專利名稱：：用于診斷或治療bcl2相關(guān)癌癥的組合物和方法用于診斷或治療BCL2相關(guān)癌癥的組合物和方法發(fā)明者CarloM.Croce和GeorgeA.Calin政府資助本發(fā)明全部或部分由來自國家癌癥研究所的基金號P01CA76259、P01CA81534和P30CA56036資助。政府擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及癌癥的診斷特別是BCL2相關(guān)癌癥的診斷。本發(fā)明還包括用于治療與BCL2基因和/或基因產(chǎn)物的過度表達(dá)相關(guān)的癌癥的方法和組合物。本發(fā)明還提供了用于改進(jìn)抗癌療法例如化學(xué)療法和其他常規(guī)癌癥療法的新的方法和組合物。發(fā)明背景在一百多種不同的生物(包括果蠅、線蟲和人)中發(fā)現(xiàn)MicroRNA(miRNA,miR)。據(jù)認(rèn)為miRNA在這些生物中參與許多調(diào)節(jié)發(fā)育的過程。miRNA通常從60至70個(gè)核苷酸的折疊RNA前體結(jié)構(gòu)加工而來，所述前體從miRNA基因轉(zhuǎn)錄而來。RNA前體或加工的miRNA產(chǎn)物可容易被檢測到，并且這些分子的缺乏可表明相應(yīng)的miRNA基因的功能的缺失或丟失。癌癥是美國和全世界死亡率和發(fā)病率的重要來源。特別地，慢性淋巴細(xì)胞性白血病("CLL，，)和其他BCL2相關(guān)癌癥(例如，急性髓細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤(例如，濾泡性淋巴瘤、大細(xì)胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤)、癌(例如，腦癌、乳腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、腎癌、肝細(xì)胞癌和胃癌)、血液的惡性腫瘤、實(shí)體瘤、結(jié)腸直腸癌、EB病毒相關(guān)淋巴細(xì)胞增生性疾病)是成年人的臨床上重要的腫瘤性疾病(neoplasticdisease)。例如，CLL是西方國家中成年人白血病的最常見形式，在美國前列腺癌的年齡校正的發(fā)病率現(xiàn)在超過男性中所有其他癌癥的年齡校正的發(fā)病率，并且，排在肺癌之后，為該國男性癌癥死亡的第二大病因。在超過一半的報(bào)導(dǎo)的CLL病例中發(fā)生在13ql4上的半合子和/純合子丟失，其構(gòu)成了CLL中最常見的染色體異常。經(jīng)鑒定來自CLL患者的組織樣品的核型具有相對少量的染色體異常，這表明觀察到的13ql4上的缺失的特異性和頻率具有病理顯著性。此外，13ql4缺失也在60%的前列腺癌中發(fā)生，這表明位于13ql4的一種或更多種腫瘤抑制基因參與CLL和前列腺癌的發(fā)病機(jī)理。CLL和前列腺癌中13ql4缺失的克隆純合型和雜合型缺失的存在和非常高的頻率表明該區(qū)域中的缺失與某些癌癥類型的病因?qū)W相關(guān)。為了鑒定缺失區(qū)域中的基因，已對幾個(gè)組使用了定位克隆。迄今為止，已就DNA和/或RM水平上的改變在CLL的偶發(fā)性和家族性病例中鑒定和篩選了來自13ql4的刪除區(qū)域的總共8個(gè)基因ZeW(50W或臉70Ae"力、(釘7或、(CAR)、CLLD6、KPNA3、CLLD7、LOC51131(假定的鋅指蛋白NY~REN-34抗原)和a丄"《。然而，詳細(xì)的基因分析，包括詳盡的雜合子丟失(LOH)、突變和表達(dá)的研究，未能證明這些基因中任何基因在致癌作用中是固有涉及的。CLL的惡性的、大部分非分裂的B細(xì)胞過度表達(dá)Bcl2基因(Kitada，S.，等人，WoodW:3379-3389(1998)),在通過抑制細(xì)胞死亡而促進(jìn)真核細(xì)胞的存活中起著中心作用的凋亡抑制因子(Cory,S.，和Adams,J.M.，Wa"re2:647-656(2002))。Bcl2的過度表達(dá)與許多類型的人癌癥包括白血病、淋巴瘤和癌相關(guān)(Sanchez-Beato，M.,等人，WoodJ1220-1235(2003))。在濾泡性淋巴瘤中和部分彌漫性B細(xì)胞淋巴淋中，發(fā)現(xiàn)BCL2的活化機(jī)制是染色體易位t(14;18)(q32;q21)，該易位將BCL2基因置于免疫球蛋白重鏈增強(qiáng)子的控制之下，這導(dǎo)致該基因的表達(dá)脫離控制(Tsujimoto，Y.，等人，5We/ce房:1097-1099(1984);Tsujimoto，Y.，等人，&/e/7ce雄1440-1443(1985))。然而，BCL2基因在低于5%的CLL病例中與免疫球蛋白基因座緊靠(Adachi，M.，等人，/.J7丄559-564(1990))，BCL2在大部分CLL癌癥中的過度表達(dá)的機(jī)制仍然未知。目前對CLL的治療通常包括化學(xué)療法，單獨(dú)地或與自體骨髓移植一起施用的化學(xué)療法。使用的化學(xué)治療劑通常對于患者是有毒性的，通常在相對大部分的患者只導(dǎo)致部分緩解。用于BCL2相關(guān)癌癥的療法也可包括化學(xué)療法，通常在胂瘤的手術(shù)切除后進(jìn)行。然而，對于CLL，化學(xué)治療劑的治療特征(在進(jìn)行或不進(jìn)行手術(shù)的情況下)是有限的。單獨(dú)使用化療的治療是有限的，因?yàn)榘┘?xì)胞通常變得對廣i普的結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的化學(xué)治療劑具有抗性。該抗性，稱為"多抗藥性(multidrugresistance)"(MDR)，是治療癌癥患者中面臨的共同問題，肺瘤細(xì)胞對化療藥物的抗性代表了臨床腫瘤學(xué)中的主要問題。凋亡是事件順序的重要組成部分，在所述事件順序期間，化療藥物誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)，并且研究已表明Bcn在抗癌藥物誘導(dǎo)的凋亡中具有至關(guān)重要的作用(Kim，R等人，Cancer101(11):2491-2502(2004))。此外，經(jīng)工程改造過度表達(dá)Bcl2的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生對許多不同藥物的細(xì)胞毒性效應(yīng)的抗性(Kamesaki等人，CancerRes.53:4251-4256(1993);MiyashitaandReed，Woc^<$7:151-157(1993))。存在對用于CLL和其他BCL2相關(guān)癌癥的快速、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確的診斷的需要。也存在用于BCL2相關(guān)癌癥例如CLL的經(jīng)濟(jì)、有效的對患者沒有顯著負(fù)影響的療法的需要。還存在針對抑制Bcl2的表達(dá)的新的抗癌療法的需要，只要廣泛的普通癌癥與Bcl2蛋白的過度表達(dá)相關(guān)。此外，存在對相對于其他常規(guī)抗癌療法展示增加的功效的改進(jìn)的抗癌療法的需要。此外，存在對鑒定可增加癌細(xì)胞對抗癌劑的細(xì)胞毒性效應(yīng)的敏感性從而改進(jìn)癌癥療法的試劑和方法的需要。還存在對在過度表達(dá)抗凋亡蛋白例如Bcl2的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的方法的需要。發(fā)明概述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，某些具有與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的序列的microRNA在過度表達(dá)Bcl2蛋白的癌細(xì)胞中擺脫了控制。因此，本發(fā)明提供了在需要該治療的受試者中預(yù)防癌癥或治療與BCL2基因或基因產(chǎn)物(例如，RM、蛋白質(zhì))過度表達(dá)相關(guān)的癌癥的方法，其包括施用有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物。如此處所用的，術(shù)語"BCL2"是指BCL2核酸(例如，BCL2基因、cDNA、RNA轉(zhuǎn)錄物、DNA構(gòu)建體)，而"Bcl2"是指Bcl2蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在特定的實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在特定的實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物包含與SEQIDNO:55的核苷酸3741至3749互補(bǔ)的核苷酸序列。此類miR基因產(chǎn)物的實(shí)例包括但不限于miR15、miR16、miR-15b和miR-16-2。miR15和miR16基因位于13ql4，通常分別稱為mir-15a和miR-16-l。如此處所用的，術(shù)語"miR15"和"miR-15a"可互換使用，對于術(shù)語"miR16"和"miR-16-1"亦如此。在其他實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195和其組合。在特定的實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。本發(fā)明還提供了用于治療患有與Bcl2過度表達(dá)相關(guān)的癌癥的受試者的藥物組合物，其包含至少一種化學(xué)治療劑和至少一種miR基因產(chǎn)物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-16-l。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR—96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、iniR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195和其組合。在特定的實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。本發(fā)明還包括確定在具有BCL2相關(guān)癌癥的受試者中癌癥療法的功效的方法，其包括對受試者施用至少一種藥物，然后測量包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的miR基因產(chǎn)物的表達(dá)。在特定的實(shí)施方案中，在施用試劑后，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的增加表明成功的治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-16-l。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR—30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16—2、miR-195和其組合。在特定的實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-lSa或miR-16-l。本發(fā)明還提供了用于增加抗癌療法(例如，化學(xué)療法、放射療法)的功效的方法，其包括與至少一種抗癌療法一起對腫瘤細(xì)胞提供至少一種ffliR基因產(chǎn)物。在特定的實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在其他實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a或miR-16-l。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、niiR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195和其組13合。在某些實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。本發(fā)明還提供了增加癌細(xì)胞對抗癌劑的細(xì)胞毒性的敏感性的方法，其包括對癌細(xì)胞提供至少一種miR基因產(chǎn)物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a或miR-16-l。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、ffliR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195和其組合。在某些實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。在特定的實(shí)施方案中，抗癌劑是化療劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗癌劑是輻照處理。本發(fā)明還包括誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡的方法，其包括將細(xì)胞與至少一種包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的miR基因產(chǎn)物接觸。在特定的實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物包含與SEQIDNO:55的核苷酸3741-3749互補(bǔ)的核苷酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a或miR-16-l。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物選自ffliR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195和其組合。在某些實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。用于這些方法的合適的細(xì)胞包括，但不限于，表達(dá)Bc12蛋白的癌細(xì)胞和其他細(xì)胞。本發(fā)明還提供了在受試者中診斷BCL2相關(guān)癌癥的方法，其包括確定相對于對照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平，來自受試者的樣品中的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在特定的實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物包含與SEQIDNO:55的核苷酸3741-3749互補(bǔ)的核苦酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a或miR-16-l。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195和其組合。在某些實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。附圖概述本專利或申請文件包含至少一份彩色繪制的附圖。在要求和支付必要的費(fèi)用后由辦公室提供具有彩色附圖的本申請或?qū)＠暾埑霭嫖锏目截悺D1A和1B分別是預(yù)測的miR15和miR16前體RM的二級結(jié)構(gòu)的圖示。使用Matthews,等人，/.#0人^'o/.里911-940(1999)的"fflfold"程序(版本3.1)進(jìn)行RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，并進(jìn)行手工加工以在螺旋片段中容納G/U擺動(dòng)堿基配對。經(jīng)過加工的miR15和miR16miRNA的序列以下劃線標(biāo)示。改編自Lagos-Quintana，等人，Sc/e/7ce■:853-858(2001)。圖2A是CLL中13ql4腫瘤抑制基因基因座內(nèi)的基因圖，該基因圖顯示miR15/16基因簇的定位。在圖中顯示了遺傳標(biāo)記的位置和基因的位置。圖2B是由水平條紋框標(biāo)記的之前報(bào)導(dǎo)的13ql4缺失。圖2C是"U57JM和""5772標(biāo)記之間的基因座的圖。基因名稱下面的箭頭標(biāo)示該基因座中各基因的方向，垂直條塊標(biāo)示與各基因相應(yīng)的相應(yīng)的外顯子的位置。圖2D是Alu18和A^S272標(biāo)記之間的基因座的圖。條塊和框標(biāo)示/^m/un和的外顯子的位置。短的垂直箭頭標(biāo)示加xj和射x^基因的位置。圓圏標(biāo)示用于篩選來源于兩個(gè)獨(dú)立的白血病病例(CLL-A和CLL-B)的融合的體細(xì)胞雜交克隆的PCR引物的位置。加陰影線的框代表存在于雜種中的染色體13的位置。"《~31.4kb+"表示克隆CLL-A中大約31.4kb的缺失區(qū)域，其來源于具有CLL(具有t(2;13)(ql2;ql3)易位)、雙側(cè)性視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(bilateralretinoblastoma)和潰瘍性結(jié)腸炎的患者。長垂直箭頭表示具有t(2;13)(q32;ql4)易位的克隆CLL-B中的斷裂點(diǎn)，29kb+"表示來自該CLL克隆的大約29kb的缺失區(qū)域。圖3A是正常人腎、前列腺、肝、胰腺癌、骨骼肌("Sk肌")、睪丸、CD5+B細(xì)胞(CD5+)、白血病細(xì)胞("PerBlLeuk")和骨髄("BM")中的/Z72XJ和邁2xf基因表達(dá)的Northern印跡分析。圖3B是18個(gè)CLL患者中微衛(wèi)星標(biāo)記Z^JS272和"7J^^7J的雜合子("L0H")丟失分析。來自正常人CD5+細(xì)胞的DM用作對照。樣品的LOH狀態(tài)表示為"+/+"、"+/-"、"-/-"、"NI"(未提供資料)、""(無足夠的材料)和"ND，，(未進(jìn)行)。溴化乙錠染色的Northern印跡凝膠用作標(biāo)準(zhǔn)化的對照。圖4A描述了人miRNA(邊2^-JJa(Hsa一miR-15;SEQIDNO:58)或邁U"(Hsa—miR-16;SEQIDNO:59))和人BCL2cDNA(Hsa一BCL2;SEQIDNO:57))以及小鼠miRNA(邁M-"a(Mmu—miR-15;SEQIDNO:61)或邊L-M-;(Mmu-miR-16;SEQIDNO:62))與小鼠BCL2cDNA(Mmu—BCL2;SEQIDNO:60)之間的miR::mRNA互補(bǔ)區(qū)(紅色核苷酸)。標(biāo)示兩種不同的3'UTR突變型構(gòu)建體3'Ml(其缺少負(fù)責(zé)miRNA::mRNA相互作用的所有9個(gè)bp)和3'M2(其缺少互補(bǔ)區(qū)域中的前5個(gè)bp)的miR-15a和miR-16-l中的被靶向的缺失的位點(diǎn)。圖4B是描述5種不同的CLL樣品(CLL)的每一種中以及來自正?；颊叩腃D5陽性B淋巴細(xì)胞的混合樣品(CD5混合物)中的Bcl2蛋白的水平的Western印跡。Jurkat細(xì)胞(T細(xì)胞白血病細(xì)胞系)用作Bcl2蛋白表達(dá)的對照。(3-肌動(dòng)蛋白(肌動(dòng)蛋白)的水平用于標(biāo)準(zhǔn)化。如通過微陣列信號強(qiáng)度所確定的，各樣品中的miR-16-l和miR-15amicroRNA的相對表達(dá)在下面相應(yīng)的泳道中示于印跡下面。圖5A是描述未轉(zhuǎn)染的MEG-Ol細(xì)胞(MEG-01WT)以及用空栽體(MEG-01-pRS-neo-GFP)轉(zhuǎn)染的MEG-01細(xì)胞、用包含mir-15a/miR-16-1基因簇的載體(MEG-01-pRS-15a/16-lWT)轉(zhuǎn)染的MEG-01細(xì)胞或用載體(所述載體包含在miR-16a前體的3'區(qū)域具有+7(C至T)置換的mir-15a/miR-16-l基因蔟)(MEG-01-pRS-15a/16-lMUT)轉(zhuǎn)染的MEG-01細(xì)胞中，Bcl2蛋白水平以及不同凋亡活性劑(例如，APAF1、Pro-C9、C9、PARP和經(jīng)切割的PARP)的全長和切割的形式水平的Western印跡。以一式兩份的重復(fù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)數(shù)據(jù)。pRS-15a/16-lWT轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示APAF1(凋亡蛋白酶活化因子l、細(xì)胞色素C相互作用因子(interactor))、pro-半胱天東酶9(內(nèi)源性凋亡途徑)和多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP，不同的凋亡途徑的終效應(yīng)物)的斷裂。肌動(dòng)蛋白用作上樣對照。圖5B是描述用miR-15a和/或miR-16-l有義(miR-15a,邁iR16-l)或miR-15a和/或miR-16-l反義(miR-15a—AS、miR16-l-AS)RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染的MEG-01細(xì)胞中的Bcl2蛋白質(zhì)水平的Western印跡(WB)。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用作對照(MEG-01-WT)。使用P肌動(dòng)蛋白(肌動(dòng)蛋白)的水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。進(jìn)行Northern印跡(NB)分析以估量miR-lS有義和miR-:^有義寡核苷酸的轉(zhuǎn)染功效。RT-PCR產(chǎn)物代表了相同細(xì)胞中BCL2轉(zhuǎn)錄物的mRNA水平，將該水平針對P肌動(dòng)蛋白(肌動(dòng)蛋白)mRNA的水平(RT-PCR)標(biāo)準(zhǔn)化。圖6A是描述在用邁/i-7J-a和/或邁/i-76-J有義RNA寡核苷酸(分別為miR15aS和miR-16-lS)或歷/-W-a和/或邁"-7^^反義RNA寡核苷酸(分別為miR15aA和miR-16-lA)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，相對腎熒光素酶轉(zhuǎn)染對照標(biāo)準(zhǔn)化的熒火蟲熒光素酶的表達(dá)的相對抑制(抑制倍數(shù))的條形圖。用空對照載體(pGL-3-Cont)或頂/i-"-a和/或忍"-W-J有義或反義RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以一式三份重復(fù)(n-6)進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)2次。圖6B是描述相對腎熒光素酶轉(zhuǎn)染對照標(biāo)準(zhǔn)化的熒火蟲焚光素酶的表達(dá)的相對抑制的條形圖。用空對照載體(pGL-3-Cont)、邊/A-U-a和巡/W-J^^有義RNA寡核苷酸(pSR-15a/16-lS+3'UTR)或邊/A-U-a和歷/i-76-7反義RNA寡核普酸(pSR-15a/16-lA+3'UTR)RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞。3'UTR表示融合至野生型BCL23'UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因。也轉(zhuǎn)染兩種不同的3'UTR突變體，一種缺乏邊2V-a-a和/z^-^^-J中的互補(bǔ)性miRNA::mRNA區(qū)域的所有9個(gè)bp(pSR-15a/16-lS+3'M1)，另一個(gè)缺乏相同互補(bǔ)區(qū)域中的前5個(gè)bp(pSR-15a/16-lS+3'M2)。以一式三份重復(fù)(n=6)進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)2次。根據(jù)下列本發(fā)明的實(shí)施方案的更具體描述，本發(fā)明的前述目的和其他目的、特征和有利方面將很顯然。發(fā)明詳述本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的描述如下。當(dāng)通過參考其優(yōu)選實(shí)施方案，明確地顯示和描述本發(fā)明時(shí)，本領(lǐng)所附權(quán)利要求包含的本發(fā)明的范圍。如此處可互換使用的，"miR基因產(chǎn)物"、"microRNA"、"miR"或"miRNA，，是指來自邊/及基因的未加工的或加工的RNA轉(zhuǎn)錄物。因?yàn)閙iR基因產(chǎn)物不翻譯成蛋白質(zhì)，術(shù)語"miR基因產(chǎn)物"不包括蛋白質(zhì)。未加工的miR基因轉(zhuǎn)錄物也稱為"miR前體"，通常包含長度大約為70-100個(gè)核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物?？赏ㄟ^RNA酶(例如Dicer、Argonaut、RNAseIII(例如，大腸桿菌RNA酶III))降解將miR前體加工成活性19-25個(gè)核苷酸的RNA分子。該活性19-25個(gè)核苷酸的RNA分子也稱為"加工的"miR基因轉(zhuǎn)錄物或"成熟的"miRNA。可通過天然加工途徑(例如使用完整的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物)或通過合成加工途徑(例如，使用分離的加工酶，例如分離的Dicer、Argonaut或RNA酶III)從miR前體獲得活性19-25個(gè)核苷酸的RNA分子。應(yīng)理解為還可通過生物或化學(xué)合成產(chǎn)生活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子而不必從miR前體加工。表l中提供了大量miR基因產(chǎn)物的序列。所有核苷酸序列此處以5，至3，的方向給出。表l-人miR基因產(chǎn)物的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>名稱前體序列(5'至3')'SEQIDNO:TGCTTCCCGAGGCCACATGCTTCTTTATATCCCCATATGGATTACTTTGCTATGGAATGTAAGGAAGTGTGTGGTTTCGGCAAGTG285AGGCCACATGCTTCTTTATATCCCCATATGGATTACTTTGCTATGGAATGTAAGGAAGTGTGTGGTTTT286TGACGGGCGAGCTTTTGGCCCGGGTTATACCTGATGCTCACGTATAAGACGAGCAAAAAGCTTGTTGG丁CA287ACCCGGCAGTGCCTCCAGGCGCAGGGCAGCCCCTGCCCACCGCACACTGCGCTGCCCCAGACCCACTGTGCGTGTGACAGCGGCTGATCTGTGCCTGGGCAGCGCGACCC288TCACCTGGCCATGTGACTTGTGGGCTTCCCTTTGTCATCCTTCGCCTAGGGCTCTGAGCAGGGCAGGGACAGCAAAGGGGTGCTCAGTTGTCACTTCCCACAGCACGGAG289CGGGGCACCCCGCCCGGACAGCGCGCCGGCACCTTGGCTCTAGACTGCTTACTGCCCGGGCCGCCCTCAG1MCAGTCTCCAGTCACGGCCACCGACGGCTGGCCCCGCC290CCTGTGCAGAGATTATTTTTTAAAAGGTCACAATCMCATTCATTGCTGTCGGTGGGTTGAACTGTGTGGACAA291GCTCACTGAACAATGAATGCAACTGTGGCCCCGCTTGAGTTTTGAGGTTGCTTCAGTGAACATTCAACGCTGTCGGTGAGTTTGGAATTAAAATCAAAACCATCGACCGTTGATTGTACCCTATGGCTAACCATCATCTACTCC292GGCCTGGCTGGACAGAGTTGTCATGTGTCTGCCTGTCTACACTTGCTGTGCAGAACATCCGCTCACCTGTACAGCAGGCACAGACAGGCAGTCACATGACAACCCAGCCT293ATCATTCAGAAATGGTATACAGGAAAATGACCTATGAATTGACAGACAATATAGCTGAGTTTGTCTGTCATTTCTTTAGGCCAATATTCTGTATGACTGTGCTACTTCAA294GATGGCTGTGAGTTGGCTTAATCTCAGCTGGCAACTG2951SAGATGTTCATACAATCCCTCACAGTGGTCTCTGGGATTATGCTAAACAGAGCAATTTCCTAGCCCTCACGA/m'r-2i7-/7recAGTATAATTATTACATAGTTTTTGATGTCGCAGATACTGCATCAGGAACTGATTGGATAAGAATCAGTCACCAT296CAGTTCCTAATGCATTGCCTTCAGCATCTAAACAAGGTGATAATGTAGCGAGATTTTCTGTTGTGCTTGATCTAACCATGTGGTTGCGAGGTATGAGTAAAACATGGTTCCGTCAAGCACCATGGAACGTCACGCAGCTTTCTACA297GACCAGTCGCTGCGGGGCTTTCCTTTGTGCTTGATCTAACCATGTGGTGGAACGATGGAAACGGAACATGGTTCTGTCAAGCACCGCGGAAAGCACCGTGCTCTCCTGCA298<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>前體序列內(nèi)下劃線標(biāo)示的序列表示經(jīng)加工的miR轉(zhuǎn)錄物(成熟的microRNA)。所有序列是人的序列。診斷和預(yù)后方法根據(jù)本發(fā)明，可通過檢測相對于對照樣品，樣品中的miR基因產(chǎn)物的量的減少、miR基因拷貝數(shù)的減少或通過檢測一個(gè)或更多個(gè)拷貝的miR基因的突變來診斷或預(yù)示BCL2相關(guān)癌癥，其中miR基因包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物(例如，如此處所描述的)中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的miR基因的miR基因拷貝數(shù)目從二倍體至單倍體或至無拷貝的減少診斷或預(yù)示BCL2相關(guān)癌癥。同樣，包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的miR基因的一個(gè)或兩個(gè)拷貝的突變意味著基因功能的丟失，且是BCL2相關(guān)癌癥的診斷或預(yù)示。如此處所用的，"CLL細(xì)胞，，可以是來自具有或懷疑具有CLL的受試者的淋巴細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞具有至少為4的"CLL評分"，如根據(jù)Matutes等人，Zewire/H/a《(7^:1640-1645(1994)(其全部分公開內(nèi)容在此引用作為參考)的評分系統(tǒng)所確定的。如此處所用的，"前列腺癌細(xì)胞"可以是前列腺來源的贅生性細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，無論其是否位于前列腺。其他BCL2相關(guān)癌細(xì)胞對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并且在此進(jìn)行了描述。miR15和miR16基因的核酸序列包含在克隆317g11內(nèi)，在GenBank目錄號AC069475中給出了其核苷酸序列。GenBank目錄號AC069475的全部公開內(nèi)容在此引用作為參考。這樣檢測包含與BCL2基因產(chǎn)物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的miR基因的缺失或突變，即通過確定來自懷疑具有BCL2相關(guān)癌癥(例如，CLL、急性髓細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤、濾泡性淋巴瘤、大細(xì)胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、血液的惡性腫瘤、實(shí)體瘤、結(jié)腸直腸癌、腦癌、乳腺癌、前列腺癌、EB病毒相關(guān)淋巴細(xì)胞增生性疾病、腎癌、肝細(xì)胞癌和胃癌)的受試者的組織中的基因的結(jié)構(gòu)或序列，然后將其與來自受試者的未受影響的組織的樣品中或來自正常對照的組織的樣品中的這些基因的結(jié)構(gòu)或序列進(jìn)行比較來進(jìn)行檢測?？墒褂萌魏魏线m的技術(shù)(例如，此處描述的技術(shù))進(jìn)行該比較。在一個(gè)實(shí)施方案中，為診斷BCL2相關(guān)癌癥，組織樣品來源于受試者。然后制備樣品以確定miR基因產(chǎn)物的表達(dá)或一個(gè)或更多個(gè)miR基因的缺失或突變。合適的組織樣品包括但不限于目標(biāo)活檢組織以及血液和/或液體樣品o如此處所用的，"BCL2相關(guān)癌癥"是與BCL2基因或基因產(chǎn)物的過度表達(dá)相關(guān)的癌癥，其可以是表征為相對于合適的對照細(xì)胞表達(dá)更高水平的一種或多種BCL2基因產(chǎn)物的細(xì)胞的任何癌癥。根據(jù)本發(fā)明的方法，合適的對照細(xì)胞可以是來自未受過度表達(dá)Bcl2的癌癥影響的個(gè)體，或它們可以是來自危難中的受試者的非癌細(xì)胞，或其可以是來自受過度表達(dá)Bcl2的癌癥的影響的另一個(gè)個(gè)體的非癌細(xì)胞?？墒褂胢iR基因的探針(例如，如此處描述的)通過來自受試者的基因組DM的Southern印跡雜交來檢測miR基因缺失或突變的存在。例如，可使用常規(guī)活組織檢查技術(shù)從懷疑具有BCL2相關(guān)癌癥的受試者取出組織樣品。可選擇地，可從懷疑具有BCL2相關(guān)癌癥的受試者取出血液樣品，然后分離白細(xì)胞以進(jìn)行DNA提取?？稍陂_始放射療法或化學(xué)療法之前從患者獲取血液或組織樣品?？蓮氖茉囌叩奈词苡绊懙慕M織或從正常人個(gè)體獲得用作對照的相應(yīng)的組織或血液樣品。Southern印跡雜交技術(shù)在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。例如，可用限制性內(nèi)切酶降解從來自懷疑具有BCL2相關(guān)癌癥的受試者的組織或液體(例如，血液)分離的基因組DNA。該降解產(chǎn)生可通過電泳在例如瓊脂糖凝膠上分離的基因組DNA的限制性片段。然后將限制性片段轉(zhuǎn)印至雜交膜(例如，硝酸纖維素膜、尼龍膜)上，然后用對于一種或更多種miR基因(例如，包含與BCL2基因的轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的miR基因)是特異性的探針進(jìn)行雜交。與對照DNA樣品(所述對照DNA樣品接受與來自受試者的DNA樣品完全相同的處理)相比，雜交膜上的限制性片段模式的改變表明一個(gè)或更多個(gè)基因的缺失或突變?？捎杀绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定用于檢測miR基因拷貝數(shù)目或miR基因內(nèi)的突變的探針標(biāo)記和雜交的條件。如此處所用的術(shù)語"缺失，，是指基因的部分缺失或整個(gè)基因的缺失。例如，可基于miR-15a和miR-16-lmicroRNA的^^開的序列i殳計(jì)用于Southern印跡雜交的miR-15a和miR-16-l核酸探針，如在Lagos-Quintana等人,5We/zce，853-858(2001)中所描述，其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考。miR-15amicroRNA的核苷酸序列是uagcagcacauaaugguuugug(SEQIDNO:3)。miR-16-lmicroRNA的核苷酸序歹'J是uagcagcacg醒a(bǔ)畫uggcg(SEQIDNO:4)。用于檢測miR-15a和miR-16-lDM的合適的探針分別是CACAAACCATTATGTGCTTGCTA(SEQIDNO:5)GCCAATATTTACGTGCTGCTA(SEQIDNO:6)SEQIDN0:5和SEQIDNO:6的互補(bǔ)序列還可用于探測miR-15a和miR-16-1DNA。可由本領(lǐng)域4支術(shù)人員容易地確定用于檢測miR-15a、miR-16-1或其他miR基因(例如，包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的miR基因)的其他合適的探針。在MolecularCloning:ALaboratoryManual,J.Sambrook等人，eds.，笫2版ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989，第IO和11章(其公開內(nèi)容在此引用作為參考)中描述了用于制備標(biāo)記的DNA和RNA探針的方法和其雜交的條件。例如，可用放射性核素例如311、32P、"P、"C或"S;重金屬；或能夠用作標(biāo)記的配體的特異性結(jié)合對成員的配體(例如，生物素、抗生物素蛋白或抗體)、熒光分子、化學(xué)發(fā)光分子和酶等來標(biāo)記核酸探針。可通過Rigby等人，/.A/o/.237-251(1977)的缺口平移法或Fienberg等人，j/a/.A/oc力e邁.7^:6-13(1983)的隨機(jī)引物法將探針標(biāo)記至高比放射性，所述兩篇文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容在此引用作為參考。后者是選擇用于從單鏈DNA或從RNA模板合成高比放射性的"P標(biāo)記的探針的方法。例如，按照缺口平移法用高放射性核苷酸取代預(yù)先存在的核苷酸，可能制備具有超過108cpm/微克的比放射性的32p標(biāo)記的核酸探針。然后通過將雜交濾膜(hybridizedfilter)暴露于照相膠片進(jìn)行雜交的放射自顯影檢測。通過雜交濾膜暴光的照片膠片的光密度掃描提供了miR15或miR16基因拷貝數(shù)目的精確測量?？蛇x擇地，可用計(jì)算才幾化的成{象系統(tǒng)例如可從AmershamBiosciences，Piscataway，NJ商購獲得的MolecularDynamics400-B2DPhosphorimager定量miR15或miR16基因拷貝數(shù)。當(dāng)不能進(jìn)行DNA或RNA探針的放射性核素標(biāo)記時(shí)，可使用隨機(jī)引物法將核苷酸類似物(例如，dTTP類似物、5-(N-(N-生物素基-e-氨己酰基)-3-氨丙?；?脫氧尿苷三磷酸)整合入探針分子?？赏ㄟ^與偶聯(lián)至熒光染料或產(chǎn)生顏色反應(yīng)的酶的、生物素結(jié)合蛋白例如抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素或抗生物素抗體反應(yīng)來檢測生物素化探針寡核苷酸。還可通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增這些基因的片段，然后通過測序或通過電泳分析擴(kuò)增的片段以確定來自受試者的DNA樣品的擴(kuò)增的片段的序列和/或長度是否與對照DNA樣品的擴(kuò)增片段不同來檢測miR基因的缺失或突變?？捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定用于DNA片段的PCR擴(kuò)增的合適的反應(yīng)和循環(huán)條件。在下列的實(shí)施例中描述的方法中提供了示例性PCR反應(yīng)和循環(huán)條件?？赏ㄟ^檢測miR基因(例如，包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的miR基因)的缺失來進(jìn)行BCL2相關(guān)癌癥的診斷。例如，不同染色體標(biāo)記例如圖2A-2D中標(biāo)示的標(biāo)記之間的miR的缺失。例如，包含邁iR-15a和miR-16-l的微衛(wèi)星(小隨體)標(biāo)記D13S272和D13S273之間的13ql4區(qū)域中的缺失可表明存在BCL2相關(guān)癌癥。此外，當(dāng)13ql4中的缺失在其中缺失miR15或miR16的^:衛(wèi)星標(biāo)記D13S1150和D13S272之間或在基因座Alul8和微衛(wèi)星標(biāo)記D13S272之間時(shí)，可表明存在BCL2相關(guān)癌癥。確定組織樣品中每雙倍體基因組的包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的miR基因(例如，miR-15a或miR-16-l基因)的拷貝數(shù)的可選擇的方法依賴于這樣的事實(shí)，即miR-15a/miR-16-l基因簇位于13ql4，并且與標(biāo)記Z"W〃和/"577J連接。在與/U^^72和"7J^7J標(biāo)記連接的基因座上為雜合的個(gè)體中的miR-15a或miR-16-l的拷貝的丟失可從這些基因的雜合性丟失推斷出來。用于確定染色體標(biāo)記的雜合性丟失的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。下面的實(shí)施例3中描述了示例性雜交性丟失研咒。用于研究懷疑具有BCL2相關(guān)癌癥的受試者中一個(gè)或更多個(gè)miR基因是否突變的另一個(gè)技術(shù)是例如0rita，等人，Ce/20邊/"J:874-879(1989)和Hayashi，TO^"層"/7"""c.134_38(1991)中描述的單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singlestrandconformationalpolymorphism)(SSCP),所述參考文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容在此引用作為參考。SSCP技術(shù)由通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因(例如，miR基因)的片段；使片段變性并在非變性條件下對兩個(gè)變性的單鏈進(jìn)行電泳組成。單鏈呈現(xiàn)影響鏈電泳遷移率的復(fù)雜序列依賴性鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)。一種或更多種miR基因的缺失或突變也可使這些miR基因的表達(dá)減少。因此，也可通過檢測從一種或更多種miR基因(例如，包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的miR基因)產(chǎn)生的RNA的表達(dá)水平來診斷BCL2相關(guān)癌癥，其中miR基因表達(dá)的減少是BCL2相關(guān)癌癥的診斷。轉(zhuǎn)錄miR基因以產(chǎn)生形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的前體RM。前體RNA不翻譯成蛋白質(zhì)，但加工成被認(rèn)為是功能基因產(chǎn)物的"microRNA，，或"miRNA"。如此處所用的，"miR基因產(chǎn)物"意指來自ffliR基因的加工的或未加工的RNA轉(zhuǎn)錄物，如下面更詳細(xì)描述的。術(shù)語"RNA"、"RNA轉(zhuǎn)錄物"和"基因產(chǎn)物"此處在miR基因表達(dá)的上下文中可互換使用。例如，在Lagos-Quintana，等人，，，853-858(2001)中描述miR-15a和miR-16-l前體RNA。miR-15a和miR-16-1前體RM的序列表示為SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。預(yù)測的SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)分別示于圖1A和IB中。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage41</formula>不希望受限于任何理論，據(jù)認(rèn)為miR-15a和miR16-1前體RM從miR-15a/miR-16-l基因簇共表達(dá)，并且由Dicer/Argonaute復(fù)合物加工成功能性miRNA產(chǎn)物。參見，例如，Lee等人，Sc/e/Jce862(2001)。來自這些基因的兩種功能性miRNA產(chǎn)物是長度為22個(gè)核苷酸的單鏈RNA分子，其具有5'末端單磷酸和3'末端羥基。加工的miR-15amicroRNA的核脊酸序歹'j是uagcagcacauaaugguuugug(SEQIDN0:3)。力口工的miR-16-lmicroRNA的核普酸序歹'j是uagcagcacguaaauauuggcg(SEQIDNO:4)。在本發(fā)明的實(shí)踐中，可檢測從miR-15a或miR-16-l基因產(chǎn)生的60-70nt的RNA前體分子?？蛇x擇地，可檢測通過Dicer和Argonaute蛋白加工前體RNA產(chǎn)生的更短的miR-15a和miR-16-1microRNA基因產(chǎn)物。用于確定RNA表達(dá)水平的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平之內(nèi)。例如，如此處所述從懷疑具有BCL2相關(guān)癌癥的受試者獲得組織或血液樣品。作為對照，如此處所描述的，可從受試者的未受影響的組織或從正常人個(gè)體獲得相應(yīng)的組織或血液樣品。然后隨同來自受試者的樣品一起處理對照組織或血液樣。然后可將受試者中的miR基因(例如，包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的miR基因)表達(dá)的水平與來自受試者的未受影響的組織的miR基因的表達(dá)水平比較，或與來自正常對照的組織或血液中的miR表達(dá)水平比較。例如，常規(guī)地就一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)確定BCL2相關(guān)癌癥細(xì)胞中的相對miR表達(dá)水平。所述標(biāo)準(zhǔn)可包括，例如，一方面零表達(dá)水平和另一方面相同患者的正常組織中的基因的表達(dá)水平或正常對照組的組織中的表達(dá)水平。標(biāo)準(zhǔn)也可包括標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中的raiR表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，與正常表達(dá)水平相比，miR表達(dá)減少的強(qiáng)度表示治療后將來的臨床結(jié)果。可選擇地，可將懷疑具有BCL2相關(guān)癌癥的受試者中的miR基因表達(dá)(例如，包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中核普酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的iniR基因)的水平與之前獲得的正常人對照群體的miR基因表達(dá)的平均水平比較。用于確定細(xì)胞中特定基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的水平的合適技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。根據(jù)一個(gè)這樣的方法，可通過在核酸提取緩沖液存在的情況下勻漿，然后離心來從細(xì)胞純化總RNA。沉淀核酸，然后用DNA酶處理和沉淀來除去DNA。然后按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在瓊脂糖凝膠上通過凝膠電泳分離RNA分子，然后使用例如所謂的"Northern"印跡技術(shù)將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜。然后通過加熱將RNA固定在濾膜上。使用合適的與所述RNA互補(bǔ)的標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行特定RM的檢測和定量。參見，例如，MolecularCloning:ALaboratoryManual,J.Sambrook等人，eds.，第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989，第7章，其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考。用于miR-15a或miR-16-1RNA的Northern印跡雜交的合適的探針包括，例如，SEQIDN0:5和SEQIDNO:6?？赏ㄟ^將雜交濾膜暴露于照相膠片來進(jìn)行探針對miRRM的雜交的放射自顯影檢測。接受雜交濾膜暴光的照相膠片的光密度掃描提供了RNA轉(zhuǎn)錄物水平的精確測量?？蛇x擇地，可^f吏用例如可從AmershamBiosciences,Piscataway，NJ商購獲得的MolecularDynamics400-B2DPhosphorimager通過雜交印跡的計(jì)算才幾化成l象來定量RM轉(zhuǎn)錄物的水平。除了Northern和其他RNA印跡雜交4支術(shù)外，可按照原位雜交的技術(shù)進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄水平的定量。該技術(shù)需要比Northern印跡技術(shù)更少的細(xì)胞，其包括將整個(gè)細(xì)胞沉積在顯微鏡蓋玻片上，然后用含有放射性標(biāo)記或其他標(biāo)記的寡核普酸(例如，cDNA或cRM)探針的溶液探測細(xì)胞的核酸含量。該技術(shù)特別適合分析來自懷疑具有BCL2相關(guān)癌癥(例如，CLL、前列腺癌)的受試者的組織活檢樣品。在美國專利號5，427，916(其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考)中更詳細(xì)地描述了原位雜交技術(shù)的實(shí)施。用于miR-15a或miR-16-1RNA的原位雜交的合適的探針包括例如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。還可通過miR轉(zhuǎn)錄物的反轉(zhuǎn)錄，然后在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)中進(jìn)行擴(kuò)增來確定特定miR轉(zhuǎn)錄物的相對數(shù)目?？赏ㄟ^與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)例如來自存在于相同樣品中的"管家，，基因的raRM的水平比較來確定miR轉(zhuǎn)錄物的水平。用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的合適的"管家"基因包括，例如，肌球蛋白和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)。用于定量RT-PCR和其變化形式的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。用于測量miR基因轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)的其他方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說也是已知的，包括用于測量RNA轉(zhuǎn)錄和降解率的各種方法。浴#法可通過對BCL2相關(guān)癌細(xì)胞單獨(dú)地或聯(lián)合施用一種或更多種miR基因(例如，包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的miR基因)的分離的基因產(chǎn)物來治療BCL2相關(guān)癌癥。不希望受限于任何理論，據(jù)認(rèn)為miR基因產(chǎn)物抑制此類癌細(xì)胞的贅生性或致瘤性生長。特別地，可通過對癌細(xì)胞單獨(dú)地或聯(lián)合施用一種或更多種miR基因的分離的基因產(chǎn)物來治療BCL2相關(guān)癌癥。如此處所用的，"BCL2相關(guān)癌細(xì)胞"是可從遭受BCL2相關(guān)癌癥的受試者分離的腫瘤細(xì)胞或贅生性細(xì)胞?？赏ㄟ^檢測相對于正常對照細(xì)胞，細(xì)胞中的BCL2基因產(chǎn)物的表達(dá)水平的增加或通過檢測細(xì)胞中的癌性或贅生性表型來鑒定BCL2相關(guān)癌細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地鑒定具有癌性或贅生性表型的細(xì)胞。例如，此類細(xì)胞在培養(yǎng)中對接觸誘導(dǎo)的生長抑制不敏感，當(dāng)長期培養(yǎng)時(shí)可形成病灶集中點(diǎn)(foci)。癌細(xì)胞或贅生性細(xì)胞還展示獨(dú)特的形態(tài)學(xué)變化，集落生長的無組織模式和非停泊性生長(anchorage—independentgrowth)的獲得。癌細(xì)胞或贅生性細(xì)胞還具有在易感動(dòng)物中形成侵襲性腫瘤的能力，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)的技術(shù)將細(xì)胞注射入例如無胸腺小鼠來估量該能力。如此處所用的，"分離的"基因產(chǎn)物是通過人工千預(yù)從天然狀態(tài)改變或取出的基因產(chǎn)物。例如，天然地存在于活的動(dòng)物中的RNA不是"分離的，，。合成的RNA或者部分或完全從其天然狀態(tài)的共存在的材料分離的RNA是"分離的，，。分離的RM可大體上以純化的形式存在，或可存在于已將該RM遞送入其中的細(xì)胞中。因此，有意遞送至細(xì)胞或在細(xì)胞(例如，BCL2相關(guān)癌癥細(xì)胞)中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物被認(rèn)為是"分離的"基因產(chǎn)物?？墒褂迷S多標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)荻得miR基因產(chǎn)物。例如，可使用本領(lǐng)域已知的方法化學(xué)合成或重組產(chǎn)生基因產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用合適地保護(hù)的核糖核苷亞磷酰胺和常規(guī)的DNA/RM合成儀化學(xué)合成RNA產(chǎn)物。合成的RNA分子或合成試劑的商業(yè)提供商包括例如Pro1igo(Hamburg,Germany)、DharmaconResearch(Lafayette,CO,USA)、PierceChemical(partofPerbioScience,Rockford，IL，USA)、GlenResearch(Sterling,VA，USA)、ChemGenes(Ashland,MA，USA)和Cruachem(Glasgow,UK)。可選擇地，可使用任何合適的啟動(dòng)子從重組的環(huán)狀或線狀DNA質(zhì)粒表達(dá)一種或更多種miR基因產(chǎn)物。用于從質(zhì)粒表達(dá)RM的合適的啟動(dòng)子包括U6或HIRMpolIII啟動(dòng)子序列或細(xì)胞巨化病毒(CMV)啟動(dòng)子。其他合適的啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。此類重組質(zhì)粒還可包含用于在細(xì)胞(例如，BCL2相關(guān)癌細(xì)胞(例如，CLL細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、其他癌細(xì)胞))中表達(dá)一種或更多種miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型或調(diào)控型啟動(dòng)子。可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分離從重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物。還可將從重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物遞送至和直接在癌細(xì)胞(例如，BCL2相關(guān)癌細(xì)胞(例如，CLL細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、其他癌細(xì)胞))中表達(dá)。在下面更詳細(xì)地討論重組質(zhì)粒用于將miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞的用途?？蓮姆珠_的重組質(zhì)粒表達(dá)多種miR基因產(chǎn)物，或可從相同的重組質(zhì)粒表達(dá)多種miR基因產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種miR基因產(chǎn)物從單個(gè)質(zhì)粒表達(dá)為RNA前體分子，然后使用合適的加工系統(tǒng)將所述前體分子加工成功能性miRM分子。合適的加工系統(tǒng)包括，例如，Tuschl等人的美國公開申請?zhí)?002/0086356(其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考)中描述的體外果蠅細(xì)胞裂解系統(tǒng)。適合用于表達(dá)ffliR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒的選擇、用于將表達(dá)miR基因產(chǎn)物的核酸序列插入質(zhì)粒的方法和將重組質(zhì)粒遞送至目標(biāo)細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。參見，例如，Zeng，等人，M/ecw7arCe〃義1327-1333(2002);Tuschl，^s/."iofec力/o人2ft446-448(2002);Brummelkamp，等人，5"c2'e力ce2夕沃550-553(2002);Miyagishi,等人，5/ofec力加人2ft497-500(2002);Paddison，等人，Ce/2e《/eK76948-958(2002);Lee，爭乂，A/o&c力/70/.2ft500-505(2002);和Paul,等人，"/"ec力"o/.2ft505-508(2002)，其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考。在特定的實(shí)施方案中，表達(dá)miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒包含在細(xì)胞巨化病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子控制之下的編碼miR前體RNA的序列。如此處所用的，"在啟動(dòng)子的控制之下"意指編碼miRNA產(chǎn)物的核酸序列位于啟動(dòng)子的3',這樣啟動(dòng)子才可以起始miRNA編碼序列的轉(zhuǎn)錄。還可從重組病毒栽體表達(dá)miR基因產(chǎn)物。涉及到，可從兩個(gè)分開的重組病毒載體或從相同的病毒載體表達(dá)miR基因產(chǎn)物。可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分離從重組病毒載體表達(dá)的RNA,或可在BCL2相關(guān)癌細(xì)胞中直接表達(dá)。在下面更詳細(xì)地描述重組病毒載體用于將miR基因產(chǎn)物遞送至BCL-2相關(guān)癌細(xì)胞的用途。本發(fā)明的重組病毒載體包含編碼一種或多種miR基因產(chǎn)物的序列和用于表達(dá)RM序列的任何合適啟動(dòng)子。如此處所描述的，合適的啟動(dòng)子包括，例如，U6或HIRNApolIII啟動(dòng)子序列，或細(xì)胞巨4匕病毒啟動(dòng)子。其他合適的啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。本發(fā)明的重組病毒載體還可包含用于在BCL2相關(guān)癌細(xì)胞中表達(dá)一種或更多種miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型或調(diào)控型啟動(dòng)子?？墒褂媚軌蚪邮芫幋araiR基因產(chǎn)物的核苷酸序列的任何病毒載體；例如，來源于腺病毒(AV)、腺伴隨病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，慢病毒(LV)、彈狀病毒(Rhabdoviruses)、鼠白血病病毒)、皰瘆病毒等的栽體。還可通過用包膜蛋白或來自其他病毒的其他表面抗原假型化(pseudotyping)載體來修飾病毒載體的向性。例如，可用來自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、Mokola病毒等的表面蛋白假型化本發(fā)明的AAV栽體。適合用于本發(fā)明的重組病毒載體的選擇、用于將表達(dá)RM的核酸序列插入質(zhì)粒的方法、將病毒載體遞送至目標(biāo)細(xì)胞和回收表達(dá)的RNA產(chǎn)物的方法均在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。參見，例如，Dornburg，Ce/er力erap.2:301-310(1995);Eglitis，A/"ec力;一e":608-614(1988);Miller,#跳C歸7^rap.7:5-14(1990);和Anderson,A""wre，25-30(1998)其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考。優(yōu)選病毒載體是來源于AV和AAV的病毒載體。在Xia，等人，2ft1006-1010(2002)(其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考)中描述了用于表達(dá)本發(fā)明的miRNA的合適的AV載體、用于構(gòu)建重組AV載體的方法和用于將載體遞送至耙細(xì)胞的方法。在Samulski，等人，/.f7ro/.W:3096-3101(1987)、Fisher，等人，/.Wro/.，7ft520-532(1996)、Samulski，等人，/.P7ro/.W:3822-3826(1989)、美國專利號5，252，479、美國專利號5,139,941、國際專利申請?zhí)朩094/13788、和國際專利申請?zhí)朩093/24641(其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考)中描述了用于表達(dá)本發(fā)明的miRNA的合適的AAV載體、用于構(gòu)建重組AAV載體的方法和用于將載體遞送至靶細(xì)胞的方法。在特定的實(shí)施方案中，從包含CMV立即早期啟動(dòng)子的單個(gè)重組AAV載體表達(dá)一種或更多種miR基因產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組AAV病毒載體包含在人U6RNA啟動(dòng)子控制下的編碼與polyT終止序列有效連接的miR前體RNA的核酸序列。如此處所用的，"與polyT終止序列有效連接的"意指編碼有義或反義鏈的核酸序列在5'方向緊鄰polyT終止信號。在從栽體轉(zhuǎn)錄miR序列的過程中，polyT終止信號用于終止轉(zhuǎn)錄。在特定的實(shí)施方案中，將一種或更多種miR基因產(chǎn)物用于抑制BCL2相關(guān)癌細(xì)胞(例如，CLL細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、其他癌細(xì)胞)的贅生性生長或致瘤性生長。不希望受限于任何一種理論，據(jù)認(rèn)為經(jīng)加工的miRNA結(jié)合在一種或更多種啟動(dòng)和/或保持這些細(xì)胞的贅生性生長或致瘤性生長所必需的靶mRM中的互補(bǔ)序列。因此，本發(fā)明提供了在需要該治療的受試者中治療BCL2相關(guān)癌癥例如CLL、急性髓細(xì)胞樣47白血病、多發(fā)性骨髄瘤、黑色素瘤、濾泡性淋巴瘤、大細(xì)胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、血液的惡性肺瘤、實(shí)體瘤、結(jié)腸直腸癌、腦癌、乳腺癌、前列腺癌、EB病毒相關(guān)淋巴細(xì)胞增生性疾病、腎癌、肝細(xì)胞癌和胃癌的方法。方法包括對受試者施用有效量的一種或更多種miR基因產(chǎn)物，這樣就抑制了BCL2相關(guān)癌細(xì)胞的增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或更多miR基因產(chǎn)物包含與BCL2轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。例如，可在來自至少下列組織亞型的癌癥的原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤或贅生性細(xì)胞中減少一種或更多種miR基因的表達(dá)或使其表達(dá)不存在，所述組織亞型的癌癥為肉瘤(中胚層來源的結(jié)締組織和其他組織的癌癥)；黑色素瘤(來源于色素黑色素細(xì)胞的癌癥)；癌瘤(上皮細(xì)胞來源的癌癥)；腺癌(腺上皮來源的癌癥)；神經(jīng)來源的癌癥(神經(jīng)膠質(zhì)瘤/膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和星形細(xì)胞瘤)；和血液瘤形成(hematologicalneoplasias)例如白血病和淋巴瘤(例如，急性成、淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病CLL)。也可在其來源至少為下列器官或組織(無論什么組織學(xué)亞型)的癌癥中減少一種或更多種miR基因的表達(dá)或使其表達(dá)不存在，所迷器官或組織是乳腺、男性和女性泌尿生殖系統(tǒng)的組織(例如，輸尿管、膀胱、前列腺、睪丸、卵巢、子宮頸、子宮、陰道)、肺、胃腸系統(tǒng)的組織(例如，胃、大腸和小腸、結(jié)腸、直腸)、外分泌腺例如胰腺和腎上腺、口和食道的組織、腦和脊髓、腎(腎臟)、胰腺、肝膽管系統(tǒng)(例如，肝、膽嚢)、淋巴系統(tǒng)、平滑肌和橫紋肌、骨和骨髓、皮膚以及眼的組織。例如通過"總體分期分類(OverallStageGrouping)"(也稱為"羅馬計(jì)數(shù)(RomanNumeral)，，)或"腫瘤、結(jié)節(jié)和轉(zhuǎn)移灶"(T畫)分期系統(tǒng)所測量的，發(fā)展的任何預(yù)后階段的癌癥或腫瘤中也可以減少一種或更多種miR基因的表達(dá)或使所述基因的表達(dá)不存在。給定的癌癥的合適的預(yù)后分期系統(tǒng)和分期描述在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，例如，如國立癌癥研究所的"CancerNet"互聯(lián)網(wǎng)站中所描述的?？赏ㄟ^從受試者獲得腫瘤細(xì)胞或贅生性細(xì)胞(或懷疑為腫瘤或贅生性的細(xì)胞)，然后確定與來自獲自受試者的正常組織的細(xì)胞(例如，對照細(xì)胞)相比，一種或更多種miR基因(例如，包含與BCL2轉(zhuǎn)錄物內(nèi)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的miR基因)的表達(dá)在至少部分細(xì)胞中是否減少或不存在來鑒定需要治療BCL2相關(guān)癌癥的受試者。用于檢測細(xì)胞中miR基因的表達(dá)水平的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)并且在此處進(jìn)行了描述?？蛇x擇地，可將從受試者獲得的細(xì)胞中的一種或更多種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)與從正常受試者的群體獲得的細(xì)胞中的這些基因的平均表達(dá)水平比較?？捎舍t(yī)生使用標(biāo)準(zhǔn)的診斷技術(shù)容易地鑒定需要BCL2相關(guān)癌癥的治療的受試者。參見，例如，"Chroniclymphocyticleukemia:recommendationsfordiagnosis,staging,andresponsecriteria.InternationalWorkshoponChronicLymphocyticLeukemia,，，(1989)Ao/za/so尸Znter/"#ed/c//7e110(3):236-238，其全部分公開內(nèi)容在此引用作為參考。例如，具有CLL的受試者展示循環(huán)的CLL細(xì)胞、淋巴細(xì)胞增多(即，血液中淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)等于或高于每立方毫米10，000個(gè)細(xì)胞)和CLL細(xì)胞在骨髓和淋巴組織中的累進(jìn)積累?？赏ㄟ^血液樣品的直接目視觀察和/或在CLL的情況下通過確定淋巴細(xì)胞的"CLL評分，，來確認(rèn)受試者的血液或其他組織中BCL2相關(guān)癌細(xì)胞的鑒定。CLL評分表明CLL細(xì)胞的5種淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記特征CD5+、CD23+、FMC7-和表面免疫球蛋白(SmIg)和CD22的弱表達(dá)(+/-)的存在或不存在。根據(jù)其對于CLL是典型的還是非典型的，該評分系統(tǒng)對這5個(gè)標(biāo)記的各標(biāo)記給出1或0的值。CLL細(xì)胞具有4或5的CLL評分，而來自其他白血病的淋巴細(xì)胞具有小于1至3的CLL評分。參見Matutes，等人，Ze"ie邁/a《(7":1640-1645(1994)和Moreau，等人，』邁er/ca/2/0i/i7a/of67//7/ca/戶"/0/0g7，"《378-82(1997)，其完整公開內(nèi)容在此引用作為參考。CLL細(xì)胞還具有與正常的外周血B細(xì)胞相比相對低水平的表面膜免疫球蛋白。可按照標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)容易地檢測淋巴細(xì)胞上的表面膜免疫球蛋白的水平；參見，例如，Rozman，等人，^etr^ng/a/^//owi7a/o/*￥ecT/c//7eJ":1052-10571995)，其完整公開內(nèi)容在此引用作為參考。如此處所用的，miR基因產(chǎn)物的"有效量"是足以抑制遭受BCL2相關(guān)癌癥的受試者中的BCL2相關(guān)癌細(xì)胞的增殖的量。如此處所用的，"抑制BCL2相關(guān)癌細(xì)胞的增殖"是指殺死細(xì)胞或永久地或暫時(shí)性地阻止細(xì)胞的生長。如果受試者中此類細(xì)胞的數(shù)目在施用miR基因產(chǎn)物后保持恒定或減少那么可推斷出抑制BCL2相關(guān)癌細(xì)胞。如果此類細(xì)胞的絕對數(shù)目增加但腫瘤生長的速率減小也可推斷出BCL2相關(guān)癌細(xì)胞增殖的抑制?？赏ㄟ^直接測量或根據(jù)原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤的質(zhì)量估量來確定受試者體內(nèi)BCL2相關(guān)癌細(xì)胞的數(shù)目。例如，可使用全血或白細(xì)胞計(jì)數(shù)來容易地確定受試者中BCL2相關(guān)癌細(xì)胞的數(shù)目。還可使用設(shè)計(jì)用于檢測BCL2相關(guān)癌細(xì)胞的特征表面標(biāo)記的免疫組織學(xué)方法、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)或其他技術(shù)容易地確定BCL2相關(guān)癌細(xì)胞的數(shù)目?？赏ㄟ^直接的目視觀察或通過診斷性影〗象學(xué)方法例如X射線、磁共振影^^學(xué)(MRI)、超聲和閃爍照相術(shù)(scintigraphy)確定腫瘤塊的大小。用于確定胂瘤塊的大小的診斷性影像學(xué)如本領(lǐng)域內(nèi)已知的，可釆用或不采用照影劑。還可通過物理方法例如組織塊的觸診或使用測量儀器例如測徑器進(jìn)行的組織塊測量來確定腫瘤塊的大小。通過考慮因素例如受試者的身材大小和重量、疾病侵襲的程度、受試者的年齡、健康狀況和性別、給藥途徑和施用是局部的還是全身性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定對給定的受試者施用的一種或更多種miR基因產(chǎn)物的有效量。例如，miR基因產(chǎn)物的有效量可基于待治療的腫瘤塊的近似重量?？赏ㄟ^計(jì)算腫瘤塊的近似體積來確定腫瘤塊的近似重量，其中1立方厘米的體積大約等于l克?；谀[瘤塊的重量，一種或更多種miR基因產(chǎn)物的有效量可以是至少大約10微克/克腫瘤塊，和可以是大約10至500微克/克胂瘤塊。此外，有效量可以是至少大約60微克/克腫瘤塊或至少大約100微克/克腫瘤塊。在特定的實(shí)施方案中，將基于腫瘤塊的重量有效量直接注射入胂瘤。一種或更多種miR基因產(chǎn)物的有效量也可基于待治療的受試者的近似或估計(jì)的體重。在一個(gè)實(shí)施方案中，如此處所描述的，胃腸外或腸內(nèi)施用該有效量。例如，對受試者施用的一種或更多種miR基因產(chǎn)物的有效量可以在大約5至3000微克/kg體重的范圍內(nèi)變化，和可在大約700至1000微克/kg的體重之間，也可大于約1000微克/kg體重。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可容易地確定用于對給定的受試者施用一種或更多種niiR基因產(chǎn)物的合適的劑量方案。例如，可對受試者施用一種或更多種miR基因產(chǎn)物一次(例如，單次注射或沉積)。可選擇地，可在從大約3至大約28天，更優(yōu)選從大約7至大約10天的時(shí)期內(nèi)每天1次或2次對受試者施用一種或更多種miR基因產(chǎn)物。在特定的劑量方案中，每天1次施用一種或更多種miR基因產(chǎn)物，進(jìn)行7天。當(dāng)劑量方案包含多次施用時(shí)，要理解對受試者施用的一種或更多種miR基因的有效量可包括在整個(gè)劑量方案中施用的基因產(chǎn)物的總量?？墒褂眠m合將基因產(chǎn)物遞送至受試者的細(xì)胞例如造血干細(xì)胞(HSC)和/或BCL2相關(guān)癌細(xì)胞(例如，CLL細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、其他癌細(xì)胞))的任何方法對受試者施用一種或更多種miR基因產(chǎn)物。例如，可使用適合用miR基因產(chǎn)物或用包含編碼miR基因產(chǎn)物的序列的核酸轉(zhuǎn)染受試者的細(xì)胞的方法施用一種或更多種miR基因。可直接用一種或更多種miR基因產(chǎn)物(當(dāng)這些產(chǎn)物是核酸時(shí))直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，或用包含編碼一種或更多種miR基因產(chǎn)物的序列的核酸轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，用包含編碼此處描述的一種或更多種miR基因產(chǎn)物的質(zhì)?；虿《据d體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，其包括核酸至細(xì)胞的細(xì)胞核或前核的直接注射、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移或通過親脂材料介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、受體介導(dǎo)的核酸遞送、基因槍(bioballistic)或粒子加速、磷酸釣沉淀和病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。例如，可用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移化合物例如DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-甲基硫酸銨，Boehringer-Mannheim)或等同物例如LIPOFECTIN轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用的核酸的量對于本發(fā)明的實(shí)踐不是至關(guān)重要的；可用0.1-100微克的核酸/105個(gè)細(xì)胞獲得可接受的結(jié)果。例如，可使用每105個(gè)細(xì)胞大約0.5微克質(zhì)粒載體(于大約3微克DOTAP中)。在一個(gè)實(shí)施方案中，從受試者分離BCL2相關(guān)癌細(xì)胞例如CLL或前列腺癌細(xì)胞，用編碼miR基因產(chǎn)物的核酸將其轉(zhuǎn)染，然后再導(dǎo)入受試者。在特定的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)染的和再植的細(xì)胞是CLL細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)染的和再植的細(xì)胞是來自已診斷具有BCL2相關(guān)癌癥的受試者的HSC。用于從受試者分離BCL2相關(guān)癌細(xì)胞(例如，CLL細(xì)胞)的技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)，例如，如下面的實(shí)施例中所描述的。用于從受試者分離、鑒定、分開和培養(yǎng)HSC的技術(shù)也在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)，例如，如在美國專利號Nos.5,635,387和5,643,741，以及Campana，等人，A/ootf《J:1416—1434(1995)中所乂>開的，所述參考資料的全部公開內(nèi)容在此引用作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，在HSC的轉(zhuǎn)染之前，從收獲的骨髓中清除腫瘤細(xì)胞或贅生性細(xì)胞。合適的清除技術(shù)包括，例如，動(dòng)員的外周血細(xì)胞的白細(xì)胞清除術(shù)、腫瘤細(xì)胞的基于免疫親和力的選擇或殺死腫瘤細(xì)胞或使用細(xì)胞毒性劑或光敏化劑以選擇性殺死腫瘤細(xì)胞，這在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。參見，例如，BoneMarrowProcessingandPurging,Part5(A.Gee,ed.)，CRCPress,BocaRaton，F(xiàn)la.，1991;Lydaki，等人，/.力"oc力e邁.a/7d戶力"06/0/.":27-32(1996);和Gazitt，等人，Wood<沃381-389(1995)，其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考。可使用此處討論的任何合適的技術(shù)轉(zhuǎn)染分離的細(xì)胞(例如，HSC細(xì)胞、BCL2相關(guān)癌細(xì)胞(例如，CLL細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、其他癌細(xì)胞))。在轉(zhuǎn)染后，可檢查部分細(xì)胞以確認(rèn)基因產(chǎn)物存在的合適的表達(dá)水平。在確認(rèn)miR基因產(chǎn)物的合適的表達(dá)后，其余轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則可再導(dǎo)入受試者?？赏ㄟ^胃腸外方法包括靜脈內(nèi)輸注或直接注射入骨髓將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞再導(dǎo)入受試者。優(yōu)選在鹽水溶液中或其他藥學(xué)上可接受的載體中將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞再導(dǎo)入受試者。用于再導(dǎo)入的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的合適數(shù)目是每千克受試者體重大約105至大約108個(gè)細(xì)胞。可通過在轉(zhuǎn)染前擴(kuò)增細(xì)胞來增加可獲得的用于再導(dǎo)入的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的數(shù)目。在一個(gè)實(shí)施方案中，用包含編碼miR基因產(chǎn)物的序列的核酸例如質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞(例如，HSC細(xì)胞、BCL2相關(guān)癌細(xì)胞(例如，CLL細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、其他癌細(xì)胞))的基因組，所述質(zhì)粒表達(dá)載體穩(wěn)定地整合入細(xì)胞的基因組以提供miR的長期表達(dá)。可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)例如使用miR基因cDM(或其片段)作為探針的基因組DNA的Southern印跡分析確認(rèn)穩(wěn)定的整合和表達(dá)。還可使用標(biāo)準(zhǔn)的Northern印跡技術(shù)檢測miR基因產(chǎn)物的表達(dá)。用編碼miR基因產(chǎn)物的序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在其重植入受試者后持續(xù)地表達(dá)miR基因產(chǎn)物。在下面的實(shí)施例中描述了從受試者分離HSC，用表達(dá)一種或更多種miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒將其轉(zhuǎn)染，然后將轉(zhuǎn)染的HSC再植入受試者的示例性方法。還可通過任何合適的腸內(nèi)或胃腸外給藥途徑對受試者施用miR基因產(chǎn)物。用于本方法的合適的腸內(nèi)給藥途徑包括口服、直腸或鼻內(nèi)給藥。合適的胃腸外給藥途徑包括血管內(nèi)給藥(例如，靜脈內(nèi)推注、靜脈內(nèi)輸注、動(dòng)脈內(nèi)推注、動(dòng)脈內(nèi)輸注和至脈管系統(tǒng)的導(dǎo)管滴注)、組織邊緣和組織內(nèi)注射(peri-andintra-tissueinjection)(例如，肺瘤邊緣注射和瘤內(nèi)注射，視網(wǎng)膜內(nèi)注射或視網(wǎng)膜下注射)、皮下注射或沉積包括皮下輸注(例如通過滲透泵)、對目標(biāo)組織的直接施用(例如，通過導(dǎo)管或其他配置裝置(例如，視黃醛片劑或栓劑或包含多孔的、無孔的或膠狀材料的植入體)進(jìn)行的)和吸入。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過注射或輸注施用miR基因產(chǎn)物。為了治療包括實(shí)體瘤的BCL2相關(guān)癌癥，可通過直接注射入腫瘤來施用miR基因產(chǎn)物。在本方法中，可以棵露的RNA形式與遞送試劑一起或以包含表達(dá)基因產(chǎn)物的序列的核酸(例如，重組質(zhì)?；虿《据d體)的形式對受試者施用miR基因產(chǎn)物。用于施用miR基因產(chǎn)物的合適的遞送試劑包括例如MirusTransitTK0親脂試劑、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(lipofectin)、lipofectamine、cellfectin、多聚陽離子(例如，多聚賴氨酸)和脂質(zhì)體。此處討論包含表達(dá)miR基因產(chǎn)物的序列的重組質(zhì)粒。此處討論包含表達(dá)miR基因產(chǎn)物序列的重組病毒載體，用于將此類載體遞送至受試者的細(xì)胞(例如，HSC細(xì)胞、BCL2相關(guān)癌細(xì)胞(例如，CLL細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、其他癌細(xì)胞))的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍之內(nèi)。在特定的實(shí)施方案中，使用脂質(zhì)體將miR基因產(chǎn)物或包含編碼miR基因產(chǎn)物的序列的核酸遞送至受試者。脂質(zhì)體還可增加miR基因產(chǎn)物或核酸的血液半衰期。在本實(shí)施方案的實(shí)踐中，在對受試者施用之前，將miR基因產(chǎn)物或包含編碼miR基因產(chǎn)物的序列的核酸封裝在脂質(zhì)體內(nèi)。可從標(biāo)準(zhǔn)的形成小嚢泡的脂質(zhì)(其通常包括中性的或帶負(fù)電荷的磷脂和固醇例如膽固醇)形成適合用于本發(fā)明的脂質(zhì)體。通常通過考慮因素例如希望的脂質(zhì)體的大小和脂質(zhì)體在血流中的半衰期來指導(dǎo)脂質(zhì)的選擇。用于制備脂質(zhì)體的許多方法是已知的，如在Szoka，等人，如/7.紐.S/oMfs.S/oe/^.義467(1980);和美國專利號4,235,871、4,501,728、4，837，028和5，019，369(其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考)中所描述的方法。封裝miR基因產(chǎn)物或包含編碼miR基因產(chǎn)物序列的核酸的脂質(zhì)體可包含將脂質(zhì)體靶向BCL2相關(guān)癌細(xì)胞(例如，CLL細(xì)胞、HSC細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、另一種癌細(xì)胞)的配體分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用結(jié)合在此類癌細(xì)胞中廣泛存在的受體的配體(例如，結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原或癌細(xì)胞表面標(biāo)記的單克隆抗體)。還可修飾封裝miR基因產(chǎn)物或包含編碼miR基因產(chǎn)物的序列的核酸的脂質(zhì)體以避免被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)("MMS")和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)("RES")清除。此類修飾的脂質(zhì)體可具有表面上的或被整合入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的調(diào)理作用抑制部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可包含調(diào)理作用抑制部分和配體。54用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分通常為典型的大的、結(jié)合脂質(zhì)體膜的親脂聚合物。如此處所用的，當(dāng)其本身通過脂溶性的錨嵌入膜或通過直接結(jié)合膜脂質(zhì)的活性基團(tuán)而化學(xué)地或物理學(xué)地附著至膜時(shí)，調(diào)理作用抑制部分"結(jié)合"至脂質(zhì)體膜。此類調(diào)理作用抑制親水聚合物形成顯著減少脂質(zhì)體被腿S和RES吸收的保護(hù)性表面層(例如，如美國專利號4,920,016中所描述的，其全部分公開內(nèi)容在此引用作為參考)。適合用于修飾脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分優(yōu)選是具有大約500至大約40，000道爾頓，更優(yōu)選大約2，000至大約20，000道爾頓的數(shù)量平均分子量的水溶性聚合物。此類聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸酯；合成的聚合物例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；線性的、分支的或樹枝狀(dendrimeric)聚二胺(polyamidoamine);聚丙烯酸；多元醇例如羧基或氨基化學(xué)與之連接的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神經(jīng)節(jié)苷脂例如神經(jīng)節(jié)苷脂GM,。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG的共聚物或其衍生物也是合適的。此外，調(diào)理作用抑制聚合物可以是PEG和多聚氨基酸、多糖、聚二胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。調(diào)理作用抑制聚合物還可以是包含氨基酸或羧酸例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神經(jīng)氨酸、褐藻酸、角叉菜膠的天然多糖、氨化多糖(aminatedpolysaccharide)或寡聚糖(線性的或分支的)或羧化多糖或低聚糖(例如與碳酸的衍生物反應(yīng)產(chǎn)生羧基的連接)。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物修飾的脂質(zhì)體有時(shí)稱為"PEG化脂質(zhì)體"。可使用許多熟知的技術(shù)中的任一技術(shù)將調(diào)理作用抑制部分與脂質(zhì)體膜結(jié)合。例如，可將PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯與磷脂酰乙醇胺脂溶性錨結(jié)合，然后再與膜結(jié)合。類似地，可在6(TC下使用Na(CN)BH3和溶劑混合物例如以30:12比例的四氫呋喃和水通過還原性胺化作用用硬脂酰胺脂溶性錨衍生葡聚糖聚合物。用調(diào)理抑制部分修飾的脂質(zhì)體比未修飾的脂質(zhì)體在循環(huán)中保持更長的時(shí)間。因此，此類脂質(zhì)體有時(shí)稱為"隱秘(stealth)"脂質(zhì)體。已知隱秘脂質(zhì)體在通過多孔的或"滲漏的"微血管滋養(yǎng)的組織中累積。因此，表征為這樣的微血管缺陷的組織例如實(shí)體瘤將有效地積累這些脂質(zhì)體；參見Gabizon，等人，#"7.Jc/.,^W，7及6949-53(1988)。此外，減少的被RES的吸收通過防止脂質(zhì)體在肝和脾中的大量累積降低了隱秘脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理作用抑制部分修飾的脂質(zhì)體特別地適合用于將miR基因產(chǎn)物或包含編碼所述基因產(chǎn)物的序列的核酸遞送至肺瘤細(xì)胞。如此處所用的，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是在需要該治療的受試者中預(yù)防或治療與BCL2基因或基因產(chǎn)物(例如，RNA、蛋白質(zhì))的過度表達(dá)相關(guān)的癌癥的方法，其包括對受試者施用有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物。在Cory,S.，和Adams,J.M.，A^"wreWeWe『s2:647-656(2002)和Sanchez-Beato，M.，等人，"/ood雄1220-1235(2003)(其內(nèi)容在此引用作為參考)中描述了BcU蛋白和Bc12家族的成員以及它們在癌癥中的作用。人BCL2cDM和蛋白質(zhì)的核苷酸和氨基酸序列示于表2中。表2.BCL2cDNA和蛋白質(zhì)的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>33EH3O《。UuoCDC5U3ggoo《《ouuEH《OElUUCDhrtjEhCD《Ehe>EhOUCJOEh《UOE""UWU<3EhE"iCDe>uouoEhUC5CJ<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>用于檢測BCL2基因產(chǎn)物的表達(dá)水平的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。例如，可4吏用此處已描述的4支術(shù)(例如Northern印跡、原位雜交、RT-PCR)檢測細(xì)胞樣品中BCL2基因轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平?？墒褂猛ǔＪ褂玫牟胖g(shù)例如免疫染色或Western印跡檢測Bcl2蛋白的表達(dá)水平，所述技術(shù)描述于CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.A謂bel等人，eds.，第2巻，JohnWileyandSons,Inc.,1998，第IO章。過度表達(dá)Bcl2的癌癥對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，包括，但不限于，白血病、淋巴瘤和癌(參見Kim，R.，等人，Ca/zcer2491-2502(2004);美國專利號5，789，389;和美國專利號6,800,639，其內(nèi)容在此引用作為參考)。已知與Bcl2的過度表達(dá)相關(guān)的特定的癌癥包括，除其他以外，CLL、急性髓細(xì)胞樣白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤、濾泡性淋巴瘤、大細(xì)胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、血液的惡性腫瘤、實(shí)體瘤、結(jié)腸直腸癌、腦癌、乳腺癌、前列腺癌、EB病毒相關(guān)淋巴細(xì)胞增生性疾病、腎癌、肝細(xì)胞癌和胃癌。在特定的實(shí)施方案中，對需要治療的受試者施用的至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。如此處所用的，術(shù)語"互補(bǔ)核苷酸序列"是指能夠通過氫鍵與另一個(gè)與其互補(bǔ)的核普酸序列形成堿基對的多核苷酸序列。嘌呤和嘧啶之間(例如，腺嘌呤和胸腺嗜啶或尿嘧啶之間，鳥嘌呤和胞嘧啶之間)通過標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick堿基對形成所述氫鍵。如此處所用的，"Watson-Crick堿基對"是指核酸的相對反向平行鏈上的成對的通過氯鍵結(jié)合的堿基。首先由Watson和Crick建立的堿基配對法則對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。例如，這些法則要求腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶OJ)配對，以及鳥噤呤(G)與胞嘧啶(C)配對，互補(bǔ)鏈相互之間反向平行。如此處所用的，術(shù)語"Watson-Crick堿基對"不僅包括標(biāo)準(zhǔn)的AT、AU或GC堿基對，還包括能夠與標(biāo)準(zhǔn)堿基或另一種互補(bǔ)的非標(biāo)準(zhǔn)堿基氫鏈鍵合的核苷酸類似物的非標(biāo)準(zhǔn)或經(jīng)修飾的堿基之間形成的堿基對。這樣的非標(biāo)準(zhǔn)Watson-Crick堿基配對的一個(gè)實(shí)例是包括核苷酸類似物肌苷的堿基配對，其中其次黃嘌呤堿基可與腺嘌呤、胞嘧咬或尿嘧啶形成兩個(gè)氬鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列100%互補(bǔ)(即，完全互補(bǔ))的核普酸序列。在其他實(shí)施方案中，至少一個(gè)miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、至少大約95%或、至少大約99%互補(bǔ)的核苷酸序列?；パa(bǔ)區(qū)域長度可以是大約5至大約25個(gè)核苷酸，長度大約5至大約15個(gè)核苷酸，或更特別地，長度大約7至大約12個(gè)核苷酸。與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的miR基因產(chǎn)物的實(shí)例包括，但不限于，miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217和miR-186(參見，例如，表5)。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物包含與SEQIDNO:55的核苷酸3741-3749互補(bǔ)的核苷酸序列。此類miR基因產(chǎn)物的實(shí)例包括但不限于miR-15a、miR-16-l、miR-15b和miR-16-2。在特定的實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。用于對受試者施用miR基因產(chǎn)物的方法(此處描述了其中的幾種方法)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。本發(fā)明還包括用于在具有癌癥的受試者沖增加抗癌療法的功效的方法，其包括對受試者施用至少一種包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的ffliR基因產(chǎn)物，和額外地對受試者施用至少一種抗癌療法。根據(jù)本發(fā)明，抗癌療法可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何抗癌療法。合適的抗癌療法包括但不限于化學(xué)療法、放射療法和其組合(例如，化學(xué)放射)。本發(fā)明還涉及增加非常規(guī)癌癥療法的功效的方法。如此處所用的，化療法是指施用一種或更多種化學(xué)物質(zhì)或藥物來治療癌癥。用于本發(fā)明的方法的合適的化學(xué)治療劑可以是已知用于治療癌癥的任何化學(xué)物質(zhì)，例如，DNA-烷化劑、抗胂瘤抗生素藥物、抗代謝藥物、微管蛋白穩(wěn)定劑、微管蛋白去穩(wěn)定劑、激素拮抗劑、拓樸異構(gòu)酶抑制劑、蛋白激酶抑制劑、HMG-CoA抑制劑、CDK抑制劑、細(xì)胞周期蛋白抑制劑、半胱天東酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、反義核酸、三螺旋DNA、核酸適體和經(jīng)分子經(jīng)修飾的病毒(molecularly-modifiedviral)試劑、細(xì)菌或夕卜毒素試劑(bacterialorexotoxicagent)。用于本發(fā)明的方法的特別合適的試劑的實(shí)例包括但不限于胞二磷膽堿、阿糖胞苷、甲氨喋呤、長春新堿、依托泊戒(etoposide)(VP-16)、阿得利亞霉素(阿霉素)、順鉑(CDDP)、地塞米松、arglabin、環(huán)磷酰胺、溶肉瘤素、甲基亞硝脲、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶(5FU)、長春堿、喜樹堿、放線菌素D、絲裂霉素C、過氧化氫、奧沙利鉑、依立替康、托泊替康、曱酰四氫葉酸、卡莫司汀、鏈脲菌素、CPT-ll、泰素和其衍生物、它莫西芬、達(dá)卡巴嗪、利妥昔單抗、柔紅霉素、l-p-D-阿糖呋喃糖胞嘧啶、伊馬替尼、氟達(dá)拉濱、多西他奇和F0LF0X4。如此處所用的，放射療法是指使用高能輻射進(jìn)行癌癥的治療。除其他以外，可由X射線、Y放射和中子提供用于放射療法的高能輻射。不同的放射療法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的并且適合用于本發(fā)明的方法。這些方法包括但不限于夕卜照射放療(externalbeamradiation)、近距離放射療法(brachytherapy)、強(qiáng)度調(diào)控放射治療(intensity-modulatedradiotherapy)(IMRT)、植入放射(implantradiation)、全身性放射(systemicradiation)和立體定向放射治療(stereotacticradiotherapy)。術(shù)語"受試者"、"個(gè)體"和"患者"此處定義為包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物，包括但不限于靈長類動(dòng)物、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他牛、羊、馬、犬、貓、嚙齒目動(dòng)物或鼠類物種。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，動(dòng)物是人。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是遭受一種或更多種BCL2相關(guān)癌癥的哺乳動(dòng)物(例如，人)。如此處所描述的，除其他以外，由本發(fā)明的方法治療的合適的BCL2相關(guān)癌癥包括淋巴瘤、癌和白血病。在特定的實(shí)施方案中，BCL2相關(guān)癌癥是表征為BCL2基因或基因產(chǎn)物(例如，RNA、蛋白質(zhì))的增加的表達(dá)(例如，過度表達(dá)、上調(diào))的癌癥。特別合適的BCL2相關(guān)癌癥的實(shí)例包括，除其他以外，CLL、急性髓細(xì)胞樣白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤、濾泡性淋巴瘤、大細(xì)胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、血液的惡性腫瘤、實(shí)體瘤、結(jié)腸直腸癌、腦癌、乳腺癌、前列腺癌、EB病毒相關(guān)淋巴細(xì)胞增生性疾病、腎癌、肝細(xì)胞癌和胃癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是CLL。在另一個(gè)實(shí)施方案中癌癥是淋巴瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是肺癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是前列腺癌。根據(jù)本發(fā)明的該實(shí)施方案的方法，通過對受試者施用至少一種miR基因產(chǎn)物來增加癌癥治療的功效?？蓪iR基因產(chǎn)物與化學(xué)治療劑共施用(即，同時(shí)施用)，或可將其分開施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)。此類miR基因產(chǎn)物的實(shí)施例包括但不限于miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217和miR-186(參見表5)。在其他實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物包含與SEQIDNO:55的核苷酸3741至3749互補(bǔ)的核苷酸序列，例如miR-15a、miR-16-l、miR-15b和miR-16-2。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l0可通過相對于合適的對照受試者中癌癥的增加的好轉(zhuǎn)來證明抗癌療法的功效的增加?？筛鶕?jù)接受的臨床標(biāo)準(zhǔn)例如受試者中癌細(xì)胞數(shù)目的減少和/或腫瘤質(zhì)量和/或大小的減少來確定癌癥的好轉(zhuǎn)?？赏ㄟ^直接測量或通過根據(jù)原發(fā)性腫瘤塊或轉(zhuǎn)移瘤塊的大小估量來確定BCL2相關(guān)癌細(xì)胞的數(shù)目。本發(fā)明還提供了增加癌細(xì)胞對抗癌劑的細(xì)胞毒性效應(yīng)的敏感性的方法，其包括為細(xì)胞提供至少一種包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的miR基因產(chǎn)物。通過對細(xì)胞提供至少一種miR基因產(chǎn)物，增加細(xì)胞對抗癌劑的敏感性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是增加癌細(xì)胞對抗癌劑的細(xì)胞毒性效應(yīng)的敏感性的方法，其包括對癌細(xì)胞提供至少一種抗癌劑并且額外地對癌細(xì)胞提供至少一種miR基因產(chǎn)物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核普酸序列。抗癌劑可以是已知用于治療癌癥的任何試劑。此類試劑包括但限于化學(xué)治療劑和輻射照射。在下文中描述合適的試劑的實(shí)例。如此處所用的，短語"抗癌劑的細(xì)胞毒性效應(yīng)"是指由于試劑的施用導(dǎo)致的任何細(xì)胞損傷和/或死亡。相對于其中只提供抗癌劑的對照細(xì)胞，可通過由施用至少一種抗癌劑和至少一種miR基因產(chǎn)物導(dǎo)致的細(xì)胞損傷的嚴(yán)重度的增加和/或細(xì)胞死亡的數(shù)量或比率的增加來證明癌細(xì)胞對抗癌劑的細(xì)胞毒性效應(yīng)的敏感性的增加。用于評估細(xì)胞毒性(例如，細(xì)胞損傷和/或死亡)的技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知，其包括但不限于監(jiān)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長和細(xì)胞死亡(例如，凋亡、壞死)的測定法。用于本發(fā)明的該實(shí)施方案的合適的細(xì)胞包括癌細(xì)胞。在特定的實(shí)施方案中，癌細(xì)胞過度表達(dá)BCL2基因產(chǎn)物(例如，R1U、蛋白質(zhì))。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是體內(nèi)細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物(例如，人)中的BCL2相關(guān)癌細(xì)胞)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞獲自患者樣品(例如，活檢組織、血液)或其可獲自已建立的癌細(xì)胞系或來源于患者樣品的癌細(xì)胞的細(xì)胞系。在某些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞來自從具有與Bcl2的過度表達(dá)相關(guān)的癌癥的受試者獲得的患者樣品。此類癌癥的實(shí)例包括，除其他以外，CLL、急性髓細(xì)胞樣白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤、濾泡性淋巴瘤、大細(xì)胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、血液的惡性腫瘤、實(shí)體瘤、結(jié)腸直腸癌、腦癌、乳腺癌、前列腺癌、EB病毒相關(guān)淋巴細(xì)胞增生性疾病、腎癌、肝細(xì)胞癌和胃癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是CLL。在另一個(gè)實(shí)施方案中癌癥是淋巴瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是肺癌。根據(jù)本發(fā)明的方法，通過對癌細(xì)胞提供至少一種ffliR基因產(chǎn)物來增加癌細(xì)胞對化療治療劑的細(xì)胞毒性效應(yīng)的敏感性。在特定的實(shí)施方64案中，ffliR基因產(chǎn)物與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)。此類miR基因產(chǎn)物的實(shí)例包括但不限于miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、niiR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217和miR-186(參見表5)。在其他實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物包含與SEQIDNO:55的核苷酸3741至3749互補(bǔ)的核苷酸序列，例如，miR-15a、miR-16-1、miR-15b和miR-16-2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。在對受試者施用之前，按照本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)將用于本發(fā)明的方法的miR基因產(chǎn)物優(yōu)選配制為藥物組合物。因此，本發(fā)明包括包含至少一種miR基因產(chǎn)物的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物是miR15或miR16(例如，miR-15a或miR-16-l)。在其他實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。用于本發(fā)明的方法的合適的miR基因產(chǎn)物的實(shí)例包括但不限于miR-182、miR—181、miR-30、miR-15a、miR—16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217和miR-186(參見表5)。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還包含至少一種化學(xué)治療劑。用于治療癌癥的許多化學(xué)治療劑在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。此處描述了用于本發(fā)明的組合物的合適的化學(xué)治療劑。在某些實(shí)施方案中，每劑量化學(xué)治療劑的量為大約0.0001至1000mg/kg、大約0.5至70mg/kg或大約1至50mg/kg。本發(fā)明的藥物組合物表征為無菌的和無熱原的。如此處所用的，"藥物組合物"包括用于人和獸醫(yī)學(xué)用途的組合物。用于制備本發(fā)明的藥物組合物的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)，例如，如ve邁/i2^^o/3'sZ^力ar/z73cei/f/ca7Sc/'e/rce,第17版,ed.，MackPublishingCompany,Easton，Pa.(1985)(其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考)中所描述的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本藥物組合物包含與藥學(xué)上可接受的載體混合的miR基因產(chǎn)物或包含編碼該基因產(chǎn)物的序列的核酸(例如，按重量計(jì)算0.1至90%)或其生理上可接受的鹽。本發(fā)明的藥物組合物還可包含用脂質(zhì)體封裝的miR基因產(chǎn)物或包含編碼該基因產(chǎn)物的序列的核酸以及藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選藥學(xué)上可接受的載體是水、緩沖水溶液、生理鹽水、0.4%鹽水、0.3%甘氨酸、透明質(zhì)酸等。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可包含抗核酸酶降解的miR基因產(chǎn)物。本領(lǐng)域^t術(shù)人員可通過例如將一個(gè)或多個(gè)在2'位置修飾的核糖核苷酸整合入miR基因產(chǎn)物容易地合成抗核酸酶的miR基因產(chǎn)物。合適的2'-修飾的核糖核苷酸包括在2'-位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和0-烯丙基修飾的核糖核苷酸。例如，本發(fā)明的藥物組合物包含整合一個(gè)或更多個(gè)式2'AR-核苷酸的2'-修飾的核苷酸的miR基因產(chǎn)物，其中A是氧或氫(優(yōu)選氟、氯或溴)；和R是氫或直鏈或支鏈d"烷基；假定當(dāng)A是離素時(shí)，則省略R。優(yōu)選的修飾的2_核糖核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含其中各核糖核苷酸是2'-修飾的核糖核苷酸的miR基因產(chǎn)物。本發(fā)明的藥物組合物還可包含常規(guī)的藥物賦形劑和/或添加劑。合適的藥物賦形劑包括穩(wěn)定劑、抗氧化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、緩沖劑和pH調(diào)節(jié)劑。合適的添加劑包括生理上生物相容的緩沖劑(例如，鹽酸氛基丁三醇(tromethaminehydrochloride))、整合齊寸(例:ft口，DTPA或DTPA-雙酰胺)或鉤離子螯合復(fù)合物(calciumchelatecomplexes)(例如，鉤DTPA、CaNaDTPA-雙酰胺)或任意地釣或鈉鹽(例如，氯化釣、抗壞血酸铞、葡萄糖酸4丐或乳酸鈣)的加入。可包裝本發(fā)明的藥物組合物從而以液體的形式進(jìn)行使用，或可將其凍干。對于本發(fā)明的固體藥物組合物，可使用常規(guī)的無毒固體的藥學(xué)上可接受的載體；例如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。例如，用于口服給藥的固體藥物組合物可包含上面所列的任何載體和賦形劑和10-95%,優(yōu)選25%-75%的miR基因產(chǎn)物。用于噴霧(吸入)給藥的藥物組合物可包含按重量計(jì)算0.01-20%，優(yōu)選按重量計(jì)算1%-10%的如上所述封裝在脂質(zhì)體中的miR基因產(chǎn)物和噴射劑。如果想要還可使用載體例如用于鼻內(nèi)給藥的卵磷脂。本發(fā)明還包括用于確定受試者中癌癥療法的功效的方法，其包括對受試者施用至少一種受試試劑，然后測量來自受試者的樣品中的miR基因產(chǎn)物的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，ffliR基因產(chǎn)物與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)。該miR基因產(chǎn)物的實(shí)例包括但不限于miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、raiR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217和miR-186(參見表5)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物包含與核苷酸SEQIDNO:55的核苷酸3741至3749互補(bǔ)的核普酸序列，例如，miR-15a、miR-16-1、miR-15b和miR-16-2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。在特定的實(shí)施方案中，在施用試劑后，與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的ffliR基因產(chǎn)物的表達(dá)的增加表明對治療的有利反應(yīng)。用于檢測miR基因產(chǎn)物的表達(dá)水平的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，其包括但不限于此類技術(shù)如下文中描述的技術(shù)(例如，Northern印跡分析、RT-PCR、原位雜交)。被檢測的合適試劑包括，除其他以外，小有機(jī)分子、肽和天然發(fā)生的生物大分子。特別合適的受試者包括遭受一種或更多種與Bcl2過度表達(dá)相關(guān)的癌癥的個(gè)體。通過下列非限定性實(shí)施例舉例說明本發(fā)明。實(shí)施例在實(shí)施例1至4中使用下列技術(shù),悉^舉品和勿應(yīng)^在CLL科研聯(lián)合體研究所(CIXResearchConsortiuminstitutions)，征得經(jīng)診斷具有CLL的患者同意后獲得患者的樣品。簡而言之，從CLL患者獲得外周血，之后通過聚蔗糖一泛影鈉密度梯度離心法(Ficoll-Hypaquegradientcentrifugation)(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway，NJ)分離單核細(xì)胞，然后按照Sambrook,J.，爭人(1989)，#o7ecu7ar67o///fJ丄a6orafor/#<3/7Ws7(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)(其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方案處理所述細(xì)胞以進(jìn)行RNA和DNA提取。作為LOH研究的正常對照，將來自相應(yīng)患者的頰粘膜的DNA放入小(1-2mm"紙片上。從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC;Manassas,VA)獲得S0個(gè)人細(xì)胞系并按照ATCC的說明進(jìn)行保持。這些細(xì)胞系是AS283、BL2、Bla、BJAB、CA46、Namalva、P3HRI、PAPB682、PABm、Raji(伯基特淋巴瘤)、Dell、SKDHL、ST486(T細(xì)胞淋巴瘤)、JM(免疫母細(xì)胞性B細(xì)胞淋巴瘤)、MC116(未分化的淋巴瘤)、Molt3、Supt11(T-ALL)、U266(多發(fā)性骨髓瘤)、A549、H1299(肺癌)、TE2、TE10(食道癌)、HeLa(宮頸癌)、RC48(腎癌)和2220、2221、11609、11611、LNCAP、TSUR(前列腺癌)。C粉她應(yīng)^為、庠從經(jīng)歷常規(guī)扁桃體切除術(shù)的兒科年齡組(3-9歲)中的患者獲得扁桃體。通過用神經(jīng)氨酸酶處理的綿羊紅細(xì)胞簇簇生化(rosetting)單核細(xì)胞來獲得純化的B細(xì)胞。通過Dono，M.,等人，/.//鵬Mo/.76《5596-5604(2000)(其全部/>開內(nèi)容在此引用作為參考)中描述的不連續(xù)Percoll梯度法(PharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)進(jìn)一步分級分離B細(xì)胞。將從50%Percoll級分收集的B細(xì)胞與抗CD5mAb—起溫育，然后再與綴合有磁性微珠的山羊抗小鼠Ig—起溫育。通過4吏用MiniMACS系統(tǒng)(MiltenyiBiotec)收集磁性柱子MS上保留的細(xì)胞進(jìn)行正選擇(positiveselection)來獲得CD5+B細(xì)胞。按照常規(guī)方法產(chǎn)生體細(xì)胞雜種，然后在Negrini，M.，等人，Ca"cerWes.1818-1824(1994)(其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考)中描述的次黃嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。使用DNeasytissue試劑盒(Qiagen)分離來源于單個(gè)細(xì)胞克隆和亞克隆的DNA，并就染色體13和染色體2標(biāo)記的存在或不存在對其進(jìn)行PCR篩選(關(guān)于引物序列參見表3)。從具有t(2;13)(q32;q14)易位的CLL病例(CLL-B)的融合物分離15個(gè)克隆，從具有t(2;13)(ql2;q13)易位的另一個(gè)CLL病例(CLL-A)的融合物中分離1個(gè)克隆。12個(gè)CLL-B來源的克隆具有染色體13和2的完全互補(bǔ)物，然而3個(gè)具有del(13q)和染色體2的完全互補(bǔ)物。來自CLL-A的單個(gè)克隆具有染色體13，所述染色體13在13q14具有小的缺失的染色體13但無染色體2的部分。使用Tri-Reagent方案(MolecularResearchCenter,Inc)進(jìn)行總RNA的分離。將RM樣品(各自30pg)在15%的丙烯酰胺變性(尿素)標(biāo)準(zhǔn)預(yù)制凝膠(Criterionprecastgel)(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)上跑膠，然后轉(zhuǎn)移至Hybond-N+膜(AmershamPharmaciaBiotech)。在42。C下于7%SDS，0.2MNa2P04pH7.0中進(jìn)行使用a-"PATP的雜交，進(jìn)行過夜。在42'C下，在2xSSPE，0.1。/oSDS中洗滌膜2次，然后用0.5xSSPE，0.1。/。SDS洗滌2次。用于檢測miR15和miR16RNA的探針分別是CACAAACCATTATGTGCTTGCTA(SEQIDNO:5);和GCCAATATTTACGTGCTGCTA(SEQIDNO:6)通過在0.l%SDS/0.lxSSC水溶液中煮沸IO分鐘來剝離印跡，再探測印跡數(shù)次。作為上樣對照，使用用溴化乙錠染色的5SrRM。逆轉(zhuǎn)^凝炎合雜^^;^:^"7W^"進(jìn)行RT-PCR以分析正常CD5+細(xì)胞和23B-CLL樣品中的基因表達(dá)水平。對于使用Advantage2PCR試劑盒(Clontech)的各擴(kuò)增反應(yīng)，使用1微升的cDNA，使用10pmol的各基因特異性引物進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94X:下進(jìn)行20秒，65'C下進(jìn)行30秒，下進(jìn)行1分鐘(關(guān)于使用的引物列表，參見下面的表3)。為了確保RNA對于RT-PCR是足夠純的，使用利用對于PCRG3PDHcDNA(Clontech，PaloAlto,CA)是特異性的引物進(jìn)行的PCR測定。按照Sambrook，J.，爭乂(1989)，(同上)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法通過瓊脂糖凝膠電泳分離RT-PCR產(chǎn)物。ITe"ei72伊遊法用GST-SLUGMiddle抗體(來自Dr.ThomasLook-Harvard,MA的贈(zèng)品)和SNX2(N17)抗體(SantaCruzBiotechnology,CA)探測來自9個(gè)B-CLL患者的細(xì)胞裂解物的SDS/PAGE凝膠。按照廠商說明書使用ECLWestern印跡檢測試劑盒(AmershamPharmacia,UK)進(jìn)4亍檢測。炎凝為、浙使用通過由美國國立衛(wèi)生研究院和國立醫(yī)學(xué)圖書館維持的美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站獲得的BLAST比對工具進(jìn)行對"nr"和"dbEST，，數(shù)據(jù)庫的搜索和針對短的、幾乎完全的配對的搜索。也參見Altschul，等人，/.#o7.Wo人"i":403-10(1990)和Altschul,等人，#"c/e/c力C2'^Wes.3389-3402(1997),其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考。也使用由BiologyworkBench網(wǎng)站提供的FASTA比對工具進(jìn)行對短序列的同源性的搜索。表3用于篩選體細(xì)胞雜種的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>實(shí)施例1:CLL患者的體細(xì)胞雜種中的30kb缺失區(qū)域CLL患者中13ql4上的最小丟失區(qū)域一直不清楚。之前，在CLL中已描述13ql4中缺失的不同的和相對大(130至550kb之間)的區(qū)域(參見圖2B)。使用LOH和Southern印跡分析鑒定Alul8基因座上的純合子丟失的著絲粒邊界(圖2D)，該丟失位于/^57U0和Z7J5772之間，與j^W基因的外顯子5相距少于65kb的centromeric。然而，沒有發(fā)現(xiàn)允許靶腫瘤抑制基因的更好的定位的小的或重疊的純合子缺失。為更好地確定CLL中的丟失區(qū)域，產(chǎn)生小鼠LM-TK—與具有13qH易位和/或缺失的CLL細(xì)胞的體細(xì)胞雜種。所得的雜種克隆的PCR篩選允許分離存在于腫瘤中的染色體13的兩個(gè)拷貝。如此，在一個(gè)案例中鑒定了31.4kb缺失，在另一個(gè)案例中精確地定位了染色體斷裂點(diǎn)(圖2D)。這些結(jié)果表明13ql4腫瘤抑制基因位于ZA"基因的外顯子2和5之間的29kb區(qū)域內(nèi)。表3中提供了用于篩選體細(xì)胞雜種的引物。如圖2中所示，體細(xì)胞雜種中的缺失的區(qū)域與所有報(bào)導(dǎo)的丟失區(qū)域一致，包括Liu，等人，。/coge/7eJ夕2463-2473(1997)幾年前報(bào)導(dǎo)的10kb區(qū)域。i^W的外顯子l和2也存在于該區(qū)域內(nèi)，并且存在于此處定義的區(qū)域內(nèi)。然而，已排除作為B-CLL的可能的候選腫瘤抑制基因(參見Bullrich，等人，Ca/7ceries.":6640-6648(2001);Migliazza，等人，Blood夕7:2098-2104(2001);Wolf，等人，^u邁.Ce/eLJft1275-1285(2001);和Mertens，等人，Wooi/"4116-4121(2002))。實(shí)施例2:miR15和miR16基因位于染色體13的最低限度缺失區(qū)域并且在CD5+細(xì)胞中高度表達(dá)就13ql4上最小的丟失區(qū)域中的新的調(diào)控基因篩選公共可獲得的序列信息和數(shù)據(jù)庫。兩個(gè)最近克隆的miRM基因miR15和miR16的基因簇恰好位于缺失的區(qū)域(圖2A)。為估量正常組織中miR15和miR16的表達(dá)水平，在系列正常組織(包括從正常個(gè)體的扁桃體分離的CD5+B細(xì)胞)上進(jìn)行miR15和miR16RNA的Northern印跡分析(圖3A)。CD5+B細(xì)胞用作對照，因?yàn)锽-CLL的特征在于CD5+B-淋巴細(xì)胞的累進(jìn)積累。發(fā)現(xiàn)miR15和miR16基因的表達(dá)普遍存在，在正常CD5+淋巴細(xì)胞中具有最高水平。此外，在正常組織中，miRl6始終以高于miRl5的水平表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明miR15和miR16基因在正常CD5+B-細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡中起著重要作用。實(shí)施例3:miR15和miR16基因經(jīng)常缺失或在于13ql4上具有缺失的CLL樣品中下調(diào)為調(diào)查miR15和niiR16基因是否參與CLL的發(fā)病機(jī)理，使用Northern印跡法就miR15和miR16的表達(dá)對60個(gè)CLL才羊品和30個(gè)人癌細(xì)胞系進(jìn)行分析(圖3B)。68%的CLL患者(41/60)以及6個(gè)分析的前列腺癌細(xì)胞系中的5個(gè)顯示當(dāng)與其正常的組織對應(yīng)物比較時(shí)，表達(dá)顯著減少。這些發(fā)現(xiàn)證明ffliR15和miR16基因在大部分受試B-CLL和前列腺癌病例中下調(diào)。此外，60個(gè)CLL樣品中的23個(gè)(38%)提供了代表miRl5前體RNA的大約"70nt的清晰可鑒定的條帶。在除了骨髓外的任何分析的正常組織中未發(fā)現(xiàn)該70ntmiR15條帶(圖3A)，這表明miR15前體RNA在CLL中不能^f皮有效地加工。為確定CLL中觀察到的表達(dá)的下調(diào)是否與等位基因丟失相關(guān)，使用微衛(wèi)星標(biāo)記貝J5772和/7J5^7J對46個(gè)可從其獲得正常DNA的CLL患者進(jìn)行LOH研究(圖3B)。我們發(fā)現(xiàn)68%的提供信息的樣品在至少一個(gè)標(biāo)記上展示L0H(35個(gè)案例中的24個(gè))。在幾乎4個(gè)樣品(75%)中，miR15/16基因產(chǎn)物的表達(dá)被減少。對于12個(gè)樣品，由于起始材料的較差的質(zhì)量導(dǎo)致未獲得重現(xiàn)性結(jié)果。此外，在11個(gè)案例中的6個(gè)案例(55%)中，表達(dá)水平減少而無顯著的L0H。在這些情況下，缺失可能太小以至于不能用分析的標(biāo)記檢測。Northern印跡分析顯示在存在已知的13ql4上的大純合子缺失的情況下和在低于5%的正常細(xì)胞中miR15和miR16基因產(chǎn)物都表達(dá)，表明其他高度相似的大RNA基因存在于基因組中。事實(shí)上，已報(bào)導(dǎo)與miR15/miR16基因蔟非常相似(但具有不同的前體)的基因簇在染色體3q25-26.1上(參見Lagos-Quintana，等人，"TSS-YSS(2002))。為了顯示miR15/16基因表達(dá)的變化與染色體13q上的缺失嚴(yán)格相關(guān)，設(shè)計(jì)和使用對于染色體13上的miR16前體RNA和從染色體3上的基因產(chǎn)生的miRNA前體RNA是特異性的探針來探測Northern印跡。盡管在較低的水平上檢測到來自染色體13的miR16前體RNA，但在相同的樣品中未發(fā)現(xiàn)與染色體3的探針的特異性雜交。此外，使用兩個(gè)橫跨緊靠著絲粒的2Mb的區(qū)域的微衛(wèi)星標(biāo)記對該基因簇進(jìn)行L0H研究。17個(gè)提供信息的樣品中的4個(gè)在至少一個(gè)標(biāo)記中顯示了L0H，未發(fā)現(xiàn)與miR15/16的表達(dá)水平的相關(guān)性。這些數(shù)據(jù)清楚地證明CLL中miR15和miR16基因表達(dá)的下調(diào)與13ql4上的等位基因丟失相關(guān)，從而提供了miR15和miR16基因產(chǎn)物在CLL發(fā)病機(jī)理中的作用的證據(jù)。實(shí)施例4:miR15和miR16也參與小鼠中的CLL發(fā)病才幾理為進(jìn)一步調(diào)查miR15和miR16基因是否參與CLL發(fā)病機(jī)理，將研究擴(kuò)展至發(fā)生CLL的Ep-TCL1轉(zhuǎn)基因小鼠(Bichi，等人，Jcad.&2'.MOW:6955-6960(2002))。在Eju-TCL1轉(zhuǎn)基因小鼠中檢查細(xì)胞遺傳和遺傳改變。如上所述進(jìn)行Northern印跡分析(參見實(shí)施例-"^"力"/3伊遊法"，和實(shí)施例3)。在大約80%的轉(zhuǎn)基因小鼠中，與正常小鼠脾淋巴細(xì)胞相比，在CLL細(xì)胞中miR15和miR16的小鼠同源物的表達(dá)減少。這些結(jié)果與實(shí)施例3中關(guān)于ffliR15和miR16在人CLL和正常樣品中的表達(dá)所描述的結(jié)果相似。在小鼠染色體15和人染色體12之間進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)基因小鼠白血病的對比基因雜交4支術(shù)(Comparativegenehybridization)(CGH)顯示大約35%具有小鼠染色體15的區(qū)域(其相應(yīng)于人染色體12的區(qū)域)的擴(kuò)增。這些小鼠白血病的細(xì)胞遺傳學(xué)分析也顯示小鼠染色體15的三體性或四體性。已知染色體12的三體性在大約25。/。的人CLL中發(fā)生。對比基因雜交也顯示相應(yīng)于人中的區(qū)域13ql4的小鼠染色14的區(qū)域(51.6-78.5Mb)的丟失。研究結(jié)果顯示CLL小鼠模型概述了在人CLL的發(fā)病機(jī)理中發(fā)生的事件?？傮w來說，實(shí)施例1至4中提供的數(shù)據(jù)提供了miR15和miR16在哺乳動(dòng)物的CLL發(fā)病機(jī)理中的作用的證據(jù)。實(shí)施例5-8中使用下列技術(shù)患者樣品在征得同意后，在CLL研究聯(lián)合體研究所從診斷具有CLL的受試者獲得26個(gè)CLL樣品。簡而言之，從CLL患者獲得血液，通過聚蔗糖/泛影鈉梯度離心(AmershamPharmaciaBiotech)分離單核細(xì)胞，按照所描述的方案(SambrookJ.，爭人MolecularCloning:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborUb，Press,Plainview，NY(1989)處理所述細(xì)胞以進(jìn)行RNA提取。將包含來自兩個(gè)不同的正常個(gè)體的各個(gè)體的005陽性細(xì)胞的正?；旌衔镉米鲗φ铡谋馓殷w淋巴細(xì)胞制備005+B細(xì)胞。簡而言之，在征得同意后，從經(jīng)歷常規(guī)扁桃體切除術(shù)的兒科年齡組(小于18歲)的患者獲得扁桃體。通過用神經(jīng)氨酸酶處理的綿羊紅細(xì)胞(SRBC)簇生化來自單核細(xì)胞(MNCs)的T細(xì)胞來制備純化的B細(xì)胞群體。為了獲得005+B細(xì)胞，如所描述的，將純化的B細(xì)胞與抗CD5單克降抗體(mAb)—起溫育，然后與綴合磁性微珠(MiltenyiBiotec，Auburn,CA)的山羊抗小鼠Ig—起溫育。通過使用MiniMACS系統(tǒng)(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)收集保留在磁性柱子MS上的細(xì)胞來正選擇005+B細(xì)胞。如由流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)所估量的，細(xì)胞群體的純化程度高于95%。BCL2的Western印跡使用小鼠單克隆抗BCL2抗體(Dako)定量BCL2蛋白的水平，然后4吏用用于Western印跡的才示準(zhǔn)方法(Sambrook，J.，^^乂MolecularCloning:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLab,Press,Plainview，NY(1989))利用笫二小鼠單克隆抗BCL2抗體(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz，CA)進(jìn)^f亍確認(rèn)。4吏用小鼠單克隆抗肌動(dòng)蛋白抗體(Sigma)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用ImageQuantTL(NonlinearDynamicsLtd.)定量條件強(qiáng)度。RNA提取、Northern印跡和mi廳CHIP實(shí)驗(yàn)如(Calin，G.A.，爭入尸roc.#"人JcsAK&丄_9義15524-15529(2002);Liu，C.G.,等人，戶roc^〃.JcaASc/〃.&^嵌9740-9744(2004);Calin，G.A.，7V""人hcT.5W-A11755-11760(2004))中所述進(jìn)行方法。簡而言之，將來自5pg總RNA的標(biāo)記的靶用于在各ffliRNACHIP微陣列芯片上進(jìn)行雜交，所述miRNACHIP微陣列芯片以一式三份重復(fù)包含相應(yīng)于245個(gè)人和小鼠miRNA基因的368個(gè)探針。在GeneSpring⑧軟件版本7.2(SiliconGenetics,RedwoodCity,CA)中標(biāo)準(zhǔn)化和分析原始數(shù)據(jù)。使用Bioconductorpackage(www.bioconductor.org)的GeneSpringnormalizationoption或GlobalMediannormalization使表達(dá)數(shù)據(jù)以中位數(shù)為中心(mediancentered)不存在任何本質(zhì)差異。使用GeneSpringA麗A工具和SAM軟件(SignificanceAnalysisofMicroarray，wwwstat.Stanford,edu/~"bs/SAM/index.html)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。如Calin，G.A.，等人，/Voc.Sc/.11755-11760(2004)中所才艮導(dǎo)的，使用Northern印跡法就邊ir-7《-7和邊/r-Wa驗(yàn)證微陣列數(shù)據(jù)。mir-16-l/mir-15a表達(dá)載體通過將相關(guān)的讀框以有義方向連接入哺乳動(dòng)物的表達(dá)載體pSR-GFP-Neo(01igoEngine，Seattle,WA)來構(gòu)建野生型(mir-16-l-WT)和突變型(mir-16-l-MUT)邊/r-^^-7/邊/r-7Ja表達(dá)載體。各構(gòu)建體包含含有邁/V-M-J和邁yr-Ws的832bp的基因組序列。突變型構(gòu)建體在邊/r-7卜7的3'區(qū)域中的+7堿基對上包含C至T的置換。在通過測序確認(rèn)后，按照廠商的說明書(Invitrogen，Carlsbad，CA)使用Lipofectamine2000將各構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入293個(gè)細(xì)胞中。如實(shí)施例5中所述，通過Northern印跡分析估量兩種構(gòu)建體的表達(dá)。GFP水平的Western印跡分析用于顯示野生型和突變型pRS-neo-GFP構(gòu)建體以相同的功效進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染測定法在37。C下，在含有5。/。C02的潮濕氣氛中，在10Q/。FBS(于補(bǔ)充以1X非必需氨基酸和lmmol丙酮酸鈉的RPMI-16々0培養(yǎng)基中)中培養(yǎng)人巨核細(xì)胞(MEG-Ol)。按照廠商的說明書4吏用siP0RTneoFX(Ambion)，用0.4jtg熒火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體(Promega)和O.08pg包含腎熒光素酶的對照載體pRLTK(Promega)在12孔板中共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。對于各細(xì)胞，使用10nM的mir-16-l-有義(5,-uagcagcacguaaauauuggcg-3,;SEQIDNO:341)和/或mir-15a有義(5,-uagcagcacauaaugguuugug-3,;SEQIDNO:342)(Dharmacon)或miR-15a反義和/或miR-16-l反義前體miRM抑制劑(Ambion)。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，使用Dual-熒光素酶測定(Promega)連續(xù)測量熒光蟲熒光素酶和腎螢光素酶的活性。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)為了產(chǎn)物熒光素報(bào)告基因構(gòu)建體，通過PCR從人基因組DNA擴(kuò)增BCL2基因的3'UTR的546個(gè)堿基對的片段，其然后使用緊接熒光素酶的終止密碼子下游的Xbal位點(diǎn)將其插入pGL3對照載體(Promega)。下列引物組用于產(chǎn)生特定片段BCL2-UTRF25'-CTAGTCTAGAGCCTCAGGGAACAGAATGATCAG-3'(SEQIDN0:343);和BCL2-UTRR2(5'-CTAGTCTAGAAAGCGTCCACGTTCTTCATTG-3。SEQIDNO:344)。也使用QuikChangeXL定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene)產(chǎn)生分別從與/z7^-Ua和/B/y^^-J互補(bǔ)的位置缺失5bp和9bp的兩種BCL2插入物(圖4A)。通過測序確認(rèn)野生型和突變型插入物。實(shí)施例5:邊/i-7^和/g/i-7《-7展示與BCL2轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域互補(bǔ)并且顯示與BCL2蛋白的表達(dá)模式反相關(guān)的表達(dá)模式通過同源性檢索將兩種microRNA(邁ir-7f-7和/n/i-J5"a)鑒定為具有對BCL2raRNA序列的同源性。特別地，發(fā)現(xiàn)兩種miRNA的5'末端上的前9個(gè)核苷酸與人Bc12cDNA克隆NM-000633的堿基3741至3749互補(bǔ)(圖4A)。BCL2轉(zhuǎn)錄物中的該核苷酸區(qū)域在小鼠中是保守的(圖4A)。/Z7/i-"詠/Z72'i-M-么來自染色體3q26的第二基因簇的兩個(gè)成員，都鑒定為具有對Bcl2轉(zhuǎn)錄物的相同區(qū)域的互補(bǔ)性。為了估計(jì)邁/r-W-J和/或/z/r-UamiRNA是否與BCI^轉(zhuǎn)錄物相互作用，我們首先確定在CLL細(xì)胞和正常CD5陽性淋巴細(xì)胞中邊/;-"(2///>-"-/的表達(dá)水平和8(;12蛋白的水平之間是否存在相關(guān)性。在正常CD5陽性B淋巴細(xì)胞中，來自染色體13ql4的基因簇高度表達(dá)，然而邁/V-7J6和z/W-J^-憤體幾乎不能通過Northern印跡分析檢測到(Calin，G.A.，等人，JcacT.做乂夕義15524-15529(2002))。通過miRNACHIP分析和Western印跡法，分析成組的30個(gè)樣品，包括26個(gè)CLL樣品和4個(gè)來自未受影響的個(gè)體的扁桃體的正常CD5陽性淋巴細(xì)胞。在正常的CDS陽性淋巴細(xì)胞中，//^^^和邁/^-"-2miRNA的水平都很高。相反地，Bcl2蛋白以非常低的水平表達(dá)。然而，在大部分白血病細(xì)胞中，邁/^-J^和邁/W-^^-J都以低水平表達(dá)，而BcU蛋白過度表達(dá)(圖4B和表4)。此外，在所有被分析的白血病樣品中，我們發(fā)現(xiàn)了邁^-Ua/kV-J^"/的表達(dá)水平與Bcl2的表達(dá)水平之間的負(fù)相關(guān)性(表4)。因此，在CLL樣品中，普遍觀察到zzz/i-Us和iZ7i'i-^dW的表達(dá)水平的下調(diào)和Bcl2蛋白的過度表達(dá)。表4在26個(gè)CLL樣品與兩個(gè)正常CD5細(xì)胞庫'的組中，通過Western印跡產(chǎn)生的BCL2蛋白表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化值和通過miRNACHIP產(chǎn)生的miR-15a和miR-16-l的表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化值。SanameBcl2/ACT咖-l(Mchipmk-15achipmirl(5氾d2/ACTmirl5/Bd2/ACTni+;n20力693-5142—0855.25m+N20.0593.51(59.2765.83N3環(huán)0.076.242.330.81CLLiCM514.281.117.041.821—022.651.172-611.15CLL30.171.1218.40譜CLL40-672.651.171-75CLL50.673.271-34.881.94CLL62.951.421.020.480.35CLL71.923.531.51這0.79CLL81.274341.243.430鄰CLL81.504.31-262.86幽CLL92.2<52.5LlCL49CLLIO3.531.170.910-330.26CLL112-501.21-010.48o.鄰CLL1210.261.57(U50.11CLL137—851-81.170.2.30.15cll142-863.280.991.150.35CLL151—2S9.12.627—092.04CLL1(5l橘2.21.150.1S0.08-T"170.991.54l鄰1.551.09CLL187.001.461-070.210—15CLL191.972.711.221-370.62CLL200-563.0SL125.502-00CLL210.652.431.263.71CLL220—793.081.133.921.441.302.21-151.690.88CLL241.880.920.870.490.46CLL258.4S5-03(X590.20CLL260.177-64l.的43.709.67'-Nl、N2、N3和N4-正常CD5樣品；CLL1-CLL26=慢性淋巴細(xì)胞性白血病。以任意單位表示數(shù)據(jù)。以一式兩份重復(fù)檢測兩種樣品，例如，一種正常的混合物和樣品CLL8，以估量數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。使用ImageQuantTL(NonlinearDynamicsLtd.)定量Western印跡(WB)的條帶強(qiáng)度。使用Bioconductorpackage(www.bioconductor.org)的GeneSpringnormalizationoption和GlobalMediannormalization使表達(dá)數(shù)據(jù)以中位數(shù)為中心不存在任何本質(zhì)差異。實(shí)施例6:microRNAs,/g^KJa和/p^-Jf-7的表達(dá)減少了轉(zhuǎn)染的MEG-01細(xì)胞中的BCL2蛋白的表達(dá)為調(diào)查表達(dá)包含邊"^^a/歷/A-^^-J的完全基因簇對Bcl2的表達(dá)的影響，使用MEG-01細(xì)胞，所述細(xì)胞是表達(dá)高水平的Bcl2但由于miR-15a/16-l基因座的一個(gè)等位基因的丟失和另一個(gè)等位基因的改變而不表達(dá)/772-7Ja或/z/A-W-J的急性白血病來源的細(xì)胞系。用pSR-miR-15/16-WT栽體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的MEG-Ol細(xì)胞與野生型MEG-Ol細(xì)胞(MEG-01WT)和用空載體轉(zhuǎn)染的MEG-Ol(MEG-01-pRS-neo-GFP)相比，展示高度減少的Bc12的水平(大約7%的標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá))(圖5A)。為確認(rèn)該效應(yīng)，轉(zhuǎn)染包含miR-16-l中的+7(C至T)種系置換(germlinesubstitution)的相同表達(dá)載體(pSR-miR-15/16-MUT)，所述置換在家族CLL的情況下被檢測到(Calin，G.C.，等人，凡f/^/./.，已接受等待印刷出版)并且強(qiáng)烈地減少兩種miRNA的表達(dá)。如所預(yù)期的，Bcl2的水平與WT野生型細(xì)胞或用空載體轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞中的Bcl2的水平相當(dāng)(75。/。的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá))(圖5A)。此外，用pSR-miR-15a/16-lWT轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示內(nèi)源性凋亡途徑的激活(如通過APAF1-半胱天東酶9-PARP途徑的激活確定的)。對照樣品包括用突變型構(gòu)建體(pSR-ffliR-15/16-MUT)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的樣品都不顯示這些促凋亡蛋白的水平的改變(圖5A)。為確定yz7/i-Ua和邊W-7^WmiRNA是否都影響B(tài)cU蛋白的表達(dá)，我們將/z72'A-Ua和邁/i-^^-J有義或反義寡核苷酸RNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入MEG-01200680039776.8說明書第75/82頁細(xì)胞。如圖5B中所示，miR-15a-有義和miR-16-l-反義寡核苷酸的分開的轉(zhuǎn)染完全消除了Bcl2的表達(dá)，而兩種miRNA的反義RNA的轉(zhuǎn)染都不影響B(tài)cl2的表達(dá)。當(dāng)共轉(zhuǎn)染兩種有義RNA或兩種反義RNA時(shí)獲得相似的結(jié)果(圖5B)，這確認(rèn)了邊/^^^々邁/A一6-JmiRNA都影響B(tài)cl2蛋白的表達(dá)。實(shí)施例7:microRNA，iz/i-J^和邁/i^^-7,與BCL2轉(zhuǎn)錄物的3'UTR之間的直接相互作用的證據(jù)可通過直接作用(即，miRNA通過miRNA::mRNA互補(bǔ)性直接對Bc12轉(zhuǎn)錄物的雜交)或通過間接相互作用(即，邊^(qū)-"a和/^V-W刁與另一個(gè)靶的相互作用，從而導(dǎo)致Bcl2水平的下調(diào))解釋在邁/)-7i"a和/ff/i-J6-7表達(dá)后Bcl2蛋白的水平下調(diào)。為了區(qū)分這些可能性，將來自人Bcl2的3'UTR(SEQIDNO:55的核苷酸3064至3599)的536bp的序列(所述序列顯示與邁/^-7i"a和邊/)-7(5"-JmicroRNA的互補(bǔ)性)融合至熒光素酶才艮告基因。任一種miRNA和BCL2mRNA之間的相互作用應(yīng)當(dāng)減少螢火蟲熒光素酶的活性(其為相對轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的Renilla熒光素活性標(biāo)準(zhǔn)化的活性)，同時(shí)任一種miRNA不能與BCL2mRNA相互作用應(yīng)當(dāng)不影響才艮告基因的表達(dá)。圖6A和6B中顯示的數(shù)據(jù)符合邁/i-7允/iZ72')-76-7miRNA和BCL2轉(zhuǎn)錄物之間的直接相互作，因?yàn)榕c對照載體相比，在用任一種或兩種microRNA轉(zhuǎn)染后觀察到熒光素活性的顯著抑制。使用兩種類型的突變的靶fflRNA序列進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)，所述靶mRNA缺少邁/i-7Ja和范/i-7f-J中與BCL2cDNA互補(bǔ)的9個(gè)(3'M1)或5個(gè)(3'M2)堿基。如所預(yù)期的，兩種突變體完全消除了邁W-"a和邁"-"-7與BCL2的3'UTR之間的相互作用(圖6B)。這些數(shù)據(jù)表明邁/及-7"和/zz/i-microRNA都直接與BCL2的3'UTR相互作用。影響B(tài)cl2基因的易位增加了兩種信使RNA和蛋白質(zhì)的水平(Tsujimoto，Y.，等人，Sc/e/ce22《1440—1443(1985))。因?yàn)樽罱@示miRNA可通過影響mRNA翻譯或mRNA的穩(wěn)定性下調(diào)特定的靶(Lim，L.P.，等人，磁769-773(2005))，檢測miR15a/16-l相互作用通過mRM的穩(wěn)定性下調(diào)BCL2的可能性。使用來自用pSR-miR-15/16-WT或特定的邁/iKJa和/zz/yK^-JRM寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的提取物通過RT-PCR擴(kuò)增來估量BCL2mRNA的水平。在對照細(xì)胞(例如，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或用空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)和用這些載體中的任何載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之間沒有觀察到Bcl2表達(dá)水平的差異(圖6A)。這些結(jié)果表明邁/^-/5^和邁/)-"-7不影響inRNA的穩(wěn)定性，但可能影響B(tài)c12mRNA的翻譯。實(shí)施例8:假定的microRNA/BCL2相互作用的鑒定在人基因組中，存在miRM的mir15/16家族的4個(gè)成員，其全都具有與Bcl2轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域互補(bǔ)的相同的9bp序列。該功能冗余表明存在調(diào)節(jié)Bcl2表達(dá)的非常精細(xì)的機(jī)制。此外，通過使用靶預(yù)測軟件(TargetScan(Lewis,B.P.，等人，徴15-20(2005)),BCL2鑒定為14種不同miRNA(包括沼VW和邁Ar")的潛在的靶(表5)。這些發(fā)現(xiàn)表明其他microRNA可在不同細(xì)胞類型中調(diào)節(jié)Bcl2蛋白的表達(dá)。表5.通過不同的靶預(yù)測程序預(yù)測的miRNA::BCL2相互作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>'注意TargetScan(MIT)的網(wǎng)址為genes.mit.edu/targetscan/PicTar(NewYourUniversity)的網(wǎng)址為pictar.bio.nyu.edu/和Miranda(MemorialSloan-KetteringCancerCenter)網(wǎng)址為www.microrna.org/.N/A-預(yù)計(jì)不可獲得的。此處提供的數(shù)據(jù)表明作為microRNA(例如，/z/"-JJs、邁/A-J(5W)下調(diào)的結(jié)果Bc12的過度表達(dá)是促成人B-CLL的發(fā)病機(jī)理的重要機(jī)制。值得注意的是，在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)的情況下也報(bào)導(dǎo)了的范/W-Ua和邁/i-^^一J下調(diào)(Eis，P.S.，等人，TVocJcaASc/.咖緩3627—3632(2005))。因此，作為microRNA(例如，邁/A-"a、邊"^卜7)下調(diào)的結(jié)果的Bcl2的過度表達(dá)可能參與其他人惡性腫瘤。實(shí)施例9:人細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物的表達(dá)按照Zeng，等人，#o/.Ce〃義1327-1333(2002)(其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考)的方法將編碼一種或更多種完整的miR前體RNA的cDNA分別克隆入在細(xì)胞巨化病毒立即早期(CMV-1E)啟動(dòng)子的控制之下表達(dá)的不相關(guān)mRNA的背景。簡而言之，將XhoI連接體置于編碼miR前體的雙鏈cDNA序列的末端，然后分別將這些構(gòu)建體克隆入存在于pBC12/CMV質(zhì)粒中的XhoI位點(diǎn)。在Cullen，(1986)，Ce//973-982(其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考)中描述了pBC12/CMV質(zhì)粒。包含miR前體RNA序列的質(zhì)粒稱為pCMV-miR(例如，用于miR-16-1的pCMV-miR16)。^吏用FuGene6試劑(Roche)通過標(biāo)準(zhǔn)才支術(shù)將一種或更多種pCMV-miR構(gòu)建體分別轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)的人293T細(xì)胞。如上所述提取總RNA，然后使用miR特異性探針通過Northern印跡分析檢測加工的microRNA的存在。也將一種或更多種pCMV-miR構(gòu)建體分別轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)的人癌細(xì)胞系(例如，癌細(xì)胞系2220、2221、11609、11611、LNCAP、TSUR)。如上所述提取總RM，然后使用miR特異性探針通過Northern印跡分析檢測加工的microRNA在癌細(xì)胞中的存在。也就形態(tài)學(xué)的變化、克力良接觸抑制的能力和其他標(biāo)志轉(zhuǎn)化表型的標(biāo)記評價(jià)轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞。實(shí)施例10:使用miR基因產(chǎn)物對BCL2相關(guān)癌細(xì)胞進(jìn)行的轉(zhuǎn)染分離來自診斷患有BCL2相關(guān)癌癥的受試者的BCL2相關(guān)癌細(xì)胞，然后如下用編碼一種或更多種microRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞。如上所述分離CD5+B,通過目視檢查(如果癌癥是CLL，按照Matutes，等人，Zewle/z/ya》1640-1645(1994)(其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考)的評分系統(tǒng)通過確定CLL評分)鑒定BCL2相關(guān)癌細(xì)胞(例如，CLL細(xì)胞)。具有至少4的CLL評分的CD5+B細(xì)胞纟皮認(rèn)86為是CLL細(xì)胞。通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用miR表達(dá)構(gòu)建體(例如，pCMV-miR15、pCMV-miR16)轉(zhuǎn)染分離的BCL2相關(guān)癌細(xì)胞。如上所述提取總RNA,然后使用對于特定miR(例如，miR-15a、miR-16-l)是特異性的探針通過Northern印跡分析檢測加工的microRNA的存在。也使用對于某些miR基因序列是特異性的探針通過Southern印跡雜交來確認(rèn)miR基因序列的穩(wěn)定整合。實(shí)施例11:使用miR基因產(chǎn)物對造血干細(xì)胞進(jìn)行的轉(zhuǎn)染如下從骨髓獲得來自診斷具有BCL2相關(guān)癌癥(例如，CLL)的受試者的造血干細(xì)胞(HSC)。在手術(shù)室中使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)在全身麻醉的情況下從受試者的髂骨(iliacbone)獲取骨髓。將多次抽吸總共大約750至1000ml的骨髓放入肝素化的注射器。立即將吸出的骨髓轉(zhuǎn)移入包含每100ml運(yùn)載液(transportmedium)10，000個(gè)單位的無防腐劑的肝素的運(yùn)載液(TC-199，Gibco，GrandIsland,NewYork)。將吸出的骨髓通過3個(gè)逐漸變細(xì)的篩子進(jìn)行過濾，從而獲得不含細(xì)胞聚集體、碎片和骨顆粒的細(xì)胞懸浮液。然后將過濾的骨髓在自動(dòng)化的細(xì)胞分離器(例如，Cobe2991毛細(xì)腔式洗片器(CellProcessor))中進(jìn)行進(jìn)一步加工以獲得"血沉棕黃層"(即，不含紅細(xì)胞和血小板的白細(xì)胞)。通過如下使用免疫磁珠(DynalA.S.，Oslo,Norway)正選擇CD34+細(xì)胞來就部分富造血干細(xì)胞(HSC)部分富集血沉棕黃層制劑。將血沉棕黃層制劑懸浮于補(bǔ)充的oc培養(yǎng)基中，并在輕輕倒轉(zhuǎn)試管的情況下，在4。C下與以1:20稀釋的小鼠抗HPCA-I抗體一起溫育45分鐘。在補(bǔ)充的oc培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞3次，然后與用山羊抗小鼠IgGi的Fc片段包被的小珠一起溫育(75pi免疫珠/107個(gè)CD34+細(xì)胞)。在4。C下溫育45分鐘后，按照廠商的指導(dǎo)。使用磁性顆粒濃縮器正選擇附著至小珠的細(xì)胞。在5ml聚丙烯試管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，將2x104個(gè)來自就HSC富集的制劑的細(xì)胞在總共0.4ml的包含2%的人AB血清和10mMHepes緩沖劑的Iscove，smodifiedDulbecco，s培養(yǎng)基(IMDM)中進(jìn)行溫育，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使用表達(dá)miR的構(gòu)建體(例如，pCMV-miR15、pCMV-miR16)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過Northern印跡分析確認(rèn)microRNA在部分轉(zhuǎn)染的HSC中表達(dá)，通過Southern印跡分析確認(rèn)miR基因序列穩(wěn)定地整合在部分HSC中。按照標(biāo)準(zhǔn)的骨髓移植技術(shù)將大約4x107kg體重至大約8x107kg體重的其余的轉(zhuǎn)染細(xì)胞再植入受試者。重復(fù)實(shí)驗(yàn)，但在轉(zhuǎn)染和移植之前用電離輻射從骨髓清除贅生性細(xì)胞。將血沉棕黃層制劑中的細(xì)胞在包含大約20%的自體血漿的TC-199中調(diào)節(jié)至大約2x107ml的細(xì)胞濃度。向細(xì)胞懸浮液中加入重組人造血生長因子rHIL-3或rHGM-CSF以刺激造血贅生物的生長，從而增加它們對電離輻射的敏感性。然后將細(xì)胞暴露于5-10Gy的電離輻射，在4'C下在包含大約20%的自體血漿的TC-199中洗滌一次，然后如上用表達(dá)miR的構(gòu)建體(例如，pCMV-miR15、pCMV-miR16)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)施例12:封裝microRM的脂質(zhì)體的制備浙浙J-按照美國專利4，235，871(其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考)中描述的反相蒸發(fā)法制備以1:1M:5的摩爾比的乳糖?；X苷脂、磷脂酰甘油、磷酸卵磷酯和膽固醇組成的脂質(zhì)體。在100lig/ml加工的microRNA或500jug/ml(例如，pCMV-miR15、pCMV-miR16)的水溶液中制備脂質(zhì)體。所制備的脂質(zhì)體包含加工的microRNA(例如，miR-15a、miR-16-lRNA)或表達(dá)microRNA(例如，pCMV-miR15、pCMV-miR16質(zhì)粒)的構(gòu)建體。然后將脂質(zhì)體通過0.4聚碳酸酯膜并且懸浮于鹽溶液中，然后通過在135mM氯化鈉，10mM磷酸鈉pH7.4中進(jìn)行柱層析來將其與未封裝的材料分離。使用脂質(zhì)體而無需進(jìn)一步修飾，或如下所述對其進(jìn)行修飾。將一些上面制備的脂質(zhì)體裝滿合適的反應(yīng)器，在攪拌的條件下向該反應(yīng)器中加入20mM高碘酸鈉、135mM氯化鈉和10mM磷酸鈉(pH7.4)的溶液。將所得的混合物在20'C的溫度下在黑暗處靜置90分鐘。通過反應(yīng)混合物對250ml的緩沖鹽溶液(135mM氯化鈉、10mM磷酸鈉，pH7.4)透析進(jìn)行2小時(shí)以除去過量的高碘酸鹽。產(chǎn)物是具有通過將糖類羥基氧化成醛基修飾的表面的脂質(zhì)體。通過這些醛基將耙向基團(tuán)或調(diào)理作用抑制部分綴合致脂質(zhì)體表面。##辨浙2如下獲得由順丁烯酰胺苯曱酸(maleimidobenzoyl)-磷脂酰乙醇胺(MBPE)、磷酸卵磷酯和膽固醇組成的第二脂質(zhì)體制劑。MBPE是用于將包含巰基的化合物包括蛋白質(zhì)偶聯(lián)至脂質(zhì)體的活化的磷脂。如Kitagawa，等人，/.A/oc力e邁.7義233-236(1976)(其全部公開內(nèi)容在此引用作為參考)中所述，將十四酰基磷脂酰乙醇胺(Dimyristoylphosphatidylethanolamine)(DMPE)(100亳摩爾)溶解在5ml包含2當(dāng)量的三乙胺和50mg順丁烯酰胺苯曱酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯的溶液中。然后在室溫下在氮?dú)夥障率顾玫姆磻?yīng)繼續(xù)進(jìn)行過夜，將所述反應(yīng)物在氯仿/曱醇/水(65/25/4)中的硅膠H(SilicagelH)上進(jìn)行薄層層析，這顯示DMPE至更快速的遷移產(chǎn)物的定量轉(zhuǎn)化。在減壓的條件下除去甲醇，將產(chǎn)物重新溶解于氯仿中。用1%氯化鈉和順丁烯酰胺苯曱酸-磷脂酰乙醇胺(MBPE)洗滌氯仿相2次，用使用氯仿/甲醇(4/1)作為溶劑的硅酸層析純化對其進(jìn)行純化。在純化后，薄層層析顯示單個(gè)的為水合茚三酮陰性的包含磷酸鹽的斑點(diǎn)。按照美國專利號4，235，871(同上)的反相蒸發(fā)法在100yg/ml加工的microRM的水溶液中或編碼microRNA的質(zhì)粒的溶液中以1:9:8的摩爾比用MBPE、磷酸卵磷酯和膽固醇制備脂質(zhì)體。通過在100mM氯化鈉-2mM磷酸鈉(pH6.0)中進(jìn)行柱層析來將脂質(zhì)體與未封裝的材料分離。實(shí)施例13:抗CD5+或抗前列腺腫瘤抗體至封裝miR基因產(chǎn)物的脂質(zhì)體的附著用1.1ml(包含大約IO毫摩爾)的具有醛基的脂質(zhì)體制劑l或上述的脂質(zhì)體制劑2裝滿合適的反應(yīng)器。在攪拌的條件下將0.2ml200mM氰基硼氫化鈉溶液和1.0ml3mg/ml針對CD5+細(xì)胞表面標(biāo)記或前列腺腫瘤細(xì)胞抗原的單克隆抗體溶液加入制劑。在保持4'C的溫度下使所得的反應(yīng)混合物靜置過夜。在BiogelA5M瓊脂糖柱(Biorad，Richmond,Ca.;1.5X37cm)上分離反應(yīng)混合物。實(shí)施例14:miR基因產(chǎn)物在體內(nèi)對人前列腺肺瘤生長的抑制將人激素抵抗性前列腺腺癌細(xì)胞系(PC-3)接種入棵小鼠，并將小鼠分成治療組和對照組。當(dāng)小鼠中的腫瘤達(dá)到100至250立方毫米時(shí)，將一種或更多種封裝在脂質(zhì)體中的加工的microRNA(例如，miR-15a、miR-16-l)直接注射入對照組的腫瘤中。用只封裝載體溶液的脂質(zhì)體注射對照組的腫瘤。在整個(gè)研究中測量腫瘤的體積。如下，也在DunningR-3327大鼠前列腺模型中評估m(xù)iR基因產(chǎn)物在抑制前列腺腫瘤生長中的功效。將DunningR-3327前列腺腺癌細(xì)胞的高度轉(zhuǎn)移和惡性的克隆(RT-3.l)接種入Copenhagen大鼠，然后將其分成治療和對照組。兩組大鼠在大約一周后都形成肺瘤塊。然后每周2次用封裝在脂質(zhì)體中的加工的microRNA注射治療組中的大鼠的腫瘤，進(jìn)行5周。用只封裝載體溶液的脂質(zhì)體注射對照組的腫瘤。在整個(gè)研究過程中測量腫瘤的體積。之前未引用作為參考的所有參考文獻(xiàn)的相關(guān)教導(dǎo)在此引用作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認(rèn)識到本發(fā)明特別適合進(jìn)行目的和獲得提及的結(jié)果和有利方面，以及其中固有的有利方面。本發(fā)明可以以其他特定的形式體現(xiàn)而不背離其精神或本質(zhì)屬性。權(quán)利要求1.增加具有BCL2相關(guān)癌癥的受試者中抗癌療法的功效的方法，其包括a)對受試者施用至少一種抗癌療法；和b)對受試者施用至少一種miR基因產(chǎn)物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；其中，抗癌療法的功效被增加。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a或miR-16-l。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR—137、miR-217、miR-186和其組合。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195和其組合。5.權(quán)利要求l的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與SEQIDNO:55的核苷酸3741-3749互補(bǔ)的核苷酸序列。6.權(quán)利要求l的方法，其中所述抗癌療法是化學(xué)療法。7.權(quán)利要求l的方法，其中所述抗癌療法是放射療法。8.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥是慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)。9.權(quán)利要求l的方法，其中所述癌癥是淋巴瘤。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述淋巴瘤選自濾泡性淋巴瘤、小細(xì)胞淋巴瘤、大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞和非何杰金淋巴瘤。11.權(quán)利要求l的方法，其中所述癌癥是肺癌。12.權(quán)利要求l的方法，其中通過相對于合適的對照，受試者中癌癥的增加的緩解證明抗癌療法的功效被增加。13.增加抗癌療法在具有BCL2相關(guān)癌癥的人類受試者中的功效的方法，其包括a)對受試者施用至少一種抗癌療法；和b)對受試者施用至少一種miR基因產(chǎn)物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；其中，抗癌療法的功效被增加。14.增加癌細(xì)胞對抗癌劑的細(xì)胞毒性效應(yīng)的敏感性的方法，其包括對癌細(xì)胞施用至少一種包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核普酸序列互補(bǔ)的核普酸序列的miR基因產(chǎn)物，其中細(xì)胞對抗癌劑的敏感性被增加。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a或miR-16-l。16.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其組合。17.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195和其組合。18.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與SEQIDNO:55的核苷酸3741-3749互補(bǔ)的核苷酸序列。19.權(quán)利要求14的方法，其中所述癌細(xì)胞相對于對照細(xì)胞展示增加的Bcl2蛋白的表達(dá)20.權(quán)利要求14的方法，其中所述癌細(xì)胞存在于受試者中。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述受試者是人。22.權(quán)利要求14的方法，其進(jìn)一步包括施用抗癌劑。23.權(quán)利要求22的方法，其中共施用至少一種miR基因產(chǎn)物和抗癌劑。24.權(quán)利要求14的方法，其中所述癌細(xì)胞選自CLL細(xì)胞、肺癌細(xì)胞和、淋巴瘤細(xì)胞。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述癌細(xì)胞是選自濾泡性淋巴瘤細(xì)胞、小細(xì)胞r淋巴瘤細(xì)胞、大細(xì)胞r淋巴瘤細(xì)胞和非何杰金、淋巴瘤細(xì)胞的、淋巴瘤細(xì)胞。26.權(quán)利要求14的方法，其中所述癌細(xì)胞是肺癌細(xì)胞。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述肺癌是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。28.權(quán)利要求14的方法，其中癌細(xì)胞是與選自急性髓細(xì)胞樣白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤、血液的惡性肺瘤、實(shí)體瘤、結(jié)腸直腸癌、腦癌、乳腺癌、前列腺癌、EB病毒相關(guān)淋巴細(xì)胞增生性疾病、腎癌、肝細(xì)胞癌和胃癌的癌癥相關(guān)的細(xì)胞。29.權(quán)利要求14的方法，其中通過癌細(xì)胞的死亡來證明癌細(xì)胞對抗癌劑的敏感性的增加。30.誘導(dǎo)細(xì)胞中的凋亡的方法，其包括將細(xì)胞與至少一種miR基因產(chǎn)物接觸，其中所述至少一種niiR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是raiR-15a或miR-16-l。32.權(quán)利要求30的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其組合。33.權(quán)利要求30的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、邁iR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、raiR-195和其組合。34.權(quán)利要求30的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與SEQIDNO:55的核苷酸3741-3749互補(bǔ)的核苷酸序列。35.權(quán)利要求30的方法，其中所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述癌細(xì)胞相對于對照細(xì)胞展示增加的Bcl2蛋白的表達(dá)。37.權(quán)利要求35的方法，其中所述癌細(xì)胞選自CLL細(xì)胞、肺癌細(xì)胞和'淋巴瘤細(xì)胞。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述癌細(xì)胞是選自濾泡性淋巴瘤細(xì)胞、小細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞和非何杰金淋巴瘤細(xì)胞的淋巴瘤細(xì)胞。39.權(quán)利要求37的方法，其中所述癌細(xì)胞是肺癌細(xì)胞。40.權(quán)利要求39的方法，其中所述肺癌是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。41.權(quán)利要求35的方法，其中所述癌細(xì)胞是與選自急性髓細(xì)胞樣白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤、血液的惡性腫瘤、實(shí)體瘤、結(jié)腸直腸癌、腦癌、乳腺癌、前列腺癌、EB病毒相關(guān)淋巴細(xì)胞增生性疾病、腎癌、肝細(xì)胞癌和胃癌的癌癥相關(guān)的細(xì)胞。42.權(quán)利要求30的方法，其中所述細(xì)胞存在于受試者中。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述受試者是人。44.在受試者中治療與BCL2基因產(chǎn)物的過度表達(dá)相關(guān)的癌癥的方法，其包括對受試者施用有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，從而治療癌癥。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15b或miR-16-2。46.權(quán)利要求44的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-30、miR-15b、miR-16-2、miR-153-l、miR-217、miR-205、miR-204、miR-103、miR-107、miR-129-2、miR-9、miR-137和其組合。47.權(quán)利要求44的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與SEQIDNO:55的核苷酸3741-3749互補(bǔ)的核苷酸序列。48.權(quán)利要求44的方法，其中所述受試者是人。49.權(quán)利要求44的方法，其中所述癌癥是慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)。50.權(quán)利要求44的方法，其中所述癌癥是淋巴瘤。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述淋巴瘤選自濾泡性淋巴瘤、大細(xì)胞淋巴瘤和非何杰金淋巴瘤。52，權(quán)利要求44的方法，其中所述癌癥是肺癌。53.權(quán)利要求52的方法，其中所述肺癌是非小細(xì)胞肺癌。54.在受試者中治療與BCL2基因產(chǎn)物的過度表達(dá)相關(guān)的癌癥的方法，其包括對受試者施用有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苦酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，只要miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。55.在受試者中治療與BCL2基因產(chǎn)物的過度表達(dá)相關(guān)的癌癥的方法，其包括對受試者施用有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-30、miR-15b、miR-16-2、miR-217、miR-205、miR-204、miR-103、miR-107、miR-9和miR-137。56，用于治療Bcl2相關(guān)癌癥的藥物組合物，其包含至少一種抗癌劑和至少一種miR基因產(chǎn)物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。57.權(quán)利要求56的藥物組合物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與SEQIDNO:55的核苷酸3741-3749互補(bǔ)的核苷酸序列。58.權(quán)利要求56的藥物組合物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a。59.權(quán)利要求56的藥物組合物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-16-l。60.權(quán)利要求56的藥物組合物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR—9、miR-137、miR-217、miR-186和其組合。61.用于確定受試者中癌癥療法的功效的方法，其包括對受試者施用至少一種治療劑，然后測量來自受試者的樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)，其中miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。62.權(quán)利要求61的方法，其中所述受試者具有CLL。63.權(quán)利要求61的方法，其中所述受試者具有與Bcl2蛋白的過度表達(dá)相關(guān)的癌癥。64.權(quán)利要求61的方法，其中所述miR基因產(chǎn)物是miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2或其組合。65.權(quán)利要求61的方法，其中相對于合適的對照miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的增加表明成功的治療。66.在受試者中預(yù)防與BCL2基因產(chǎn)物的過度表達(dá)相關(guān)的癌癥的方法，其包括對受試者施用有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。67.在受試者中預(yù)防與BCL2基因產(chǎn)物的過度表達(dá)相關(guān)的癌癥的方法，其包括對受試者施用有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，只要miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。68.在受試者中預(yù)防與BCL2基因產(chǎn)物的過度表達(dá)相關(guān)的癌癥的方法，其包括對受試者施用有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物，從而預(yù)防癌癥，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-30、miR-15b、miR-16-2、miR-217、miR-205、miR-204、miR-103、miR-107、miR-9和miR-137。69.在受試者中診斷或預(yù)示BCL2相關(guān)癌癥的方法，其包括i)確定來自受試者的樣品中的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平；和ii)將樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平與對照相比較，其中相對于對照的miR基因產(chǎn)物的水平來自受試者的樣品中的所述至少一種raiR基因產(chǎn)物的水平的減少診斷或預(yù)示BCL2相關(guān)癌癥，和其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。70.權(quán)利要求69的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a或miR-16-l。71.權(quán)利要求69的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其組合。72.權(quán)利要求69的方法，其中所述至少一種ffliR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195和其組合。73.權(quán)利要求69的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與SEQIDNO:55的核苷酸3741-3749互補(bǔ)的核苷酸序列。74.權(quán)利要求69的方法，其中所述對照是來自不具有BCL2相關(guān)癌癥的受試者的所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。75.權(quán)利要求69的方法，其中所述對照是來自該受試者的非癌樣品的所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。全文摘要本發(fā)明提供了用于治療受試者中與BCL2基因和/或基因產(chǎn)物的過度表達(dá)相關(guān)的癌癥的方法和組合物以及用于改進(jìn)抗癌療法例如化學(xué)療法和放射療法的方法和組合物。本發(fā)明還包括用于確定癌癥療法在受試者中的功效的方法和誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡的方法。文檔編號C07H21/02GK101296702SQ200680039776公開日2008年10月29日申請日期2006年9月11日優(yōu)先權(quán)日2005年9月12日發(fā)明者C·M·克羅斯,G·A·卡林申請人:俄亥俄州立大學(xué)研究基金會(huì)