一種噬菌體滅菌時(shí)化學(xué)抗菌劑篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)療衛(wèi)生保健技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種噬菌體滅菌時(shí)化學(xué)抗菌劑篩選 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 化學(xué)抗菌劑通常包括用于體外的消毒劑(如環(huán)境消毒和生物體表皮膚黏膜消毒） 和用于生物體內(nèi)治療感染的天然抗生素或人工合成的抗菌藥物。在醫(yī)療衛(wèi)生保健技術(shù)領(lǐng) 域，為快速、有效控病菌感染，常需大量使用各種類型的化學(xué)抗菌劑進(jìn)行滅菌處理。然而，隨 著大量廣譜類抗菌劑的長(zhǎng)期使用，細(xì)菌耐藥問題逐年加劇，一系列耐藥病原菌，如結(jié)核桿 菌、金萄菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、腸球菌和銅綠假單胞菌等病原菌耐 藥菌株的出現(xiàn)，引起公眾的廣泛關(guān)注，這也是人們意識(shí)到，尋找新的、更為環(huán)保和生態(tài)的抑 制病原菌的用藥方式是解決細(xì)菌耐藥問題根本出路。
[0003] 噬菌體是一種可以感染并裂解殺滅細(xì)菌的天然存在的病毒，最早由Twort和 Herelle D兩人分別于1915年和1917年發(fā)現(xiàn)。由于其對(duì)人和動(dòng)物無害，因此可將殺菌能力強(qiáng) 的噬菌體用于自然環(huán)境和生物體內(nèi)環(huán)境中的殺菌，以達(dá)到防治細(xì)菌感染體目的。由于噬菌 體滅菌方式的環(huán)保性、高效性、特異性，因而使得人們近年對(duì)于噬菌體滅菌技術(shù)重新產(chǎn)生了 濃厚的興趣。
[0004]在化學(xué)抗菌劑仍是控制細(xì)菌感染主流方法的背景下，采用噬菌體滅菌作為化學(xué)抗 菌劑的補(bǔ)充具有十分重要的意義。但實(shí)際應(yīng)用過程中，由于噬菌體種類繁多（自然界中超過 1〇8種），化學(xué)抗菌劑的種類也很多，加之在應(yīng)用噬菌體殺菌的環(huán)境中常常會(huì)有化學(xué)抗菌劑 的殘留，而噬菌體與化學(xué)抗菌劑殺菌機(jī)制又完全不同，因而在噬菌體與化學(xué)抗菌劑聯(lián)合使 用時(shí)，如何在種類繁多的噬菌體和化學(xué)抗菌劑中選擇出最佳的組合，是首先需要解決的關(guān) 鍵問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種噬菌體滅菌時(shí)，篩選可以聯(lián)合使用的化學(xué)抗菌劑的方法， 從而為噬菌體與化學(xué)抗菌劑的聯(lián)合應(yīng)用提供可靠保障。
[0006] 本發(fā)明所采取的詳細(xì)技術(shù)方案如下所述。
[0007] -種噬菌體滅菌時(shí)化學(xué)抗菌劑篩選方法，具體包括如下步驟： (1) 制備培養(yǎng)基，本發(fā)明中采用雙層固體培養(yǎng)基，具體為： 首先制備底層固體培養(yǎng)基，即加入1.5%的瓊脂粉的LB培養(yǎng)基，滅菌后，無菌環(huán)境下傾倒 于無菌的9cm平皿中（1 OmL/平皿），制成固體培養(yǎng)基，凝固后置4°C保存待用，使用前置37 °C 下預(yù)熱； 其次制備頂層用半固體培養(yǎng)基，即加入0.5%的瓊脂粉的LB培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基融化后分 裝于玻璃試管中（3mL/管），加蓋滅菌后，趁熱置于45°C水浴中保溫以避免凝固； (2) 接種病菌和噬菌體，具體為，將lOOyL菌液(109 CFU/ml)和lOOyL噬菌體懸液分別加 入到步驟（1)中的半固體培養(yǎng)基中，混合均勻后，傾倒于步驟（1)中的固體培養(yǎng)基中，并鋪 勻，室溫(20~25°C)凝固； 需要解釋的是，噬菌體懸液濃度以前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)，對(duì)于噬菌體懸液濃度進(jìn)行 控制主要是控制噬菌體在每個(gè)平皿中形成噬菌斑的數(shù)量，由于不同噬菌體所形成的噬菌斑 的大小不同，因此噬菌體數(shù)量(噬菌體懸液濃度)并不是固定的，但以不會(huì)構(gòu)成融合的最大 噬菌斑數(shù)為最佳； (3)加入抗菌劑，在步驟(2)中凝固后的雙層培養(yǎng)基中滴加5tiL化學(xué)抗菌劑，培養(yǎng)約8~ 48h(培養(yǎng)時(shí)以所接種病菌的最適生長(zhǎng)溫度為宜），觀察噬菌斑并進(jìn)行判斷； 需要解釋的是，滴加化學(xué)抗菌劑后培養(yǎng)時(shí)間可根據(jù)不同細(xì)菌生長(zhǎng)速度適當(dāng)做調(diào)整，即 培養(yǎng)時(shí)間等于菌苔的透明度達(dá)到穩(wěn)定所需的時(shí)間； 判斷時(shí)，可依據(jù)噬菌體成斑率、噬菌斑大小和形態(tài)變化、化學(xué)抗菌劑抑菌區(qū)透明度變化 等單獨(dú)或者聯(lián)合對(duì)化學(xué)抗菌劑與噬菌斑合用的滅菌效果進(jìn)行判定； 依據(jù)噬菌體成斑率進(jìn)行判斷時(shí)，觀察消毒劑作用區(qū)域噬菌體成斑率的變化，成斑率增 高即表明化學(xué)抗菌劑對(duì)噬菌體殺菌起促進(jìn)作用，成斑率降低即表明化學(xué)抗菌劑對(duì)噬菌體殺 菌起抑制作用； 依據(jù)噬菌斑大小或形態(tài)變化進(jìn)行判斷時(shí)，觀察消毒劑作用區(qū)域噬菌斑，如果噬菌斑明 顯增大，或向消毒劑抑菌圈方向局部增大而被"拉長(zhǎng)"，表明化學(xué)抗菌劑對(duì)噬菌體滅菌起促 進(jìn)作用；反之，觀察消毒劑作用區(qū)域噬菌斑，如果噬菌斑明顯減小，或向消毒劑抑菌圈方向 局部縮小而被"擠壓"，表明化學(xué)抗菌劑對(duì)噬菌體滅菌起抑制作用； 依據(jù)化學(xué)抗菌劑抑菌區(qū)透明度變化進(jìn)行判斷時(shí)，觀察與噬菌斑相鄰處化學(xué)抗菌劑抑菌 區(qū)透明度的變化，如果與噬菌斑相鄰處化學(xué)抗菌劑抑菌區(qū)透明度增加，表明化學(xué)抗菌劑對(duì) 噬菌體滅菌起促進(jìn)作用;反之，如果與噬菌斑相鄰處化學(xué)抗菌劑抑菌區(qū)透明度降低，表明化 學(xué)抗菌劑對(duì)噬菌體滅菌起抑制作用。
[0008] 實(shí)際應(yīng)用過程中，滴加抗菌劑方式也可更改為粘貼具有特定濃度抗菌劑的紙片方 式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0009] 在本發(fā)明中，接種的病菌具體例如:肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、 陰溝腸桿菌、大腸埃希菌等;采用的噬菌體為用這些病菌作為指示菌從環(huán)境中分離獲得的 特異性噬菌體。
[0010] 所述抗菌劑例如:84消毒液、雙氧水、苯扎溴銨、石碳酸、碘伏、戊二醛或臨床中所 用抗生素類藥劑等。
[0011] 現(xiàn)有技術(shù)中，針對(duì)特定病菌篩選針對(duì)性的噬菌體的技術(shù)已經(jīng)較為成熟，而且由于 噬菌體滅菌的特異性和環(huán)保性，因而實(shí)際抗菌、治療過程中也有一定的應(yīng)用試驗(yàn)。但由于現(xiàn) 有技術(shù)中針對(duì)病菌的滅菌、抗菌時(shí)仍以化學(xué)抗菌劑為主，因而在噬菌體與化學(xué)抗菌劑聯(lián)用 時(shí)，其相互作用、相互影響如何尚缺乏較為系統(tǒng)的研究。
[0012] 本申請(qǐng)以部分特定菌株和噬菌體及部分廣譜性的抗菌劑為代表，對(duì)于噬菌體與化 學(xué)抗菌劑聯(lián)用時(shí)的相互作用、相互影響進(jìn)行了初步探討，所提供的噬菌體滅菌時(shí)的化學(xué)抗 菌劑的篩選方法，為篩選獲得噬菌體與抗菌劑的最佳組合，以其獲得最佳抗菌效果提供了 較好的技術(shù)保障。
[0013] 總體而言，本發(fā)明所提供的化學(xué)抗菌劑的篩選方法，操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定、可信度 高，且容易觀察和判斷，因而在衛(wèi)生保健領(lǐng)域具有較好地應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0014] 圖1為未滴加抗菌劑時(shí)噬菌體所形成噬菌斑形態(tài)，其中A為噬菌體PL2在銅綠假單 胞菌L2菌苔上形成的噬菌斑，B為噬菌體PF8在肺炎克雷伯菌F8菌苔上形成的噬菌斑，C為噬 菌體PF2在肺炎克雷伯菌F2菌苔上形成的噬菌斑，D為噬菌體PA1在鮑曼不動(dòng)桿菌A1菌苔上 形成的噬菌斑； 圖2為6種抗菌劑在頂層半固體培養(yǎng)基中對(duì)不同菌株的菌苔上形成抑菌區(qū)的形態(tài)(不含 有噬菌體），其中A為肺炎克雷伯菌F7，B為肺炎克雷伯菌F4，C為銅綠假單胞菌L3，D為鮑曼不 動(dòng)桿菌A4，1、2、3、4、5、6代表的是6種不同抗菌劑的編號(hào)； 圖3為抗菌劑與噬菌體聯(lián)合使用時(shí)部分菌株上的噬菌體成斑率變化情況結(jié)果，其中左 圖的噬菌體為PF1，菌株為肺炎克雷伯菌F1;右圖的噬菌體為PF12,菌株為肺炎克雷伯菌 F12,白色箭頭所指的是4號(hào)抗菌劑(石炭酸）； 圖4為抗菌劑與噬菌體聯(lián)合使用時(shí)部分菌株上的噬菌體成斑率變化情況結(jié)果，其中菌 株為肺炎克雷伯菌F19,噬菌體為PF19,白色箭頭所指抗菌劑的周圍區(qū)域成斑率均明顯降 低； 圖5為抗菌劑與噬菌體聯(lián)合使用時(shí)部分菌株上的噬菌體成斑率變化情況結(jié)果，其中菌 株為肺炎克雷伯菌F6,噬菌體為PF18,白色箭頭所指抗菌劑的周圍區(qū)域成斑率均明顯降低； 圖6為抗菌劑與噬菌體聯(lián)合使用時(shí)部分菌株上的噬菌體成斑率變化情況結(jié)果，其中左 圖噬菌體為PA3，菌株為鮑曼不動(dòng)桿菌A3;右圖噬菌體為PG7，菌株為陰溝腸桿菌G7;兩個(gè)黑 色箭頭所指抗菌劑的周圍區(qū)域成斑率均明顯增高； 圖7為抗菌劑與噬菌體聯(lián)合使用時(shí)部分菌株上的噬菌體成斑率變化情況結(jié)果，其中菌 株為肺炎克雷伯菌F13，噬菌體為PF13，黑色箭頭所指抗菌劑的周圍區(qū)域成斑率明顯增高； 圖8為抗菌劑與噬菌體聯(lián)合使用時(shí)，抗菌劑作用區(qū)域噬菌斑的大小和形態(tài)變化的部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中左圖的噬菌體為PL4，菌株為肺炎克雷伯菌L4;右圖的噬菌體為PL1，菌株為 肺炎克雷伯菌L1，灰色箭頭所指抗菌劑透明圓的周圍區(qū)域噬菌斑均明顯增大； 圖9為抗菌劑與噬菌體聯(lián)合使用時(shí)，抗菌劑作用區(qū)域噬菌斑的大小和形態(tài)變化的部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中左上圖的噬菌體為PA5