一株諾氟沙星降解乙酸鈣不動桿菌nor-36及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物高科技技術領域，具體涉及一株諾氟沙星降解乙酸鈣不動桿菌NOR-36及其應用。
【背景技術】
[0002]獸用抗生素是指以亞治療劑量用于動物飼料中，以保障動物健康、或促進動物生長與生產、提高飼料利用率的抗生素?？股乇旧韺θ梭w是無害的，但如果過量使用將使病源細菌產生耐藥性，導致抗生素對其失效?？股氐倪^量使用使藥物耐藥性、畜產品藥物殘留等都成為了不可忽視的嚴重問題，尤其是破壞動物的免疫機能。同時抗生素屬于難生物降解物質，一旦造成抗生素污染，很容易在環(huán)境中富集，誘導耐藥菌株產生，對環(huán)境微生態(tài)造成嚴重的影響。
[0003]氟喹諾酮類藥物在我國畜牧水產養(yǎng)殖業(yè)中已廣泛應用，但在使用中發(fā)現(xiàn)，氟喹諾酮類藥物會產生一系列的不良反應，如皮膚過敏反應及光敏反應、軟骨毒性、循環(huán)系統(tǒng)反應、中樞神經系統(tǒng)(CNS)反應、胃腸道反應等，直接影響了畜牧和水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。諾氟沙星是當前廣泛應用于臨床的第三代喹諾酮抗生素(氟喹諾酮類)的代表藥物之一。由于諾氟沙星的喹諾酮環(huán)的穩(wěn)定性和抗水解能力使其成為持久性污染物，目前已多次在水體中被檢測出來。微生物降解具有成本低、效率高、無二次污染、生態(tài)恢復性好等優(yōu)點，已在很多方面得到應用，所以篩選出諾氟沙星降解菌對于處理諾氟沙星生產廢水具有重大意義。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對生產實踐中的實際問題和需求，利用微生物的方法來降解廢水中的污染物，適用于現(xiàn)代廢水處理工藝，使廢水達標排放，同時降低生產和使用成本。
[0005]本發(fā)明提供一種消除諾氟沙星殘留的降解菌，其菌株NOR-36是一株革蘭氏染色反應陰性菌，于2015年2月9日保藏于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCjfta:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研宄所，郵編100101)，保藏編號CGMCC N0.10540，經鑒定是乙酸1?不動桿菌difle1Aacier.calcoacetIcus^a生物學特性為革蘭氏染色陰性，菌落光滑，短桿狀，接觸氧化酶陽性，硝酸鹽還原酶陰性。本發(fā)明提供了甲基桿菌N0R-36在諾氟沙星降解中的應用。在實驗室搖瓶培養(yǎng)條件下使?jié)舛葹?00ug/L的諾氟沙星降解率達90%以上。該菌可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設備進行生產。
[0006]本發(fā)明提供了含有所述乙酸鈣不動桿菌N0R-36的菌劑。
[0007]本發(fā)明還提供了所述乙酸鈣不動桿菌N0R-36生產菌劑的方法。
[0008]所述乙酸鈣不動桿菌N0R-36生產菌劑的方法，包括:斜面種一搖瓶種一種子罐一生產罐一產品，所述產品的包裝劑型為液體菌劑或固體吸附菌劑。
[0009]所述生產菌劑的方法，具體為: O將諾氟沙星殘留的乙酸鈣不動桿菌N0R-36的試管種接種于添加哌嗪的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；
2)將步驟I)培養(yǎng)好的菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即種子液；
3)將步驟2)所述種子液按10%的接種量接入生產罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，生產罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同，發(fā)酵完成后的培養(yǎng)液即為菌劑；
4)步驟3)所述菌劑直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型，或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
[0010]步驟I)中所述的LB培養(yǎng)基配方為:NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L,哌嗪 5g/L，ρΗ7.0。
[0011]步驟2)所述的種子罐所用的培養(yǎng)基配方為:哌嗪5g/L，葡萄糖8g/L，(NH4)2S04 Ig/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，NaCl lg/L%，CaCO3 0.5g/L，酵母膏 2g/L，pH 值 7.2-7.5。
[0012]步驟2)所述種子罐和步驟3)所述的生產罐的培養(yǎng)過程中，無菌空氣的通氣量為1:0.6-1.2，攪拌速度為180-240轉/分，培養(yǎng)溫度為30_35°C，步驟2和3的整個工藝流程培養(yǎng)時間為48-60小時。
[0013]所述菌劑在諾氟沙星降解中的應用。
[0014]本發(fā)明所述的乙酸鈣不動桿菌N0R-36能使水體中諾氟沙星的殘留量降低90%以上，降低諾氟沙星在環(huán)境中富集并影響環(huán)境微生態(tài)的風險。所制備的菌劑具有生產使用成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點，適合在全國的污水處理廠尤其是畜禽養(yǎng)殖廢水處理廠大面積推廣使用。本發(fā)明是利用微生物的方法降解化學農藥，適用于現(xiàn)代農業(yè)生產中綠色無公害農產品的生產與加工，對于保護生態(tài)環(huán)境，保護人類的身體健康，提高水環(huán)境質量安全具有重要的意義。使用該降解菌劑可以在降低水中化學需氧量濃度、氨氮濃度以及總磷濃度等常規(guī)污染物的同時，降低出水中諾氟沙星濃度。本發(fā)明對于保護生態(tài)環(huán)境，保護人類的身體健康，降低廢水處理成本具有重要的意義。
【附圖說明】
[0015]圖1本發(fā)明所述的乙酸鈣不動桿菌N0R-36的結晶紫染色照片；
圖2接種量對本發(fā)明所述的乙酸鈣不動桿菌N0R-36降解效果的影響；
圖3 pH對本發(fā)明所述的乙酸鈣不動桿菌N0R-36降解效果的影響；
圖4諾氟沙星降解菌效果驗證。
【具體實施方式】
[0016]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0017]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
[0018]實施例1諾氟沙星降解乙酸鈣不動桿菌N0R-36的篩選和分離
取從生產諾氟沙星的某農藥廠生產車間的廢水處理池中得到的活性污泥3.0ml加入10ml諾氟沙星濃度為50mg/L的含有哌嗪的LB培養(yǎng)基中，其配方為:含5g/L哌嗪，NaCl10.00g/L,蛋白胨 10.00g/L,酵母粉 5.00g/L, pH 7.0，于 160r/min，30°C條件下振蕩培養(yǎng)，每隔7天按3%的接種量轉接到新鮮的無機鹽培養(yǎng)基中，連續(xù)轉接5次。
[0019]取上面得到的富集菌液1.0ml，加入9.0ml無菌水中，配成KT1的富集液，再吸取1.0ml配好的10—1的富集液加入9.0ml無菌水中，充分混勻配成10 _2的富集液，以此類推，對富集液進行梯度稀釋。吸取各梯度的稀釋液0.1ml涂布于含諾氟沙星的濃度為500ug/L無機鹽固體培養(yǎng)基(配方為:每升含500ug哌嗪，1.50g K2HP04、0.50g ΚΗ2Ρ04、0.20gMgS04X7H20、l.0Og NaCl,1.0Og (NH4)2SO4, 20.0Og 瓊脂，pH 7.0)上，30°C培養(yǎng)7 天。7 天后從以上的無機鹽固體培養(yǎng)基上挑取單菌落，于3.0ml的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后，LB液體培養(yǎng)基配方為:哌嗪5g/L，NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L，pH7.0于8000r/min的條件下離心2min，倒去上清液，加入3.0ml的無菌水搖勾，仍于8000r/min的條件下離心2min，按此方法用無菌水洗兩遍后，加入3.0ml無菌水重懸該菌。吸取1.0ml該菌液加入10ml諾氟沙星濃度為500ug/L的哌嗪-無機鹽液體培養(yǎng)基中(配方為:每升含500ug哌嗪，1.50g K2HP04、0.50g KH2PO4'0.20g MgSO4X 7H20、1.0Og NaCl,1.0Og (NH4)2SO4,20.0Og瓊脂，pH 7.0)，于160r/min，30°C條件下振蕩培養(yǎng)72h后，用高效液相色譜測其降解效果。將降解效率較高的一株菌株