無(wú)限制酶的靶標(biāo)富集的制作方法
【專利說(shuō)明】無(wú)限制酶的靶標(biāo)富集
[0001]發(fā)明背景
[0002]分子生物學(xué)中的一些分析方法(例如，測(cè)序文庫(kù)制備)需要將銜接子(adaptor)序列放置在富集的DNA片段的末端以提供操作所述片段的方法。例如，可將一個(gè)或多個(gè)銜接子連接到富集的DNA片段上以產(chǎn)生連接銜接子的片段，可使用結(jié)合位點(diǎn)存在于添加的所述銜接子中的引物對(duì)連接銜接子的片段進(jìn)行擴(kuò)增和/或測(cè)序。
[0003]發(fā)曰月概沐
[0004]本文提供了用于富集存在于隨機(jī)剪切的基因組DNA中的靶片段的多種方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法可涉及使隨機(jī)剪切的基因組DNA與暈環(huán)(halo)探針雜交以產(chǎn)生第一環(huán)狀復(fù)合物，然后酶促消化所述基因組片段的突出末端(overhanging end)。另一些實(shí)施方式可涉及使隨機(jī)剪切的基因組DNA與RNA寡核苷酸雜交以產(chǎn)生RNA/DNA雙鏈體，所述RNA寡核苷酸包含與所述隨機(jī)剪切的基因組DNA的片段雜交的區(qū)域。然后可以酶促消化所述RNA/DNA雙鏈體中基因組片段的突出末端。由此得到的具有確定末端的經(jīng)消化基因組片段可被連接到暈環(huán)探針的一種或多種寡核苷酸上。然后可對(duì)經(jīng)消化的基因組片段進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。
[0005]附圖簡(jiǎn)沐
[0006]本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下述附圖僅用于闡釋目的。附圖不旨在以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。
[0007]圖1示意性闡釋了暈環(huán)探針的兩種實(shí)施方式。
[0008]圖2示意性闡釋了所述方法的一種實(shí)施方式。
[0009]圖3示意性闡釋了所述方法的另一種實(shí)施方式。
[0010]圖4示意性闡釋了一種可對(duì)產(chǎn)物DNA分子進(jìn)行測(cè)序的方法。
[0011]定義
[0012]在更詳細(xì)描述示例性實(shí)施方式之前，給出下列定義以闡釋和定義說(shuō)明書(shū)中所用術(shù)語(yǔ)的含義和范圍。
[0013]數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)值。除非另有說(shuō)明，分別地，核酸是以5’到3’方向從左往右書(shū)寫(xiě)，氨基酸序列是以氨基到羧基方向從左往右書(shū)寫(xiě)。
[0014]除非另外定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。Singleton,等人，DICT1NARY OF MICROB1LOGY ANDMOLECULAR B1LOGY,第2版，John Wiley and Sons, New York(1994),和Hale&Markham, THEHARPER COLLINS DICT1NARY OF B1LOGY, Harper Perennial, N.Y.(1991)向技術(shù)人員提供了許多本文所用術(shù)語(yǔ)的一般含義。盡管如此，為了清楚和容易參考，下文對(duì)某些術(shù)語(yǔ)進(jìn)行定義。
[0015]必須注意:當(dāng)在本文和所附權(quán)利要求中使用時(shí)，除非上下文明確指出相反情況，否則不使用數(shù)量詞時(shí)涵蓋復(fù)數(shù)的指代物。例如，術(shù)語(yǔ)“引物”指一個(gè)/種或多個(gè)/種引物，即單個(gè)/種引物和多個(gè)/種引物。還應(yīng)注意:權(quán)利要求可撰寫(xiě)成排除任何任選元素。因此，該陳述旨在作為使用與權(quán)利要求元素的引述相聯(lián)系的這些排他性術(shù)語(yǔ)如“僅僅”、“僅”等或使用“否定性”限制的在先基礎(chǔ)。
[0016]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“樣品”指的是含有一種或多種目的分析物的材料或材料混合物，其典型地但并非必須地為液體形式。在一個(gè)實(shí)施方式中，以最廣義使用的該術(shù)語(yǔ)指含DNA或RNA的任何植物、動(dòng)物或病毒材料，例如來(lái)自體外細(xì)胞培養(yǎng)成分或分離自個(gè)體的組織或流體(包括但不限于血漿、血清、腦脊液、淋巴、眼淚、唾液和組織切片)，以及來(lái)自環(huán)境的樣品。術(shù)語(yǔ)“樣品”還指“生物樣品”。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“生物樣品”指的是整個(gè)生物體或其組織、細(xì)胞或組成部分的子集(例如，體液，包括但不限于血液、黏液、淋巴液、滑液、腦脊液、唾液、羊水、羊膜臍帶血、尿、陰道液和精液)?！吧飿悠贰边€指從整個(gè)生物體或其組織、細(xì)胞或組成部分的子集，或其級(jí)分或部分制備的勻漿、裂解物或提取物，包括但不限于，例如血漿，血清，脊髓液，淋巴液，皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的的外部切片，眼淚、唾液、乳、血細(xì)胞、腫瘤、器官。最經(jīng)常地，已從動(dòng)物移除樣品，但術(shù)語(yǔ)“生物樣品”還可以指在體內(nèi)被分析的細(xì)胞或組織，即不從動(dòng)物中移除。典型地，“生物樣品”將含有來(lái)自動(dòng)物的細(xì)胞，但該術(shù)語(yǔ)還可以指非細(xì)胞生物材料，例如血液、唾液或尿的非細(xì)胞級(jí)分，其可被用于測(cè)量癌癥相關(guān)多核苷酸或多肽水平?！吧飿悠贰边€指含有細(xì)胞組分(例如蛋白質(zhì)或核酸分子)的生物體已在其中繁殖的基質(zhì)，例如營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液或凝膠。
[0017]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“核酸樣品”表示含核酸的樣品。本文使用的核酸樣品可以是復(fù)合物，因它們包含多種不同的含序列分子。來(lái)自哺乳動(dòng)物(例如小鼠或人類)的基因組DNA是復(fù)合樣品的類型。復(fù)合樣品可具有多于104、15UO6或10 7種不同核酸分子。DNA靶標(biāo)可源自任何來(lái)源例如基因組DNA或人工DNA構(gòu)建體。本文中可以使用任何含核酸的樣品，例如由組織培養(yǎng)細(xì)胞或組織樣品制得的基因組DNA。
[0018]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“混合物”指的是散布且無(wú)任何特定順序的要素的組合?；旌衔锸钱愘|(zhì)的且不可在空間上分離成其不同組分。要素混合物的實(shí)例包括大量不同的溶解于相同水性溶液的要素，和大量不同的在隨機(jī)位置(即，不以特定順序)附著到固體支持物的要素?；旌衔锸菬o(wú)法尋址的。例如，如本領(lǐng)域中通常已知的，空間上分離的表面結(jié)合多核苷酸的陣列不是表面結(jié)合多核苷酸的混合物，因?yàn)楸砻娼Y(jié)合多核苷酸的種類在空間上不同且所述陣列是可尋址(addressable)的。
[0019]術(shù)語(yǔ)“核苷酸”旨在包括那些不僅含有已知嘌呤和嘧啶堿基以及含有已被修飾的其它雜環(huán)堿基的部分(moiety)。這些修飾包括甲基化的嘌呤或啼啶，?；泥堰驶蛱溧?，烷基化的核糖或其它雜環(huán)。此外，術(shù)語(yǔ)“核苷酸”包括那些包含半抗原或熒光標(biāo)記以及可以不僅包含常規(guī)核糖和脫氧核糖的糖，也可以包含其它糖的部分。經(jīng)修飾的核苷或核苷酸也包括對(duì)糖部分的修飾，例如，其中一個(gè)或多個(gè)羥基被鹵素原子或脂肪族基團(tuán)取代，官能化為醚、胺等。
[0020]術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互換使用，其用于描述任意長(zhǎng)度的聚合物，例如，多于約2個(gè)堿基，多于約10個(gè)堿基，多于約100個(gè)堿基，多于約500個(gè)堿基，多于1000個(gè)堿基，高達(dá)約10，000個(gè)或更多堿基構(gòu)成的核苷酸，例如，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，并可酶促地或合成地生產(chǎn)(例如，如美國(guó)專利號(hào)5，948，902和其中所引用的參考文獻(xiàn)中所述的PM)，其可以與天然存在的核酸以序列特異性的方式進(jìn)行雜交，該方式與兩種天然存在的核酸雜交類似，例如，能夠參與沃森-克里克堿基配對(duì)相互作用。天然存在的核苷酸包括鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶(分別為G、C、A、T和U)。DNA和RNA分別具有脫氧核糖和核糖骨架，但PNA的骨架由通過(guò)肽鍵相連的重復(fù)N-(2-氨乙基)-甘氨酸單元構(gòu)成。在PNA中，各種嘌呤和嘧啶堿基通過(guò)亞甲基羰基鍵連接到骨架上。鎖核酸(LNA)(通常被稱為無(wú)法接近的RNA)是經(jīng)修飾的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分被連接2’氧和4’碳的額外橋修飾。所述橋“封鎖”了 3’-內(nèi)(北(North))構(gòu)象的核糖，這通常發(fā)現(xiàn)于A-型雙鏈體(duplex)中。只要期望，可將LNA核苷酸與寡核苷酸中的DNA或RNA殘基混合。術(shù)語(yǔ)“非結(jié)構(gòu)化核酸”或“UNA”是含有相互之間結(jié)合的穩(wěn)定性較低非天然核苷酸的核酸。例如，非結(jié)構(gòu)化核酸可含有G’殘基和C’殘基，其中這些殘基分別對(duì)應(yīng)于G和C的非天然存在形式(即類似物)，它們穩(wěn)定性較低地相互堿基配對(duì)，但保留與天然存在的C和G殘基堿基配對(duì)的能力。US20050233340中描述了非結(jié)構(gòu)化核酸，其中關(guān)于UNA的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用被并入本文。
[0021]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“靶多核苷酸”指的是被研宄的目的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，靶多核苷酸含有一種或多種被研宄的目的序列。
[0022]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”表示長(zhǎng)度為約2-200個(gè)核苷酸，直至500個(gè)核苷酸的單鏈核苷酸多聚體。寡核苷酸可以是合成的或者可通過(guò)酶法制成，在一些實(shí)施方式中，其長(zhǎng)度為30-150個(gè)核苷酸。寡核苷酸可含有核糖核苷酸單體(即，可以是寡核糖核苷酸)或脫氧核糖核苷酸單體。例如，寡核苷酸的長(zhǎng)度可以為10-20、11-30、31-40、41-50、51-60、61-70,71-80,80-100,100-150 或 150-200 個(gè)核苷酸。
[0023]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“引物”指在純化的限制消化物中天然存在的或者通過(guò)合成產(chǎn)生的寡核苷酸，當(dāng)被放置在與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成被誘導(dǎo)的條件下時(shí)，即存在核苷酸和誘導(dǎo)劑(例如DNA聚合酶)且處于合適的溫度和pH時(shí)，其能夠擔(dān)當(dāng)合成起始點(diǎn)。引物可以是單鏈的或雙鏈的，但必須足夠長(zhǎng)以在誘導(dǎo)劑存在時(shí)啟動(dòng)期望延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長(zhǎng)度將取決于許多因素，包括溫度、引物來(lái)源和方法的使用。例如，對(duì)于診斷應(yīng)用，取決于靶序列的復(fù)雜性，寡核苷酸引物典型地含有15-25個(gè)或更多核苷酸，但它也可含有更少核苷酸。本文的引物被選擇為與特定靶DNA序列的不同鏈基本上互補(bǔ)。這意味著:引物必需足夠互補(bǔ)以與它們各自的鏈雜交。因此，引物序列不需要反映模板的確切序列。例如，非互補(bǔ)的核苷酸片段可被連接到引物的5’末端，而引物序列的其余部分與鏈互補(bǔ)?；蛘?，非互補(bǔ)堿基或更長(zhǎng)序列可散布在引物中，條件是:引物序列與鏈序列足夠互補(bǔ)以與其雜交并從而形成合成延伸產(chǎn)物的模板。
[0024]術(shù)語(yǔ)“雜交”指的是下述過(guò)程，其中核酸鏈在正常雜交條件下與第二互補(bǔ)核酸鏈退火并形成穩(wěn)定雙鏈體(同源雙鏈體或異源雙鏈體)，且在