發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于由氣態(tài)原料產(chǎn)生脂質(zhì)的方法。所述方法包括一種用于由氣態(tài) 原料產(chǎn)生一種或多種脂質(zhì)產(chǎn)物的兩階段系統(tǒng)。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 全球能源危機(jī)引起了對(duì)于燃料生產(chǎn)替代方法的不斷關(guān)注。運(yùn)輸用的生物燃料是汽 油的有吸引力的替代物并且作為低濃度共混物快速進(jìn)入燃料市場(chǎng)。源自生物質(zhì)的生物燃料 生產(chǎn)已作為一種增加替代能源生產(chǎn)和減少溫室氣體排放的主要方法而出現(xiàn)。已證明由生物 質(zhì)生產(chǎn)生物燃料能使能源獨(dú)立，從而促進(jìn)農(nóng)村地區(qū)的發(fā)展及經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。
[0004] 第一代液體生物燃料利用碳水化合物原料，如淀粉、蔗糖、玉米、油菜籽、大豆、棕 櫚及植物油。第一代原料提出了許多重大的挑戰(zhàn)。這些碳水化合物原料的成本受其作為人 類(lèi)食品或動(dòng)物飼料的價(jià)值的影響，而用于乙醇生產(chǎn)的淀粉或蔗糖生產(chǎn)作物的耕種并不是在 所有地理區(qū)域中都是經(jīng)濟(jì)可持續(xù)的。這些原料作為生物燃料來(lái)源的持續(xù)使用將不可避免地 對(duì)耕地和水資源帶來(lái)極大的壓力。因此，感興趣的是開(kāi)發(fā)將成本較低和/或更豐富的碳資 源轉(zhuǎn)變成燃料的技術(shù)。
[0005] 第二代生物燃料是那些由纖維素和藻類(lèi)產(chǎn)生的。藻類(lèi)之所以被選擇用來(lái)生產(chǎn)脂質(zhì) 歸于其快速的生長(zhǎng)速率和藻類(lèi)消耗二氧化碳及產(chǎn)生氧氣的能力。
[0006] 已發(fā)現(xiàn)活躍的一個(gè)領(lǐng)域是脂質(zhì)的微生物合成，其包括生物燃料生產(chǎn)所需的原材 料。大量的研宄已證明能夠通過(guò)在不同的底物如工業(yè)用甘油、乙酸、污泥、乳清滲透物、甘蔗 糖蜜及稻草水解物上使用產(chǎn)油酵母而積聚脂質(zhì)。同時(shí)，這些第二代生物燃料技術(shù)由于高生 產(chǎn)成本以及運(yùn)輸和原料儲(chǔ)存成本而遇到了一些問(wèn)題。
[0007] 早已認(rèn)識(shí)到催化過(guò)程可用于將由C0、CO2或氫氣（H2)組成的氣體轉(zhuǎn)化為多種燃料 和化學(xué)品。然而，微生物也可用于將這些氣體轉(zhuǎn)化為燃料和化學(xué)品。雖然這些生物過(guò)程通 常比熱化學(xué)過(guò)程要慢，但與催化過(guò)程相比具有若干優(yōu)點(diǎn)，包括更高的特異性、更高的產(chǎn)率、 更低的能源成本以及更大的抗中毒能力。
[0008] 通過(guò)一氧化碳和/或氫氣及二氧化碳的厭氧發(fā)酵來(lái)產(chǎn)生乙酸（acetic acid)、 醋酸（acetate)及其它產(chǎn)物如乙醇已得到了論證。參見(jiàn)，例如Balch等人，（1977) International Journal of Systemic Bacteriology.，27:355-361 ;Vega 等人，（1989) Biotech. Bioeng.，34:785-793 ;Klasson 等人（1990)Appl. Biochem. Biotech.，24/25:1 ;等 等。
[0009] 已論證，產(chǎn)乙酸細(xì)菌，如來(lái)自醋酸桿菌屬、穆?tīng)柺暇鷮伲∕oorela)、梭狀芽孢桿菌 屬、瘤胃球菌屬、醋酸桿菌屬、真桿菌屬、丁酸桿菌屬、產(chǎn)醋桿菌屬（Oxobacter)、甲燒八疊 球菌屬、甲烷八疊球菌屬及脫硫腸狀菌屬的那些，利用包含H 2、0)2和/或CO的底物并且 通過(guò)Wood-Ljungdahl途徑（其中乙酰輔酶A合酶是關(guān)鍵酶）將這些氣態(tài)底物轉(zhuǎn)化為乙 酸、乙醇及其它發(fā)酵產(chǎn)物。舉例來(lái)說(shuō)，由氣體產(chǎn)生乙酸和乙醇的楊氏梭菌（Clostridium ljungdahli)的各種菌株描述于 WO 00/68407、EP 117309、美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5, 173, 429、 5, 593, 886 和 6, 368, 819、WO 98/00558 和 WO 02/08438 中。已知細(xì)菌醇梭菌菌種 (Clostridium autoethanogenum sp)也由氣體產(chǎn)生乙酸和乙醇（Aribini 等人，Archives of Microbiology 161，第 345-351 頁(yè)（1994))。
[0010] 在約30°C的溫度下生長(zhǎng)良好的伍氏醋酸桿菌（Acetobacterium woodi)( -種嚴(yán) 格厭氧的非孢子形成微生物）顯示由&和0)2產(chǎn)生乙酸。Balch等人首先公開(kāi)了細(xì)菌伍氏 醋酸桿菌，其通過(guò)氫氣的厭氧氧化和二氧化碳的還原來(lái)生長(zhǎng)。Buschorn等人證明了乙醇通 過(guò)伍氏醋酸桿菌在葡萄糖上的產(chǎn)生和利用。伍氏醋酸桿菌的發(fā)酵在高達(dá)20mM的葡萄糖（果 糖）濃度下進(jìn)行。Buschorn等人發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖濃度增加到40mM時(shí)，在伍氏醋酸桿菌進(jìn)入穩(wěn) 定生長(zhǎng)期時(shí)幾乎一半的底物被保留，且乙醇作為另外一種發(fā)酵產(chǎn)物出現(xiàn)。Balch等人發(fā)現(xiàn)， 通過(guò)由伍氏醋酸桿菌進(jìn)行的HjPCO 2的發(fā)酵所檢測(cè)的僅有的主要產(chǎn)物是根據(jù)以下化學(xué)計(jì)量 的乙酸：4H2+2C02->CH 3C00H+H20。
[0011] 乙酸可能是不合需要的發(fā)酵產(chǎn)物，因?yàn)樗菑暮l(fā)酵肉湯中回收的具有挑戰(zhàn)性 的產(chǎn)物，其商業(yè)用途有限。
[0012] 本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供一種通過(guò)至少某種方式克服以上缺點(diǎn)的方法和發(fā)酵系 統(tǒng)，或至少向公眾提供一種有用的選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 第一方面，提供一種用于由氣態(tài)底物產(chǎn)生至少一種脂質(zhì)產(chǎn)物的方法，所述方法包 括：
[0014] a)在含有至少一種微生物的培養(yǎng)物的第一生物反應(yīng)器中接納所述氣態(tài)底物，并發(fā) 酵所述氣態(tài)底物以產(chǎn)生選自至少一種酸或至少一種酸和至少一種醇的產(chǎn)物；以及
[0015] b)將所述產(chǎn)物的至少一部分傳送到包含至少一種微藻類(lèi)的培養(yǎng)物的第二生物反 應(yīng)器，并發(fā)酵所述酸以產(chǎn)生至少一種脂質(zhì)產(chǎn)物。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方案中，氣態(tài)底物包含CO或0)2和H2、或其混合物。在某些實(shí)施方案 中，氣態(tài)底物源自于工業(yè)來(lái)源。在某些實(shí)施方案中，將來(lái)自至少一個(gè)工業(yè)來(lái)源的至少一種氣 體共混以提供具有所期望的組成的氣態(tài)底物。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種酸選自由以下組成的組：乙酸、丁酸、琥珀酸、 乳酸或丙酸。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種醇選自包括以下的組：乙醇、丁醇、甲醇或丙 醇。
[0019] 在各種實(shí)施方案中，將在第一階段產(chǎn)生的所有酸和/或醇轉(zhuǎn)化為第二階段中的脂 質(zhì)。在各種實(shí)施方案中，回收第一階段中產(chǎn)生的至少一部分酸和/或醇。
[0020] 第二方面，提供一種用于由包含CO或0)2和H2或其混合物的氣態(tài)底物中產(chǎn)生至少 一種脂質(zhì)產(chǎn)物的方法，所述方法包括：
[0021] a)在包含至少一種微生物的培養(yǎng)物的初級(jí)生物反應(yīng)器中接納所述氣態(tài)底物，并發(fā) 酵所述氣態(tài)底物以產(chǎn)生至少一種酸；以及
[0022] b)將所述至少一種酸的至少一部分傳送到包含至少一種微藻類(lèi)的培養(yǎng)物的次級(jí) 生物反應(yīng)器，并發(fā)酵所述至少一種酸以產(chǎn)生至少一種脂質(zhì)產(chǎn)物。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種酸是乙酸且所述至少一種微生物選自由以 下組成的組：醋酸桿菌屬、穆?tīng)柺暇鷮佟⑺鬆钛挎邨U菌屬、熱球菌屬、真桿菌屬、脫硫細(xì) 菌屬、氧化碳嗜熱菌屬（Carboxydothermus)、產(chǎn)醋菌屬（Acetogenium)、厭氧醋菌屬 (Acetoanaerobium)、丁酸桿菌屬、消化鏈球菌屬、瘤胃球菌屬、產(chǎn)醋桿菌屬以及甲燒八疊球 菌屬。
[0024] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，包括pH范圍的發(fā)酵條件是成功發(fā)酵包含CO或0)2和H 2 或其混合物的氣態(tài)底物所必需的。發(fā)明人認(rèn)識(shí)到可根據(jù)本發(fā)明使用的任何具體的產(chǎn)乙酸微 生物將具有最佳的pH范圍，通常在pH 4與pH 8之間。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，初級(jí) 生物反應(yīng)器中的發(fā)酵pH維持在約pH 4. 5至約pH 6之間。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，pH維 持在pH 5. 5。
[0025] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在第二反應(yīng)器中產(chǎn)生的脂質(zhì)被用于產(chǎn)生至少一種三級(jí)產(chǎn)物。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種三級(jí)產(chǎn)物選自包括以下的組：生物柴油、氫化來(lái)源的可 再生柴油（HDRD)、脂肪酸甲酯（FAME)及脂肪酸乙酯（FAEE)。
[0026] 第三方面，提供一種用于通過(guò)厭氧微生物發(fā)酵產(chǎn)生至少一種產(chǎn)物的方法，所述方 法包括：
[0027] a)將包含CO或0)2和H 2或其混合物的底物接納至含有至少一種微生物的培養(yǎng)物 的第一初級(jí)生物反應(yīng)器，所述微生物選自由以下組成的組：醋酸桿菌屬、穆?tīng)柺暇鷮?、梭?芽孢桿菌屬、瘤胃球菌屬、真桿菌屬、丁酸桿菌屬、產(chǎn)醋桿菌屬、甲烷八疊球菌屬、甲烷八疊 球菌屬及脫硫腸狀菌屬，并厭氧發(fā)酵所述底物以產(chǎn)生包含乙酸的發(fā)酵肉湯；
[0028] b)將所述發(fā)酵肉湯送入含有至少一種微藻類(lèi)的培養(yǎng)物的次級(jí)生物反應(yīng)器中；以 及
[0029] c)對(duì)乙酸進(jìn)行發(fā)酵以產(chǎn)生至少一種脂質(zhì)產(chǎn)物。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一部分所述發(fā)酵肉湯作為肉湯排放物（broth bleed)從 初級(jí)生物反應(yīng)器被傳送到次級(jí)生物反應(yīng)器。
[0031] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在初級(jí)生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的產(chǎn)物作為滲透物排放物被除去。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施方案中，肉湯排放物和滲透物排放物在被送入次級(jí)生物反應(yīng)器之前合 并。
[0033] 在一個(gè)實(shí)施方案中，合并的發(fā)酵肉湯被加工以便在料流被送入次級(jí)生物反應(yīng)器之 前除去至少一部分乙酸。
[0034] 第四方面，提供一種用于控制發(fā)酵過(guò)程中的pH的方法，所述方法包括：
[0035] a)在第一生物反應(yīng)器中接納氣態(tài)底物，所屬第一生物反應(yīng)器含有在液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng) 基中的至少一種微生物的培養(yǎng)物，并發(fā)酵所述氣態(tài)底物以產(chǎn)生選自至少一種酸或至少一種 酸和至少一種醇的產(chǎn)物；
[0036] b)將所述產(chǎn)物的至少一部分傳送到第二生物反應(yīng)器，所述第二生物反應(yīng)器包含在 液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中的至少一種微藻類(lèi)的培養(yǎng)物，并發(fā)酵所述至少一種酸以產(chǎn)生至少一種脂 質(zhì)產(chǎn)物；以及
[0037] c)使至少一部分肉湯再循環(huán)回到第一生物反應(yīng)器，其中再循環(huán)肉湯中的酸濃度大 幅降低。
[0038] 應(yīng)當(dāng)理解，以下實(shí)施方案可應(yīng)用于如上所述的任何一個(gè)方面。
[0039] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在被送入次級(jí)生物反應(yīng)器之前，合并的發(fā)酵料流的pH被調(diào)節(jié) 至pH 6與pH 8之間。
[0040] 在各種實(shí)施方案中，次級(jí)生物反應(yīng)器中的脂質(zhì)生產(chǎn)可通過(guò)限制培養(yǎng)基中的至少一 種營(yíng)養(yǎng)素來(lái)增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，次級(jí)生物反應(yīng)器中的脂質(zhì)生產(chǎn)通過(guò)限制氮在培養(yǎng)基 中的量而增加。
[0041] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，次級(jí)生物反應(yīng)器中的發(fā)酵肉湯中的乙酸與氮的比 率是至少10:1。在一個(gè)實(shí)施方案中，次級(jí)生物反應(yīng)器的發(fā)酵肉湯中的乙酸與氮的比率是 49:1。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，離開(kāi)第一生物反應(yīng)器的酸料流被處理以提供將被傳送 到第二生物反應(yīng)器的純化的或濃縮的酸料流。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，監(jiān)測(cè)第二生物 反應(yīng)器中的發(fā)酵肉湯的碳：氮比率，并且調(diào)節(jié)到生物反應(yīng)器中的碳和氮的輸入以確保大于 49:1的碳：氮比率。
[0042] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，初級(jí)生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的乙酸具有至少約5g/L或 至少約l〇g/L、或至少約15g/L或至少約20g/L的濃度。
[0043] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，初級(jí)生物反應(yīng)器中乙酸的產(chǎn)生速率是至少約10g/L/ 天、或至少15g/L/天、或20g/L/天或至少約40g/L/天、或至少約60g/L/天。
[0044] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，微藻類(lèi)選自包括以下的組：小球藻屬、衣藻屬、杜 氏藻屬、裸藻屬、金藻屬、扁藻屬、紫球藻屬、螺旋藻屬、藍(lán)藻屬（Synechoccus)、項(xiàng)圈藻 屬、裂壺藻屬（Schizochytrium)、Botyrococcus、墨角藻屬、擬小球藻屬、偽小球藻屬、 Brateococcus、無(wú)綠藻屬（Prototheca)以及柵列藻屬（Scenedesmus)。
[0045] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在次級(jí)生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)物的pH維持在約pH 6 至約pH 8之間。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，pH維持在pH 7。
[0046] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，次級(jí)生物反應(yīng)器中的pH與初級(jí)生物反應(yīng)器中的pH 基本上相同。在替代實(shí)施方案中，離開(kāi)初級(jí)生物反應(yīng)器的料流在被送入次級(jí)生物反應(yīng)器之 前，其pH被調(diào)節(jié)至約pH 7。
[0047] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第二生物反應(yīng)器中的脂質(zhì)濃度是至少約10g/L或至 少約20g/L、或至少約40g/L、或至少約60g/L、或至少約80g/L、或至少約100g/L、或至少約 150g/L。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第二生物反應(yīng)器中的脂質(zhì)產(chǎn)生速率是至少約5g/L/ 天、或至少約7g/L/天、或至少約10g/L/天、或約15/g/L/天、或至少約20g/L/天、或至少 約 30g/L/ 天。
[0048] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法是