專利名稱：一種鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種噬菌體分型鑒定方法，特別涉及鈍齒棒桿菌噬菌體的分型鑒定方法。
背景技術(shù)：
目前，對噬菌體的分類依據(jù)主要有①噬菌體形態(tài)；②噬菌體生理生化和物理性質(zhì)；③噬菌體基因組組成；④噬菌體蛋白；⑤噬菌體脂類含量和特性；⑥噬菌體碳水化合物含量和特性。這些依據(jù)適于對種以上的噬菌體的分類鑒定，而對同種不同噬菌體分離株卻不能加以分類鑒定。鈍齒棒桿菌(Cbrj^dacteriws creaato )噬菌體是感染氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)菌—— 鈍齒棒桿菌的噬菌體。在氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)的環(huán)境中鈍齒棒桿菌噬菌體的種類繁多，致使噬菌體污染問題一直嚴重威脅著氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)。為了防治氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)中的噬菌體污染問題，發(fā)酵生產(chǎn)過程中，需要經(jīng)常對感染鈍齒棒桿菌的噬菌體進行檢測，以盡早發(fā)現(xiàn)噬菌體污染，及時采取有效補救措施。為了從根本上杜絕生產(chǎn)中的噬菌體污染，必須研究建立防治鈍齒棒桿菌噬菌體污染的有效方法。這些工作均需要一種對不同種類鈍齒棒桿菌噬菌體進行分型鑒定的方法?，F(xiàn)在，對不同的鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定的方法，一直采用傳統(tǒng)的血清分型方法。血清分型方法是對微生物分類鑒定的傳統(tǒng)方法之一，雖然此方法對噬菌體的抗原表位具有較好的特異性，但由于氨基酸生產(chǎn)環(huán)境中鈍齒棒桿菌噬菌體種類繁多，變異較快，所以，一次制備的抗血清不能滿足對不同鈍齒棒桿菌噬菌體的分型鑒定的要求。另外，此方法也存在操作時間長，成本高等缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡便，快速，分辨率高的分型鑒定鈍齒棒桿菌噬菌體的方法。本發(fā)明可以鑒定鈍齒棒桿菌的不同噬菌體分離株。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定方法，包括如下步驟
1)獲得鈍齒棒桿菌噬菌體分離株；
2)提取鈍齒棒桿菌噬菌體DNA；
3)鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定分別用引物Pl和引物P2對提取的鈍齒棒桿菌噬菌體 DNA進行PCR擴增，
PCR 反應體系Taq 酶 12. 5ul、10uM 引物 1. 25ul、DNA 模板 Iul 和純水 10. 25ul ； PCR反應條件 預變性:94°C 2 min ；
變性94°C 1 min，退火36°C 1 min，延伸 72°C 2 min，40 次循環(huán)； 720C延伸10 min終止反應，產(chǎn)物4°C保存；取PCR反應液在瓊脂糖凝膠中進行電泳； 所述的引物Pl的堿基序列為GTTTCGCTCC ； 所述的引物P2的堿基序列為TCGCTGCGA。上述的一種鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定方法，其中所述的獲得鈍齒棒桿菌噬菌體分離株，可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已有的任何方法，只要從樣液中分離獲得鈍齒棒桿菌噬菌體分離株即可，而不具體限定其獲得的方法。鈍齒棒桿菌噬菌體分離株的獲得還可以采用如下步驟(1)樣品的處理將水樣樣品，經(jīng)由8層紗布過濾后，4000 rpm離心20 min，去除比較大的雜質(zhì)顆粒，再用無菌的
0.22 um過濾器過濾，收集過濾液，置于4 °C冰箱保存；( 噬菌體的富集取過濾液80 ml與5倍濃度的LB培養(yǎng)基20 ml混合，加入終濃度為0. 1 mmol/L的CaCl2溶液，以1%接種量向其接入對數(shù)末期(約12 h)的鈍齒棒桿菌懸液，30 °C，恒溫靜置培養(yǎng)M h;(3)噬菌體的擴增將富集的培養(yǎng)液在12000 rpm條件下，離心20 min,再經(jīng)0. 22 um濾膜過濾，收集濾液。將此濾液以1%接種量接入新鮮無菌LB液體培養(yǎng)基中，再向其接入1%的對數(shù)末期的鈍齒棒桿菌懸液，30 180 rpm恒溫振蕩培養(yǎng)6 h ； (4)噬菌體的平板分離將上述擴增后的噬菌體液進行稀釋，將0.1 ml噬菌體稀釋液和0.3 ml對數(shù)末期的鈍齒棒桿菌懸液混合，制成雙層平板。30 °C，恒溫培養(yǎng)12噬菌體純化挑取雙層平板上的不同噬菌斑，反復擴增3次，獲得純化的噬菌體分離株。上述的鈍齒棒桿菌噬菌體分離株的獲得，其中鈍齒棒桿菌是鈍齒棒桿菌CGMCC
1.542。本發(fā)明采用人工合成的隨機寡核苷酸片斷作為引物(即隨機引物)，以基因組總 DNA作為模板，對鈍齒棒桿菌噬菌體DNA進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，檢測擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性圖譜，通過分析PCR產(chǎn)物圖譜，區(qū)分不同鈍齒棒桿菌噬菌體株的遺傳差異性，以此對不同鈍齒棒桿菌噬菌體分離株進行分型鑒定。隨機引物的篩選隨機引物有10種，即P1 :GTTTCGCTCC, P2 :TCGCTGCGA，P3 GGGAACCGTC, P4 :TCCAACGGCT， P5 :TCACCAGCCA ， P6 :GGACGTTGAG ， P7 :CACCACTAGG ， P8 CTCTGGAGAC，P9 :CATCCCCCTG，PlO :CCGAAGGGTG。上述引物由上海生物工程公司合成。具體篩選方法如下
1)獲得鈍齒棒桿菌噬菌體用標準的鈍齒棒桿菌噬菌體OGl IVCAS 3. 0076進行引物的篩選。2)提取鈍齒棒桿菌噬菌體DNA 將純化的噬菌體液經(jīng)8000 rpm離心10 min，用 0.22 um濾膜過濾，分別加入終濃度為lug/mL的DNase I和RNase A，37°C溫育30 min。取 700 ul消化后的噬菌體液，加入70 ul濃度為10%的SDS，4. 2 ul濃度為20 mg/mL的蛋白酶K，65°C溫育30 min，再加入等體積酚/氯仿(酚氯仿異丙醇=25 : :1)，12000 rpm離心7 min，取上層水相，加入1倍體積的3 mol/L乙酸鈉，2倍體積的無水乙醇，冰上放置20 min，接著12000 rpm離心10 min，加入Iml濃度為80%乙醇，12000 rpm離心10 min，沉淀物于室溫下風干，將沉淀溶解于20 ul的TE (10 mM Tris-HCI,lmM EDTA ；pH 8.0)緩沖液中。3)鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定將提取的噬菌體DNA分別經(jīng)引物Pl PlO進行 PCR擴增；
4PCR的反應體系Taq酶12. 5 ul，引物(10 uM) 1. 25 111，0嫩模板1 ul，純水10.25 ul，反應總體積25 ul ； PCR反應條件 預變性:94°C 2 min ；
變性94°C 1 min，退火36°C 1 min，延伸 72°C 2 min，40 次循環(huán)； 720C延伸10 min終止反應，產(chǎn)物4°C保存； 取PCR反應液在瓊脂糖凝膠中進行電泳，電泳圖譜結(jié)果如圖1。為了對鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定的隨機引物進行篩選，以條帶穩(wěn)定、豐富、清晰為標準，確定最佳引物。如圖1所示，泳道1為1 lib Marker，泳道2_11依次為隨機引物 1-10，泳道12為陰性對照。由圖1可見，以隨機引物Pl和隨機引物P2擴增出現(xiàn)的信息含量豐富，因此選用隨機引物Pl和隨機引物P2作為本發(fā)明對噬菌體分型鑒定的引物。本發(fā)明的有益效果是由于本發(fā)明是基于PCR技術(shù)，對模板DNA要求不高，分型操作時間短，分辨率高。本發(fā)明只需引物Pl和P2即可將樣液中獲得的不同鈍齒棒桿菌噬菌體株進行分型鑒定，成本低。本發(fā)明可用來解決氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)過程中的鈍齒棒桿菌噬菌體污染的監(jiān)測和對氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)境中鈍齒棒桿菌噬菌體的分型鑒定等問題。


圖1是鈍齒棒桿菌噬菌體ΦGl IVCAS 3. 0076的隨機引物篩選結(jié)果的電泳圖譜。圖2Α是使用隨機引物Pl擴增5株標準鈍齒棒桿菌噬菌體的PCR產(chǎn)物的電泳圖譜；
圖中，泳道1為1 1Λ marker，泳道2_6分別為鈍齒棒桿菌噬菌體Φ61 IVCAS 3. 0076、 Φ63 IVCAS 3. 0077、Φ68 IVCAS 3. 0078、Φ612 IVCAS 3. 0079、Φ615 IVCAS 3. 0080 的 PCR產(chǎn)物。圖2B是使用隨機引物P2擴增5株標準鈍齒棒桿菌噬菌體的PCR產(chǎn)物的電泳圖
■；並 1曰；
圖中，泳道1為11Λ Marker，泳道2_6分別為鈍齒棒桿菌噬菌體Φ61 IVCAS 3. 0076、 Φ63 IVCAS 3. 0077、Φ68 IVCAS 3. 0078、Φ612 IVCAS 3. 0079、Φ615 IVCAS 3. 0080 的 PCR產(chǎn)物。圖3A是使用隨機引物Pl擴增樣品中獲得的3株鈍齒棒桿菌噬菌體分離株的PCR 產(chǎn)物的電泳圖譜；
圖中，泳道1為1 lib marker,泳道2_4分別為鈍齒棒桿菌噬菌體分離株Cp09_001， Cp09-002 和 Cp09-003 的 PCR 產(chǎn)物。圖;3B是使用隨機引物P2擴增樣品中獲得的3株鈍齒棒桿菌噬菌體分離株的PCR 產(chǎn)物的電泳圖譜；
圖中，泳道1為1 lib marker,泳道2_4分別為鈍齒棒桿菌噬菌體分離株Cp09_001， Cp09-002 和 Cp09-003 的 PCR 產(chǎn)物。
具體實施例方式實施例1 可行性驗證1)鈍齒棒桿菌噬菌體的獲得5株標準鈍齒棒桿菌噬菌體分別為Φ61 IVCAS 3.0076, Φ63 IVCAS 3.0077, Φ68 IVCAS 3.0078, Φ612 IVCAS 3.0079, Φ615 IVCAS 3. 0080。標準鈍齒棒桿菌噬菌體ΦGl IVCAS 3. 0076、Φ63 IVCAS 3. 0077、Φ68 IVCAS 3.0078、Φ612 IVCAS 3. 0079和Φ615 IVCAS 3. 0080購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)。2)鈍齒棒桿菌噬菌體DNA的提取將純化的噬菌體液經(jīng)8000 rpm離心10 min, 用0. 22um濾膜過濾，分別加入終濃度為lug/mL的DNase I和RNase A，37°C溫育30 min。 取700 ul消化后的噬菌體液，加入70 ul濃度為10%的SDS，4. 2 ul濃度為20 mg/mL的蛋白酶K，65°C溫育30 min，再加入等體積酚/氯仿(酚氯仿異丙醇=25 : :1)，12000 rpm 離心7 min，取上層水相，加入1倍體積的3 mol/L乙酸鈉，2倍體積的無水乙醇，冰上放置 20 min，接著 12000 rpm 離心 10 min，加入 1 ml 80% 乙醇，12000 rpm 離心 10 min，沉淀物于室溫下風干，將沉淀溶解于20 ul的TE (10 mM Tris-HCI,l mM EDTA ；pH8. 0)緩沖液中。3)鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定將提取的噬菌體DNA分別經(jīng)引物Pl和P2進行PCR 擴增；
PCR的反應體系Taq酶12. 5 ul，引物(10 uM) 1. 25 111，0嫩模板1 ul，純水10.25 ul，反應總體積25 ul ； PCR反應條件 預變性:94°C 2 min ；
變性94°C 1 min，退火36°C 1 min，延伸 72°C 2 min，40 次循環(huán)； 720C延伸10 min終止反應，產(chǎn)物4°C保存；
取PCR反應液在瓊脂糖凝膠中進行電泳，采用引物Pl的結(jié)果如圖2A，采用引物P2的結(jié)果如圖2B。為驗證本發(fā)明用于鈍齒棒桿菌噬菌體分型的可行性，使用隨機引物Pl和P2對5 株標準鈍齒棒桿菌噬菌體 ΦGl IVCAS 3. 0076、Φ63 IVCAS 3. 0077、Φ68 IVCAS 3. 0078、 Φ612 IVCAS 3. 0079, Φ615 IVCAS 3. 0080 進行分型鑒定。由圖2Α可以看出，使用隨機引物Ρ1，盡管泳道4，6的帶型相同，但泳道2，3，5的帶型明顯不同。然而，使用隨機引物Ρ2 (圖2Β)，泳道2， 3，4，5，6之間的帶型明顯不同。 表明同時使用隨機引物Pl和隨機引物Ρ2，分別對5株鈍齒棒桿菌噬菌體DNA進行PCR擴增， 根據(jù)其電泳結(jié)果完全可以將5株鈍齒棒桿菌噬菌體進行區(qū)分，即可達到對鈍齒棒桿菌噬菌體的分型鑒定。實施例2 實際應用1
鈍齒棒桿菌選用鈍齒棒桿菌CGMCC 1. Μ2，購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。1)獲得鈍齒棒桿菌噬菌體分離株取某氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)境中排出的廢水，經(jīng)由 8層紗布過濾后，4000 rpm離心20 min，去除比較大的雜質(zhì)顆粒；再用無菌的0. 22 um過濾器過濾，收集過濾液，置于4 °C冰箱保存。取過濾液80 ml與5倍濃度的LB培養(yǎng)基20 ml 混合，加入終濃度為0.1 mmol/L的&(12溶液，以1%接種量向其接入對數(shù)末期(約12 h)的鈍齒棒桿菌懸液，30 °C，恒溫靜置培養(yǎng)M h。將富集的培養(yǎng)液在12000 rpm條件下，離心20 min，再經(jīng)0.22 um濾膜過濾，收集濾液。將此濾液以1%接種量接入新鮮無菌LB液體培養(yǎng)基中，再向其接入1%的對數(shù)末期的鈍齒棒桿菌懸液，30 180 rpm恒溫振蕩培養(yǎng)6 h。噬菌體的平板分離將上述擴增后的噬菌體液進行稀釋，將0. 1 ml噬菌體稀釋液和0. 3 ml 對數(shù)末期的鈍齒棒桿菌懸液混合，制成雙層平板。30 °C，恒溫培養(yǎng)12 h。挑取雙層平板上的不同噬菌斑，反復擴增3次，得到3株鈍齒棒桿菌噬菌體分離株，分別定名為CplO-OOl， Cp10-002 和 Cp10-003。2)提取鈍齒棒桿菌噬菌體DNA;將純化的噬菌體液經(jīng)8000 rpm離心10 min，用 0.22 um濾膜過濾，分別加入終濃度為1 ug/mL的DNase I和RNase A，37°C溫育30 min。 取700 ul消化后的噬菌體液，加入70 ul濃度為10%的SDS，4. 2 ul濃度為20 mg/mL的蛋白酶K，65°C溫育30 min，再加入等體積酚/氯仿(酚氯仿異丙醇=25 : :1)，12000 rpm 離心7 min,取上層水相，加入1倍體積的3mol/L乙酸鈉，2倍體積的無水乙醇，冰上放置20 min，接著12000 rpm離心10 min，加入Iml 80%乙醇，12000 rpm離心10 min，沉淀物于室溫下風干，將沉淀溶解于20 ul的TE (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA ；pH8. 0)緩沖液中。3)鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定將提取的鈍齒棒桿菌噬菌體DNA分別經(jīng)引物Pl和引物P2進行PCR擴增，
PCR 反應體系=Taq 酶 12. 5 ul、10 uM 引物 1. 25 ul、DNA 模板 1 ul 和純水 10. 25 ul, 反應總體積25 ul ； PCR反應條件 預變性:94°C 2 min ；
變性94°C 1 min，退火36°C 1 min，延伸 72°C 2 min，40 次循環(huán)； 720C延伸10 min終止反應，產(chǎn)物4°C保存；
取PCR反應液在瓊脂糖凝膠中進行電泳。采用引物Pl的結(jié)果如圖3A，采用引物P2的結(jié)果如圖:3B。由圖3A可以看出，使用隨機引物P1，泳道2與泳道3，4的帶型明顯不同，但泳道 3和4的帶型幾乎相同。而使用隨機引物P2(圖;3B)，泳道2，3的帶型幾乎相同，而它們與泳道4的帶型明顯不同。表明獲得的3株鈍齒棒桿菌噬菌體分離株Cp 10-001，Cp 10-002和 Cpl0-003為三種不同類型的鈍齒棒桿菌噬菌體。也進一步證明單一使用隨機引物Pl或P2 都不能完全區(qū)分3株鈍齒棒桿菌噬菌體分離株，但綜合隨機引物Pl和P2的結(jié)果可以明顯地區(qū)分3株鈍齒棒桿菌噬菌體。實施例3 實際應用2
1)獲得鈍齒棒桿菌噬菌體分離株分別取某氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)境中的排污口水樣，發(fā)酵廢液，車間地溝水樣，每個樣液經(jīng)由8層紗布過濾后，4000 rpm離心20 min，去除比較大的雜質(zhì)顆粒；再用無菌的0.22 um過濾器過濾，收集過濾液，置于4 ！冰箱保存。取過濾液 80 ml與5倍濃度的LB培養(yǎng)基20 ml混合，加入終濃度為0. 1 mmol/L的CaCl2溶液，以1% 接種量向其接入對數(shù)末期(約12 h)的鈍齒棒桿菌懸液，30 °C，恒溫靜置培養(yǎng)M h。將富集的培養(yǎng)液在12000 rpm條件下，離心20 min，再經(jīng)0. 22 um濾膜過濾，收集濾液。將此濾液以1%接種量接入新鮮無菌LB液體培養(yǎng)基中，再向其接入1%的對數(shù)末期的鈍齒棒桿菌懸液，30 180 rpm恒溫振蕩培養(yǎng)6 h。噬菌體的平板分離將上述擴增后的噬菌體液進行稀釋，將0.1 ml噬菌體稀釋液和0. 3 ml對數(shù)末期的鈍齒棒桿菌懸液混合，制成雙層平板。 30 °C，恒溫培養(yǎng)12 h。挑取雙層平板上的不同噬菌斑，反復擴增3次。在排污口水樣，發(fā)酵廢液，車間地溝水樣中分別各獲得5株鈍齒棒桿菌噬菌體分離株。在每個樣品中獲得的鈍齒棒桿菌噬菌體分離株中各隨機選取1株進行以下的實驗。2)提取鈍齒棒桿菌噬菌體DNA ；將純化的噬菌體液經(jīng)8000 rpm離心10 min，用 0.22 um濾膜過濾，分別加入終濃度為1 ug/mL的DNase I和RNase A，37°C溫育30 min。 取700 ul消化后的噬菌體液，加入70 ul濃度為10%的SDS，4. 2 ul濃度為20 mg/mL的蛋白酶K，65°C溫育30 min，再加入等體積酚/氯仿(酚氯仿異丙醇=25 : :1)，12000 rpm 離心7 min,取上層水相，加入1倍體積的3mol/L乙酸鈉，2倍體積的無水乙醇，冰上放置20 min，接著12000 rpm離心10 min，加入Iml濃度為80%的乙醇，12000 rpm離心10 min，沉淀物于室溫下風干，將沉淀溶解于20 ul的TE (10 mM Tris-HCI,l mM EDTA ；pH8. 0)緩沖液中。3)鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定將提取的3株鈍齒棒桿菌噬菌體DNA分別經(jīng)引物 Pl和引物P2進行PCR擴增，
PCR反應體系Taq酶12. 5 ul、10 uM引物1.25 ul、DNA模板Iul和純水10. 25 ul，反應總體積25 ul ； PCR反應條件 預變性:94°C 2 min ；
變性94°C 1 min，退火36°C 1 min，延伸 72°C 2 min，40 次循環(huán)； 720C延伸10 min終止反應，產(chǎn)物4°C保存。PCR反應液在瓊脂糖凝膠中進行電泳后的分析結(jié)果表明，使用Pl引物，在3株噬菌體中，來源于發(fā)酵廢液和車間地溝水樣的噬菌體的PCR擴增結(jié)果的電泳圖譜帶型相同，而使用P2引物，則來源于排污口水樣和車間地溝水樣的噬菌體的PCR擴增結(jié)果的電泳圖譜帶型相同，綜合分析使用Pl引物和使用P2引物的實驗結(jié)果，表明3個樣品中的鈍齒棒桿菌噬菌體分離株是不同的。綜合以上實驗結(jié)果可以看出，只選定隨機引物Pl或P2都不能用來分型鑒定鈍齒棒桿菌噬菌體分離株，但同時選用隨機引物Pl和P2，完全可以將獲得的不同鈍齒棒桿菌噬菌體分離株區(qū)分開來。在以上實施例中，針對鈍齒棒桿菌噬菌體分離株的獲得提供了一種具體的方法， 但是本發(fā)明鈍齒棒桿菌噬菌體分離株的獲得方法并不限于上述方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中公開的方法，只要從樣液中能夠獲得鈍齒棒桿菌噬菌體分離株即可，本發(fā)明的關(guān)鍵在于采用RAPD的技術(shù)，從眾多的引物中篩選出引物Pl和P2，同時使用引物Pl和P2 進行PCR擴增即可對鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定。對于鈍齒棒桿菌噬菌體DNA的提取，提供一種具體的方法，同樣本發(fā)明對于鈍齒棒桿菌噬菌體DNA的提取并不限于上述方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中公開的方法，只要從鈍齒棒桿菌噬菌體中提取其DNA即可。
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權(quán)利要求
1.一種鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定方法，其特征在于包括如下步驟1)獲得鈍齒棒桿菌噬菌體分離株；2)提取鈍齒棒桿菌噬菌體DNA；3)鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定分別用引物Pl和引物P2對獲得的鈍齒棒桿菌噬菌體 DNA進行PCR擴增，PCR 反應體系Taq 酶 12. 5 ul、10 uM 引物 1. 25 ul.DNAllfe. 1 ul 和純水 10. 25 ul ；PCR反應條件預變性:94°C 2 min ；變性94°C 1 min，退火36°C 1 min，延伸 72°C 2 min，40 次循環(huán)；720C延伸10 min終止反應，產(chǎn)物4°C保存；取PCR反應液在瓊脂糖凝膠中進行電泳；所述的引物Pl的堿基序列為GTTTCGCTCC ；所述的引物P2的堿基序列為TCGCTGCGA。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定方法，其特征在于所述的獲得鈍齒棒桿菌噬菌體分離株的步驟如下(1)樣品的處理將水樣樣品，經(jīng)8層紗布過濾后，4000 rpm離心20 min，去除較大的雜質(zhì)顆粒，再用無菌的0. 22 um濾膜過濾，收集過濾液，置于4 ！冰箱保存；(2)噬菌體的富集取過濾液80 ml與5倍濃度的LB培養(yǎng)基20 ml 混合，加入終濃度為0. 1 mmol/L的CaCl2溶液，以1%接種量向其接入對數(shù)末期的鈍齒棒桿菌懸液，30°C，恒溫靜置培養(yǎng)M h; (3)噬菌體的擴增將富集的培養(yǎng)液在12000 rpm條件下，離心20 min，再經(jīng)0.22 um濾膜過濾，收集濾液，將此濾液以1%接種量接入新鮮無菌LB 液體培養(yǎng)基中，再向其接入1%的對數(shù)末期的鈍齒棒桿菌懸液，30 180 rpm恒溫振蕩培養(yǎng)6 h;(4)噬菌體的平板分離將上述擴增后的噬菌體液進行稀釋，將0.1 ml噬菌體稀釋液和0.3 ml對數(shù)末期的鈍齒棒桿菌懸液混合，制成雙層平板，30 °C，恒溫培養(yǎng)12 h ； (5) 噬菌體純化挑取雙層平板上的不同噬菌斑，反復擴增3次，獲得純化的噬菌體分離株。
3.按照權(quán)利要求2所述的一種鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定方法，其特征在于所述的鈍齒棒桿菌是鈍齒棒桿菌CGMCC 1. 542ο
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定方法。采用的技術(shù)方案是包括如下步驟1)獲得鈍齒棒桿菌噬菌體分離株；2)提取鈍齒棒桿菌噬菌體DNA；3)鈍齒棒桿菌噬菌體分型鑒定分別用引物P1和引物P2對提取的鈍齒棒桿菌噬菌體DNA進行PCR擴增；取PCR反應液在瓊脂糖凝膠中進行電泳；所述的引物P1的堿基序列為GTTTCGCTCC；所述的引物P2的堿基序列為TCGCTGCGA。本發(fā)明簡便，快速，分辨率高，可以鑒定鈍齒棒桿菌的不同噬菌體分離株。
文檔編號C12Q1/70GK102277449SQ20111020202
公開日2011年12月14日 申請日期2011年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月19日
發(fā)明者曹向宇, 李鐵民, 杜波 申請人:遼寧大學