羧基端插入幾丁質(zhì)結(jié)合域。這樣即重組成表達(dá)載體pET-30a-Ch1-ChBD，相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物為Ch1-ChBD。(2)將步驟(1)中構(gòu)建好的表達(dá)載體pET-30a-Ch1-ChBD轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，用IPTG誘導(dǎo)重組基因的表達(dá)，離心收集菌體。(3)用PBS緩沖液重懸達(dá)到的菌體，超聲破碎，離心收集上清液，得到含有重組幾丁質(zhì)酶的溶液。(4)將含有重組幾丁質(zhì)酶的溶液上HIS鎳離子親和柱，用PBS緩沖液上柱，50mM咪唑洗脫雜蛋白，250mM洗脫目的蛋白，透析過夜，得到含有重組幾丁質(zhì)酶的純化品。上述Chi基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程見說明書附圖1、2所示。
[0009]上述步驟中，所述幾丁質(zhì)酶Chi的全長序列可從多種植物、微生物中獲得，本發(fā)明經(jīng)過篩選試驗(yàn)，利用PCR技術(shù)從高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的黏質(zhì)沙雷氏菌中獲取高活性的幾丁質(zhì)酶基因ChiC如序列表中所示S EQ NO-1 ;ChBD序列為黏質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶基因ChiC的幾丁質(zhì)結(jié)合域，其序列如序列表中所示SEQ N0-2。
[0010]利用本發(fā)明的基因重組技術(shù)獲得的雜合幾丁質(zhì)酶活性比野生型菌株提高數(shù)倍，而且通過HIS鎳柱純化得到的幾丁質(zhì)酶純度高，活性高，成本低，生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，在病蟲咅防治中起著重要作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為pET30a的質(zhì)粒示意圖譜。
[0012]圖2為pET-30a-Ch1-ChBD的質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
[0013]圖3為PCR擴(kuò)增幾丁質(zhì)酶基因Chi的電泳圖。
[0014]圖4 為 pET-30a-Ch1-ChBD 的 NdeI 和 HindIII 雙酶切電泳圖譜。
[0015]圖5為純化產(chǎn)物圖譜。
[0016]圖6為利用N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)作為顯色反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

三、【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例一:Chi基因表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)
[0018](I)選取篩選獲得的高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的黏質(zhì)沙雷氏菌，利用PCR技術(shù)克隆獲得Chi基因。該Chi基因全長序列如序列表中所示SEQ N0-1。根據(jù)Chi序列設(shè)計(jì)特異性引物(包含酶切位點(diǎn))如下所示:
[0019]上游引物ChiF:GGG CAT ATG AGC ACA AAT AAC A
[0020]下游引物ChiR:GGG GCG GCC GCA GGC GAT GAG CTG CCA
[0021]PCR 反應(yīng)體系 50μ1:
[0022]

【權(quán)利要求】
1.新型雜合幾丁質(zhì)酶的創(chuàng)制，其特征是包括以下步驟: (1)根據(jù)幾丁質(zhì)酶基因Chi的全長序列設(shè)計(jì)引物，在引物5’端增加酶切位點(diǎn)，將幾丁質(zhì)酶基因序列定向克隆進(jìn)入pET30a載體；然后在幾丁質(zhì)酶的羧基端插入幾丁質(zhì)結(jié)合域。這樣即重組成表達(dá)載體pET-30a-Ch1-ChBD，相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物為Chi_ChBD。 (2)將步驟(1)中構(gòu)建好的表達(dá)載體pET-30a-Ch1-ChBD轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中,用IPTG誘導(dǎo)重組基因的表達(dá)，離心收集菌體。 (3)用Tris緩沖液重懸達(dá)到的菌體，超聲破碎，離心收集上清液，得到含有重組幾丁質(zhì)酶的溶液。 (4)將含有重組幾丁質(zhì)酶的溶液上HIS鎳離子親和柱，用Tris緩沖液上柱，50mM咪唑洗脫雜蛋白，250mM洗脫目的蛋白，透析過夜，得到含有重組幾丁質(zhì)酶的純化品。
2.權(quán)利要求1所述幾丁質(zhì)結(jié)合域包括I個(gè)或者幾個(gè)不同類型或者同一類型的幾丁質(zhì)結(jié)合域。
3.權(quán)利要求1所述幾丁質(zhì)結(jié)合域包括但不限于幾丁質(zhì)結(jié)合域外，也包括催化域、蛋白酶等結(jié)構(gòu)域或 蛋白。
【文檔編號(hào)】C12N15/56GK104178473SQ201310662769
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】鐘萬芳, 郭慧芳, 劉寶生 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院