一種采用流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜倍性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及冬瓜倍性鑒定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] -般而言，進(jìn)行植物倍性鑒定的方法分為兩大類：第一類是直接鑒定法，即染色體 計數(shù)法。這是確定倍性最基本和最精確的方法，但是這種方法需要裝備良好的試驗條件和 富有經(jīng)驗的技術(shù)人員，而且操作過程繁瑣，工作量大，需要消耗大量的時間來進(jìn)行。第二類 是間接鑒定法，其包括田間植株形態(tài)指標(biāo)鑒定、氣孔大小及保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目觀察、花粉 粒大小判別法等。這些方法比較簡單，但是不精確，如果植株存在嵌合體時，無法準(zhǔn)確判斷 其倍性。流式細(xì)胞術(shù)是一種簡單、快捷的對植株分裂期的核DNA含量進(jìn)行檢測分析，通過計 算細(xì)胞核DNA含量來分析植株的倍性，具有快速、簡便、準(zhǔn)確的特點，準(zhǔn)備好的細(xì)胞核樣品 在數(shù)分鐘內(nèi)即可完成測定和分析，所以特別適合于樣品較多的倍性檢測分析。流式細(xì)胞術(shù) 是目前植物倍性鑒定最簡便和準(zhǔn)確的方法。目前在冬瓜倍性檢測方面還未見有用流式細(xì)胞 術(shù)進(jìn)行鑒定的先例。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 因此，本發(fā)明提供一種快速、簡便、準(zhǔn)確的鑒定冬瓜倍性的方法，解決染色體計數(shù) 過程中耗時過多、間接鑒定方法中的不精確性因素的問題。
[0004] 一種采用流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜倍性的方法，包括以下幾個步驟： 步驟A :采集幼嫩葉片，將其沖洗滅菌后加入預(yù)冷的改良裂解液，用預(yù)先滅好菌的鋒 利刀片將冬瓜葉片切碎； 步驟B :將切碎后的冬瓜葉片用預(yù)先用改良裂解液浸泡過的尼龍濾網(wǎng)過濾到離心管 中，再將濾液放入離心機(jī)，室溫下離心，倒掉上清液，加入預(yù)冷的改良裂解液，混勻，再加入 染液混勻，避光染色，得到樣品； 步驟C :采用流式細(xì)胞儀的穩(wěn)定性，用熒光微球校準(zhǔn)各熒光通道，確保各熒光通道采集 的熒光信號變異系數(shù)小于2% ;選擇已知倍性的二倍體冬瓜為對照樣品；待測樣本上機(jī)檢 測，收集4000-5000個細(xì)胞核，得出樣本流式散點圖與熒光峰圖。
[0005] 優(yōu)選的，改良裂解液配制：以500-1000m L為定容，按濃度40-45mmol/L MgCl2, 25-30 mmol/L 檸檬酸鈉，15-20 mmol/L MOPS，體積濃度為 0· 1-0. 15% 的 TritonX-100， pH=7. 5,配制成所需裂解液，于-20°C保存，解凍后4°C下保存。
[0006] 優(yōu)選的，所述改良裂解液用DEPC水或去離子水溶解。
[0007] 優(yōu)選的，所述染液的配制方法：用無菌水溶解DAP I，配制成濃度I mg/ml的貯存 液，配好后用錫紙包起來，避光，可在-20 °C下長期保存。
[0008] 優(yōu)選的，所述染液的稀釋方法為：用IxPBS稀釋到濃度為l〇Ug/mL，并用濾網(wǎng)過濾， 濾液在4°C下保存待用。
[0009] 優(yōu)選的，所述濾網(wǎng)采用0. 22um，濾液的保存溫度為4°C。
[0010] 優(yōu)選的，所述尼龍濾網(wǎng)采用300目。
[0011] 優(yōu)選的，所述二倍體對照樣設(shè)置在所述流式細(xì)胞儀的100通道。
[0012] 優(yōu)選的，離心的速度為1000-1500rpm，離心時間為3_5min。
[0013] 測試的具體步驟如下： a.檢查流式細(xì)胞儀的穩(wěn)定性，打開儀器，預(yù)熱30min。
[0014] b.儀器啟動后，用熒光微球校準(zhǔn)各熒光通道，確保各熒光通道采集的熒光信號變 異系數(shù)（CV值）小于2%。
[0015] c.待測樣本上機(jī)檢測，收集4000-5000個細(xì)胞核，得出樣本流式散點圖與熒光峰 圖。數(shù)據(jù)分析為機(jī)器自帶軟件。選擇已知倍性的二倍體冬瓜為對照樣品，將二倍體對照設(shè) 置在100通道。選用的流式細(xì)胞儀機(jī)器型號為Cell. Lab. Quanta. SC.(美國貝克曼公司） 本發(fā)明的有益效果是：此方法是用于冬瓜倍性的快速檢測，選用的改良裂解液是 Galbraith' s，染色液為DAPI (10ug/ml);本發(fā)明樣品制備簡單，上樣檢測快速，結(jié)果準(zhǔn)確。 從制備樣品至結(jié)果分析完成一個樣品只需要40min即可完成。
【附圖說明】
[0016] 圖1是本發(fā)明流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜二倍體倍性的熒光光譜圖。
[0017] 圖2是本發(fā)明流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜二倍體與四倍體嵌合體的熒光光譜圖。
[0018] 圖3是本發(fā)明流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜四倍體的熒光光譜圖。
[0019]圖4是本發(fā)明流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜三倍體的熒光光譜圖。
[0020] 圖5是本發(fā)明流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜四倍體與八倍體嵌合體的熒光光譜圖。
[0021] 圖6是本發(fā)明流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜六倍體的熒光光譜圖。
【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的較優(yōu)的實施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說明： 以秋水仙素剝滴誘變處理幼嫩冬瓜幼苗生長點2個月后的黑皮冬瓜幼苗為試驗材料， 鑒定處理后黑皮冬瓜幼苗的倍性為例： ①樣品采集：采集處理后黑皮冬瓜幼苗完全展開的心葉，重量〇. 2g。
[0023] ②樣品制備： a. 改良裂解液配制：以1000m L去離子水定容，按45mmol/L MgCl2,30 mmol/L梓檬酸 鈉，20 mmol/L M0PS，0.1% (v/v)TritonX-100，pH 7.5 配制成改良裂解液，于-20°C 保存， 解凍后4°C下保存待用； b. 將樣品用蒸餾水沖洗2次，用已滅菌的濾紙吸干比表面水分后放入滅菌預(yù)冷的培養(yǎng) 皿中，加入預(yù)冷的改良裂解液（Galbraith's) (l-2ml)，使葉片浸沒在改良裂解液中，用預(yù)先 滅好菌的鋒利刀片將冬瓜葉片切碎。
[0024] c. 2-3min后用300目的尼龍濾網(wǎng)(預(yù)先用改良裂解液浸泡IOmin)過濾到I. 5ml離 心管中，留濾液備用。
[0025] d.將濾液放入離心機(jī)，室溫，1500rpm，離心5min，倒掉上清液，加入1ml預(yù)冷的改 良裂解液，混勻，再加入0.1 ml染液（DAPI，10ug/mL)混勻，避光染色0. 5h后均可使用。
[0026] ③上樣檢測： a.檢查流式細(xì)胞儀的穩(wěn)定性，打開儀器，預(yù)熱30min。
[0027] b.儀器啟動后，用熒光微球校準(zhǔn)各熒光通道，確保各熒光通道采集的熒光信號變 異系數(shù)（CV值）小于2%。
[0028] c.待測樣本上機(jī)檢測，收集4000-5000個細(xì)胞核，得出樣本流式散點圖與熒光峰 圖。數(shù)據(jù)分析為機(jī)器自帶軟件。選擇已知倍性的二倍體冬瓜為對照樣品，將二倍體對照設(shè) 置在100通道。
[0029] ④結(jié)果分析： 如圖1-6所示，以普通的二倍體冬瓜為對照，二倍體對照熒光峰的熒光強(qiáng)度處在100附 近，待測冬瓜植株峰值處于100附近的視為二倍體，而處于150附近則為三倍體，處于200 附近則為四倍體，處于300附近則為六倍體；在100與200處同時存在熒光峰值則為二倍體 與四倍體的嵌合體，在200與400處同時存在熒光峰值則為四倍體與八倍體的嵌合體。
[0030] 三種方法的比較： 以田間形態(tài)學(xué)鑒定、染色體計數(shù)法及流式細(xì)胞術(shù)三種方法進(jìn)行比較，鑒定冬瓜倍性，結(jié) 果如下： 1、形態(tài)學(xué)鑒定 指通過植株的葉片大小，花器官大小，花粉粒形態(tài)、大小及畸形率，果實性狀、大小，葉 表皮氣孔大小，葉肉細(xì)胞中葉綠體數(shù)目等方面進(jìn)行鑒定。此方法具有簡單易行，不需要繁雜 的室內(nèi)試驗即可記性。但其只能初步進(jìn)行判定植株是否已經(jīng)產(chǎn)生變異，但具體的植株倍性 不能明確的知道，此方法只能進(jìn)行初步篩選，用于初步剔除未變異的植株，為后續(xù)的染色體 計數(shù)或流式細(xì)胞術(shù)準(zhǔn)確的倍性鑒定進(jìn)行前期的準(zhǔn)備工作。
[0031] 2、染色體計數(shù) 是目前最為準(zhǔn)確、且最直觀的鑒定植株倍性的方法。但需要良好的試驗條件和富有經(jīng) 驗的技術(shù)人員，而且操作過程繁瑣，工作量大，需要消耗大量的時間來進(jìn)行。如果鑒定植株 是嵌合體，染色體壓片時，就可能因為壓片操作的問題，而不能準(zhǔn)確的判斷其倍性水平。
[0032] 3、流式細(xì)胞術(shù) 是通過細(xì)胞核DNA水平來計算染色體倍性，是從分子水平上進(jìn)行鑒定，是目前較為準(zhǔn) 確的鑒定方法，而且操作簡單、快捷。能準(zhǔn)確鑒定植株的倍性，包含嵌合體也能準(zhǔn)確的判斷， 但需要一個已知倍性的內(nèi)參。
[0033] 三種方法比較鑒定結(jié)果如表1所示：
【主權(quán)項】
1. 一種采用流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜倍性的方法，其特征在于，包括以下幾個步驟： 步驟A:采集幼嫩葉片，將其沖洗滅菌后加入預(yù)冷的改良裂解液，用預(yù)先滅好菌的鋒利 刀片將冬瓜葉片切碎； 步驟B:將切碎后的冬瓜葉片用預(yù)先用改良裂解液浸泡過的尼龍濾網(wǎng)過濾到離心管 中，再將濾液放入離心機(jī)，室溫下離心，倒掉上清液，加入改良裂解液，混勻，再加入稀釋后 的染液混勻，避光染色，得到樣品； 步驟C:采用流式細(xì)胞儀的穩(wěn)定性，用熒光微球校準(zhǔn)各熒光通道，確保各熒光通道采 集的熒光信號變異系數(shù)小于2% ;選擇已知倍性的二倍體冬瓜為對照樣品；待測樣本上機(jī)檢 測，收集4000-5000個細(xì)胞核，得出樣本流式散點圖與熒光峰圖。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，改良裂解液配制：以500-1000mL定容， 按濃度 40-45mmol/L MgCl2, 25-30 mmol/L 檸檬酸鈉，15-20 mmol/L MOPS，體積濃度為 0. 1-0. 15%的TritonX-100, pH=7. 5,配制成所需裂解液，于-20°C保存，解凍后4°C下保存。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述改良裂解液用DEPC水或去離子水溶解。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中，所述染液的配制方法為：用無菌 水溶解DAPI，配制成濃度I mg/ml的貯存液，配好后用錫紙包起來，避光，在-20 °C下長期 保存。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中，所述染液的稀釋方法為：用IxPBS 將染液稀釋到濃度為10ug/mL，并用濾網(wǎng)過濾，保存待用。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述濾網(wǎng)采用0. 22um，濾液的保存溫度為 4V。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中，所述尼龍濾網(wǎng)采用300目。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中，離心的速度為1000-1500rpm，離 心時間為3_5min。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟C中，所述二倍體對照樣設(shè)置在所述流 式細(xì)胞儀的100通道。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種采用流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定冬瓜倍性的方法，包括以下幾個步驟：步驟A:采集幼嫩葉片，將其沖洗滅菌后加入預(yù)冷、稀釋后的改良裂解液，用預(yù)先滅好菌的鋒利刀片將冬瓜葉片切碎；步驟B:將切碎后的冬瓜葉片用預(yù)先用裂解液浸泡過的尼龍濾網(wǎng)過濾到離心管中，再將濾液放入離心機(jī)，室溫下離心，倒掉上清液，加入預(yù)冷的裂解液，混勻，再加入染液混勻，避光染色，得到樣品；步驟C:采用流式細(xì)胞儀的穩(wěn)定性，用熒光微球校準(zhǔn)各熒光通道，確保各熒光通道采集的熒光信號變異系數(shù)小于2%；選擇已知倍性的二倍體冬瓜為對照樣品；待測樣本上機(jī)檢測，收集4000-5000個細(xì)胞核，得出樣本流式散點圖與熒光峰圖。本發(fā)明從制備樣品至結(jié)果分析完成一個樣品只需要40min即可。
【IPC分類】G01N15-14, C12Q1-68
【公開號】CN104878089
【申請?zhí)枴緾N201510214784
【發(fā)明人】萬正林, 鄧儉英, 武鵬, 李立志, 周艷霞, 劉朝安
【申請人】廣西現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年4月29日