專利名稱：人il-15亞型蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人單抗蛋白的制備，特別涉及一種人I L-15亞型蛋白制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
IL-15mRNA(interleukin 15，IL-15)廣泛表達于各種組織中，包括胎盤、骨骼肌、 腎臟、心臟、肺、腦、腸上皮，并同樣表達于髓系的造血干細胞中比如巨噬細胞、樹突狀細胞。 IL-15在結(jié)構(gòu)上與白細胞介素2(interleukin 2，IL-2)有同源性，IL-15受體由具有高親 和力的IL-15受體a鏈、IL-2/15受體β鏈以及公共鏈Y鏈組成，因此IL-15具有一些和 IL-2相近的功能，比如刺激T細胞活化和增殖，增強NK細胞殺傷活性并促進B細胞產(chǎn)生免 疫球蛋白。最近研究發(fā)現(xiàn)IL-15在NK細胞、NKT細胞以及腸上皮細胞的分化、增殖、活化過 程中發(fā)揮了重要作用，IL-15與IL-17對⑶8記憶性T細胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)非常重要。研究還 證明IL-15通過一種特殊的“反遞呈”機制來調(diào)控⑶8記憶性T細胞的增殖和NK細胞的生 存周期，即一種表達IL_15a鏈?zhǔn)荏w的細胞能夠?qū)L-15遞呈給表達IL-15i3鏈和、鏈的 細胞。更多的研究表明IL-15是一種有廣泛生物學(xué)功能的功能強大的細胞因子，除了對免 疫系統(tǒng)有著重要的調(diào)節(jié)作用，在非免疫系統(tǒng)中也同樣重要，比如對骨骼肌合成代謝也發(fā)揮 重要調(diào)節(jié)作用。由于IL-15具有強大的免疫調(diào)節(jié)功能，并對多種器官具有潛在的調(diào)節(jié)作用，因此 其在體內(nèi)的表達在多個水平受到嚴格控制。人和小鼠的IL-15基因5'調(diào)控區(qū)均包含干擾 素反應(yīng)因子元件(IRF-E)及NF- κ B結(jié)合位點用于上調(diào)IL-15mRNA的表達。IL-15基因的調(diào) 控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，IL-15mRNA的5' UTR區(qū)域存在的多個起始密碼子(小鼠為5個 AUGs，人類為12個AUGs)阻礙了 IL-15蛋白的有效翻譯，IL-15mRNA的3' UTR區(qū)域的調(diào)控 序列同樣能阻止IL-15蛋白的分泌。選擇性剪切也同樣參與了對IL-15基因表達的調(diào)控。早期研究發(fā)現(xiàn)的兩種IL-15亞型編碼相同的成熟蛋白，但是其信號肽之間存在區(qū) 別由48aa組成的長信號肽(LSP)從3號外顯子中編碼區(qū)內(nèi)的真正的起始密碼子開始表 達，而21aa短信號肽(SSP)則由一個新產(chǎn)生的5號外顯子中的起始密碼子開始表達終止于 非成熟的終止密碼子。這些不同的信號肽將IL-15蛋白運輸至胞外不同的位置。短信號 肽IL-15亞型，蛋白翻譯效率很高，但是很難分泌；而長信號肽IL-15亞型，蛋白翻譯效率較 低，但是能直接被運輸至高爾基體并分泌。由于IL-15主要通過IL-15Ra的反式遞呈發(fā)揮 功能，共調(diào)節(jié)IL-15及IL-15R有可能會促使IL-15產(chǎn)生多種功能活性。申請人:先前申請了專利申請?zhí)枮?01010167604. 7小鼠IL-15亞型蛋白的制備方 法及其應(yīng)用。由于小鼠IL-15亞型蛋白具有免疫原性，易產(chǎn)生抗抗體引起的過敏反應(yīng)，限制 了 IL-15亞型蛋白的應(yīng)用，而人源IL-15亞型可以克服這一點缺陷。申請人對人源IL-15 亞型蛋白進行研究，發(fā)現(xiàn)該蛋白與鼠源IL-15亞型蛋白有73%的同源性。體外實驗也已證 明鼠源的IL-15亞型確實能夠抑制自身免疫病患者的外周血淋巴細胞的增殖，但是從臨床 應(yīng)用的安全性考慮，同樣具有免疫抑制功能的人源IL-15亞型在臨床治療上將更為安全有效，人源IL-15亞型蛋白能夠更好地與人IL-15受體結(jié)合從而發(fā)揮更有效的競爭抑制作用， 因此本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)并制備的人IL-15亞型蛋白將有望成為一種有效治療自身免疫性疾病 又無毒副作用的自身免疫疾病新型藥物。本發(fā)明首次于人外周血細胞處于免疫激活狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)該種亞型，提示該種亞型蛋 白可能在免疫體系的負反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明目的為提供人IL-15亞型蛋白，及制備在免疫體系處于激發(fā)態(tài)下制備人 IL-15亞型蛋白，通過體外實驗檢測其對正常IL-15蛋白的拮抗作用，提供該亞型蛋白在自 身免疫性疾病等臨床治療中的應(yīng)用。技術(shù)方案為達到上述目的，本發(fā)明具體技術(shù)方案一種人IL-15亞型蛋白，其特征在于其氨基酸序列為SeqNO. 4 ；一種人IL-14亞型蛋白，其特征在于編碼基因序列為Seq NO. 3。一種制備人IL-15亞型蛋白的方法包括以下步驟(1)擴增人IL-15亞型基因片段取正常人外周血，制備外周血單個核細胞PBMC 懸液，使用0. 1 μ g/ml-100yg/m LPS作用24h_72h刺激，獲得刺激后的外周血PBMC懸液，通 過Trizol-氯仿法抽提總RNA ；根據(jù)NCBI所公布人IL_15cDNA序列NM-000585及pET43. 1 原核表達載體的結(jié)構(gòu)設(shè)計特異性引物SeqNO. 1和SeqNO. 2，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-PCR操作擴增獲得人 IL-15目的片段；(2)獲取IL-15亞型基因克隆取步驟1所得PCR產(chǎn)物，按照凝膠回收試劑盒說明 回收IL-15基因亞型片段。將回收所得PCR產(chǎn)物與PGEM-T克隆載體連接、4°C連接過夜。取 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DHlOB的感受態(tài)細菌，挑菌并酶切鑒定獲得陽性質(zhì)粒。取該質(zhì)粒進一步測 序鑒定其基因序列見Seq NO. 3。(3)構(gòu)建重組IL-15的pET43. 1原核表達載體取測序鑒定正確的步驟2所得質(zhì) 粒及原核表達載體PET43. 1，分別進行SacI、XhoI內(nèi)切酶雙酶切并按照凝膠回收試劑盒說 明書回收酶切所得片段。將回收所得酶切片段連接過夜，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DHlOB菌， 挑菌，按照質(zhì)粒小抽試劑盒說明抽提質(zhì)粒酶切鑒定。(4)pET43. 1_IL_15轉(zhuǎn)化菌的表達取鑒定正確的步驟3中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細 胞BL21 (DE3)，挑取單菌落，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，篩選正確轉(zhuǎn)化的表達菌PET43. 1-IL-15/ BL21。本發(fā)明采用轉(zhuǎn)化菌自發(fā)表達方案進行融合蛋白的表達。這種實驗方案，只需轉(zhuǎn)化菌 生長密度培養(yǎng)至飽和，操作方便，且其表達量可達IPTG誘導(dǎo)的幾倍，Western-blot鑒定所 得融合蛋白。(5)純化并獲得無標(biāo)簽的IL-15亞型蛋白非變性裂解液裂解步驟4所得融合蛋 白，并進行超聲裂解。取所得蛋白樣品經(jīng)蛋白純化工作站進行純化。應(yīng)用超濾離心管去除純 化所得蛋白中的咪唑，腸激酶切融合蛋白中用于提高表達蛋白可溶性的大片段的Nu S-標(biāo) 簽蛋白。利用超濾離心截留管離心酶切處理后的蛋白樣品，所得濾膜的下層液，即為酶切后 的無標(biāo)簽蛋白的IL-15亞型蛋白，Western-blot鑒定所得該亞型蛋白，見Seq N0. 4。
本發(fā)明還涉及該IL-15亞型蛋白的功能檢測。其功能檢測包括以下步驟 (DCTLL-2細胞增殖實驗檢測純化所得IL-15亞型蛋白的功能收集生長良好的 CTLL-2細胞，制備成細胞懸液。取制備好的IL-15及其亞型的純化蛋白，及rhIL_15蛋白標(biāo) 準(zhǔn)品，進行梯度稀釋，100 μ 1/孔加入96孔板中，每反應(yīng)孔也同樣加入100μ 1的CTLL-2細 胞，并設(shè)只加入100 μ 1 CTLL-2細胞和100 μ 11640培養(yǎng)基的孔作為對照。37°C、5% CO2培 養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，于檢測前6h加入3H(1 μ Ci/孔)，收集細胞，β液閃計數(shù)器計數(shù)。(2)IL-15亞型蛋白在免疫激活狀態(tài)中的負調(diào)控功能取C57BL/6小鼠脾臟，制備 脾細胞懸液加至96孔板中，加入倍比稀釋的LPS培養(yǎng)24h，另設(shè)兩組在此基礎(chǔ)上分別加入倍 比稀釋的純化所得正常IL-15蛋白及IL-15亞型蛋白培養(yǎng)24h，各組稀釋度均設(shè)3個復(fù)孔， 37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，于檢測前6h加入3H(lyC i/孔)，收集細胞，β液閃計數(shù)器 計數(shù)。一種人IL-15亞型蛋白在制備自身免疫性疾病藥物的應(yīng)用。所述的自身免疫性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、強直性脊柱炎、炎癥性腸 病、難治性乳糜泄、銀屑病、丙型病毒性肝炎和逆轉(zhuǎn)錄病毒HTLV-I相關(guān)疾病、阿狄森病、兒 童哮喘、纖維肌痛、慢性疲勞綜合征、甲狀腺炎、血管炎、克隆病、腸炎以及雷諾氏病的任一 種或多種。本研究同樣取臨床上進行初診的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的外周血進行實驗，經(jīng)紅細 胞裂解處理后，取病人外周血直接進行培養(yǎng)，并加入LPS刺激培養(yǎng)72h，同時取正常人外周 血同樣經(jīng)過或未經(jīng)LPS刺激進行培養(yǎng)作為對照。取所培養(yǎng)的外周血細胞抽提總RNA并進行 逆轉(zhuǎn)錄-PCR。結(jié)果顯示，正常人外周血經(jīng)LPS刺激72h后出現(xiàn)小片段的亞型條帶，而患者的 外周血則刺激不出小片段的亞型條帶。該實驗?zāi)壳耙咽占?名患者外周血進行研究，均能 得到很好的重復(fù)，從而證明在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中無法產(chǎn)生此種具有拮抗作用的IL-15 亞型。流感病毒所引發(fā)的急性肺炎會導(dǎo)致流感患者尤其是處于兒童階段的流感患者極 高的病死率。Risa Nakamura等發(fā)現(xiàn)IL-15敲基因小鼠在感染流感病毒后其急性肺炎發(fā)病 率顯著降低，而機體抵抗流感病毒的能力卻未受影響，這就預(yù)示著阻斷流感患者體內(nèi)IL-15 的功能能夠在不影響患者對流感病毒的抵抗能力的情況下，顯著降低流感所致的急性肺 炎的發(fā)病率及病死率。本發(fā)明已證明所發(fā)現(xiàn)的缺少六號外顯子的IL-15亞型蛋白對正常 IL-15功能起到負調(diào)控作用，因此該種IL-15亞型蛋白在用于流感所致的急性肺炎治療上 具有非常廣闊的應(yīng)用前景。有益效果1、申請人先前申請了專利號為201010167604. 7小鼠IL-15亞型蛋白的制備方法 及其應(yīng)用。由于小鼠IL-15亞型蛋白具有免疫原性，易產(chǎn)生抗抗體引起的過敏反應(yīng)，限制了 IL-15亞型蛋白的應(yīng)用，而人源IL-15亞型可以克服這一點缺陷。申請人對人源IL-15亞型 蛋白進行研究，發(fā)現(xiàn)該蛋白與鼠源IL-15亞型蛋白有73%的同源性。2、IL-15是一種促炎癥細胞因子，可通過抑制IL_2誘導(dǎo)的AI⑶及促進⑶8+記憶 性T細胞生存而導(dǎo)致自身免疫性疾病。本發(fā)明于LPS刺激過的人外周血細胞發(fā)現(xiàn)缺失第6 號外顯子的IL-15亞型。本發(fā)明所述拮抗正常IL-15基因功能的IL-15亞型蛋白為制備預(yù) 防或治療IL-15基因高表達相關(guān)疾病的藥物或制劑提供了新的、較好的選擇。
本研究于人外周血細胞經(jīng)過LPS刺激培養(yǎng)即在免疫系統(tǒng)激活狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)了該種 亞型，并通過研究證明未經(jīng)LPS刺激的脾細胞檢測不到該種亞型，而在LPS刺激后的原代培 養(yǎng)或細胞株來源的巨噬細胞及B細胞中均可檢測到該亞型，提示該亞型有可能在免疫系統(tǒng) 激活的條件下發(fā)揮著重要的負反饋調(diào)控功能。
一般而言，由mRNA選擇性剪切所形成的蛋白亞型被認為是產(chǎn)生蛋白功能多樣性， 組織特異性的一種進化方式。更為特殊的是IL-15基因?qū)儆谒穆菪鞍准易?，該家族?許多細胞因子均可通過選擇性剪切產(chǎn)生相應(yīng)亞型，其中IL-2和IL-4通過選擇性剪切形成 的亞型均對其自身功能發(fā)揮競爭性抑制作用。IL-2和IL-4均通過長的AB環(huán)與IL_2Ra結(jié) 合，而其選擇性剪切產(chǎn)生的亞型由于缺失2號外顯子導(dǎo)致其編碼的AB環(huán)主要部分缺失，從 而形成了天然的IL-2、IL-4的拮抗蛋白，研究表明IL-2、IL-4基因亞型能抑制T細胞的增 殖。本研究的體外實驗數(shù)據(jù)也同樣顯示了缺失6號外顯子的IL-15蛋白亞型對正常IL-15 蛋白的功能活性具有負向調(diào)控作用，并能抑制LPS產(chǎn)生的刺激細胞增殖的功能。然而研究 證明IL-15并不依靠AB環(huán)與IL-15Ra相結(jié)合，因此該種IL-15亞型蛋白的負調(diào)控功能并非 由此種機制實現(xiàn)。本研究通過軟件構(gòu)建該亞型蛋白結(jié)構(gòu)并進行分析發(fā)現(xiàn)，缺失了 6號外顯 子的IL-15亞型蛋白可能由于其無法形成功能活性的二聚體，而直接以單體形式與IL-15R 競爭結(jié)合，從而產(chǎn)生了對正常IL-15蛋白的負調(diào)控功能。2、大量研究證明IL-15是一種促炎癥細胞因子，Alleva等研究發(fā)現(xiàn)IL-15位于 促炎癥細胞因子鏈的頂部即始發(fā)者。IL-15表達引發(fā)促炎細胞因子TNFa、IL-U IL-6、 MIPl α ,MIPl β和IL_8異常高水平表達。而且，IL-15可通過抑制IL-2誘導(dǎo)的AI⑶及促 進CD8+記憶性T細胞生存而導(dǎo)致自身免疫性疾病。事實上多種自身免疫性炎癥性疾病患者 IL-15表達失調(diào)，諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、炎癥性腸病、難治性乳糜泄、銀屑病、丙 型病毒性肝炎和逆轉(zhuǎn)錄病毒HTLV-I相關(guān)疾病。目前已經(jīng)研制了多種抑制IL-15活性的藥物，包括可溶性IL-15R α、突變的 IL-15和針對IL-15或IL-2/15R3的特異性抗體。一種C末端Q101D、Q108DIL_15突變體 /Fe y 2a融合蛋白具有拮抗體外IL-15激發(fā)的細胞增殖作用，這種突變型IL-15可明顯減 輕小鼠發(fā)生抗原特異性遲發(fā)型超敏反應(yīng)并延長胰島細胞移植物生存時間。應(yīng)用可溶性高親 合力IL-15Ra可預(yù)防小鼠發(fā)生膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎并抑制同種異基因移植物排斥。應(yīng)用抗 IL-15的抗體可有效治療小鼠多種自身免疫性疾病。促炎細胞因子IL-15在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎發(fā)病中起重要作用，而且，I/II期臨床試驗表明IL-15抗體HuMaX-IL15治療活動性類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎約63%患者有效。針對IL-2/15Ri3的人源抗體Mikβ 1單藥可延長猴同種異基 因心臟移植物存活時間。利用Miki3 1單克隆抗體治療12例T細胞大顆粒淋巴細胞白血病 I期臨床試驗結(jié)果顯示毒性作用很少，可封閉白血病細胞表面> 95%的IL-2/15Ri3受體。然而，以上各種藥物其機理都是人為的干預(yù)及阻斷IL-15與其受體的結(jié)合及利用 抗體阻斷劑特異性降低體內(nèi)IL-15及其受體的水平來減弱IL-15在體內(nèi)的作用。這些方 式有可能帶來各種未知的風(fēng)險由于IL-15與IL-2共用一部分受體，而在干預(yù)IL-15與受 體結(jié)合的過程中有可能也會影響IL-2與其相應(yīng)受體結(jié)合，從而影響體內(nèi)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)； IL-15可激活T細胞和NK細胞并抑制AI⑶發(fā)生，促進⑶8+記憶性T細胞增殖與生存因此在 增強機體殺傷腫瘤的能力方面發(fā)揮著重要作用，IL-15抗體的使用則有可能會影響IL-15 在體內(nèi)的免疫調(diào)控作用；人為的加入機體內(nèi)本不存在的組分，其毒副作用及應(yīng)用安全性都仍需進一步的長期驗證及觀察。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的該種IL-15亞型蛋白在機體免疫系統(tǒng)激活后高水平表達，而在免 疫系統(tǒng)正常狀態(tài)下無法檢測到該蛋白的表達。提示在此免疫激活狀態(tài)下此亞型蛋白可能發(fā) 揮了重要的調(diào)控功能，且體外實驗結(jié)果提示此亞型蛋白對正常IL-15蛋白功能起負調(diào)控作 用，因此，這種缺失六號外顯子的IL-15亞型蛋白可能是正常IL-15蛋白天然的拮抗劑，能 夠通過與IL-15受體競爭性結(jié)合從而阻斷自身免疫性疾病中IL-15介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。這種 機體在免疫激活狀態(tài)下天然存在的負向調(diào)控蛋白有望在自身免疫疾病的治療中發(fā)揮更為 有效且安全的作用。關(guān)于該種IL-15亞型蛋白的制備及應(yīng)用，經(jīng)查新未見國內(nèi)國外有相關(guān)報道。本發(fā) 明首次在免疫系統(tǒng)激活狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)了該亞型蛋白，并做了其功能的相關(guān)研究，從而為其在 機體免疫調(diào)控中發(fā)揮的作用提供了更為直接的證據(jù)。本發(fā)明所述的一種人IL-15亞型蛋白可以治療自身免疫疾病，特別是類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎、多發(fā)性硬化、強直性脊柱炎、炎癥性腸病、難治性乳糜泄、銀屑病、丙型病毒性肝炎和 逆轉(zhuǎn)錄病毒HTLV-I相關(guān)疾病、阿狄森病、兒童哮喘、纖維肌痛、慢性疲勞綜合征、甲狀腺炎、 血管炎、克隆病、腸炎以及雷諾氏病的任一種或多種。通過臨床數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明對如上疾 病具有很好治療作用。注所述的LPS購自Promega公司。本申請按照《分子克隆手冊P96-99、P518、P611、P627-628頁所述方法，以及 Axygen> Fermentas> Takara公司的試齊Ll手冊進行試驗。3、流感病毒所引發(fā)的急性肺炎會導(dǎo)致流感患者尤其是處于兒童階段的流感患者 極高的病死率。Risa Nakamura等發(fā)現(xiàn)IL-15敲基因小鼠在感染流感病毒后其急性肺炎 發(fā)病率顯著降低，而機體抵抗流感病毒的能力卻未受影響，這就預(yù)示著阻斷流感患者體內(nèi) IL-15的功能能夠在不影響患者對流感病毒的抵抗能力的情況下，顯著降低流感所致的急 性肺炎的發(fā)病率及病死率。本發(fā)明已證明所發(fā)現(xiàn)的缺少六號外顯子的IL-15亞型蛋白對正 常IL-15功能起到負調(diào)控作用，因此該種IL-15亞型蛋白在用于流感所致的急性肺炎治療 上具有非常廣闊的應(yīng)用前景


圖1.實施例1中人IL-15亞型基因的擴增及克隆；其中A中的l、50bppladder ；2、正常人外周血細胞擴增IL-15 ；3、LPS刺激人外周 血細胞擴增IL-15 ；B中的UlOObppl adder ；2、IL-15擴增產(chǎn)物克隆酶切；3、IL-15亞型克隆酶切；圖2.實施例1中重組人IL-15亞型基因的表達載體的構(gòu)建及鑒定；其中1、Marker ；2、重組人IL-15亞型基因的pET43. 1原核表達載體；圖3.實施例1中人IL-15亞型蛋白的原核表達及可溶性鑒定；其中A中的1、空載pET43. 1表達蛋白；2-3、I L-15型基因融合蛋白；4、蛋白質(zhì) Marker ；B中的1、蛋白質(zhì)Marker ；2、IL-15亞型基因表達具體超聲裂解上清；圖4.實施例一中人IL-15亞型蛋白的純化及腸激酶切結(jié)果；其中A中的1、蛋白質(zhì)Marker ；2-3、各洗脫峰所對應(yīng)蛋白樣品；
B中的1、蛋白質(zhì)Mark er ；2_3、腸激酶酶切后IL-15亞型融合蛋白；圖5.實施例1中人IL-15亞型蛋白的Western blot鑒定結(jié)果；圖6.實施例7中人IL-15亞型蛋白的結(jié)構(gòu)模擬及功能預(yù)測；圖7.實施例7中人IL-15亞型蛋白的負調(diào)控功能；圖8為實施例8初診的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的外周血進行實驗結(jié)果電泳圖其中 1、4 為 DNA Marker2、為未經(jīng)LPS刺激培養(yǎng)的正常人外周血3、為經(jīng)LPS刺激培養(yǎng)的正常人外周血5、為未經(jīng)LPS刺激培養(yǎng)的患者外周血6、為經(jīng)LPS刺激培養(yǎng)的患者外周血圖9為實施例9人IL-15及其亞型對不同用量的抗⑶3⑶28抗體激活的初診類風(fēng) 濕病人外周血單個核淋巴細胞增殖活性的影響。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述實施例1，制備純化的有功能的無標(biāo)簽人IL-15亞型蛋白1.細胞總RNA的提取取人外周血細胞，制備外周血單個核細胞懸液，使用0. 1 u g/ml LPS作用72h刺 激外周血單個核細胞PBMC，獲得刺激后的外周血單個核細胞懸液PBMC，加裂解液Trizol lml，反復(fù)吹打混勻，將細胞溶于Trizol中，室溫孵育樣本5min裂解細胞；加入0. 2ml氯仿， 劇烈混勻15s，室溫孵育樣本3-5min，4°C，12000g離心15min ；離心后轉(zhuǎn)移上層無色水相至 EP管，加入0. 5ml異丙醇，混勻，冰浴lOmin ；4°C，12000g離心lOmin,小心移去上清液；加入 lml75%乙醇，顛倒混勻，4°C，7500g離心5min，洗兩次；徹底棄上清，將RNA略干燥后溶解在 20 ill 無 RNase 水中，-80 °C 保存。2. RT-PCR擴增人IL-15亞型基因編碼區(qū)片段以4 ill步驟1提取的總RNA為模板，1 ill Oligo dT為下游引物，加入雙蒸水補 足體系至12iU，離心混勻，70°C 5min，放置冰上冷卻；加5X逆轉(zhuǎn)錄buffer 4u 1, RNase Inhibitor 1 u 1, lOmM dNTP 2 ii 1 離心混勻，37°C放置 5min，加入 MMLV1 ii 1，42°C 60min， 70°C 10min，4°C保存所得 cDNA。根據(jù) NCBI 所公布小鼠 IL_15cDNA 序列(NM008357. 1)及 PET43. 1原核表達載體的結(jié)構(gòu)設(shè)計上下游分別帶有SacI和Xhol內(nèi)切酶序列的引物序列 (上海生工合成，見Seq NO. 1和2或表1)。表1人IL-15引物序列 以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用所設(shè)計引物，進行PCR擴增，反應(yīng)體系為lOXTaqbuffer 5u 1, MgCl2 4u 1, lOmM dNTP 1 ii 1，10 ii M 上下游引物各 1 ii 1，模板 cDNA 5u 1, Taq DNA聚合酶1 yl，ddH20補充至總體積50 yl。擴增條件為94°C預(yù)變性5min， 94°C變性60s，56°C退火60s，72°C延伸60s，擴增34個循環(huán)，72°C延伸lOmin。2%瓊脂糖凝 膠電泳鑒定所得PCR擴增產(chǎn)物(圖1A)。3.人IL-15基因克隆及鑒定取20 yl步驟2所得PCR產(chǎn)物，按照凝膠回收試劑盒說明進行回收。取回收所得 PCR產(chǎn)物與PGEM-T克隆載體按以下體系進行連接PCR產(chǎn)物5 yl，PGEM-T克隆載體1 yl， T4連接酶1 iU，10X連接緩沖液1 y 1，三蒸水2 u 1，4°C連接過夜。將此連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 DH10B的感受態(tài)細菌，通過藍白斑篩選，取白色陽性菌落，搖菌過夜，按照質(zhì)粒小抽試劑盒說 明抽提質(zhì)粒。取所得質(zhì)粒按照以下體系進行酶切鑒定質(zhì)粒5 iil，10 X buffer 2u l,Sac I 內(nèi)切酶liU，Xhol內(nèi)切酶lyl，雙蒸水11111，301水浴211。取初步酶切鑒定結(jié)果為陽性 的相應(yīng)質(zhì)粒(圖1B)至上海生工測序以得到準(zhǔn)確的人IL-15亞型基因克隆(見SeqNO. 3)。4.構(gòu)建重組人IL-15亞型基因的pET43. 1原核表達載體取測序鑒定正確的PGEM-T-IL-15質(zhì)粒及原核表達載體pET43. 1，進行SacI、Xhol 內(nèi)切酶雙酶切，酶切體系如下質(zhì)粒5 iil，10 X buffer 2u l,SacI內(nèi)切酶lyl，Xhol內(nèi)切酶 liil，雙蒸水lliil，37°C水浴2h。按照凝膠回收試劑盒說明書回收酶切所得片段。按以下 體系連接:pET43. 1 載體 3iil，PGEM-T-IL-155iil，T4 連接酶 lyl，10X 連接緩沖液 lyl， 4°C連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH10B菌，挑菌，按照質(zhì)粒小抽試劑盒說明抽提質(zhì)粒 酶切鑒定(圖2)，并將鑒定為陽性的相應(yīng)質(zhì)粒至上海生工測序。5. pET43. 1-IL-15亞型基因轉(zhuǎn)化菌的表達5. 1 重組質(zhì)粒 pET-43. 1-IL-15 轉(zhuǎn)化表達菌 BL21 (DE3)取鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-43. 1_IL_15及空的pET_43. 1表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化制 備好的感受態(tài)細胞BL21 (DE3)，均勻涂板，置37°C過夜培養(yǎng)；挑取若干單菌落分別接種于含 AMP(75ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)過夜，抽提質(zhì)粒，電泳鑒定，篩選正確轉(zhuǎn)化 的表達菌pET-43. 1-IL-15/BL21。轉(zhuǎn)化菌株于15%甘油的培養(yǎng)液中置_70°C保種備用。5. 2轉(zhuǎn)化菌的自發(fā)表達本實驗采用轉(zhuǎn)化菌自發(fā)表達方案。從以上BL-21轉(zhuǎn)化菌平板上挑取菌落，在含 AMP(75ii g/ml)MDG非表達培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)，過夜，至菌液密度達到飽和，吸取1ml菌液至 100ml的含々1^(751^/1111)2￥115052表達培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜。這種實驗方案，只需轉(zhuǎn)化 菌生長密度培養(yǎng)至飽和，操作方便，且其表達量可達IPTG誘導(dǎo)的幾倍。MDG非表達培養(yǎng)基(10ml) ZYM-5052表達培養(yǎng)基(10ml)9. 15ml H209. 58ml ZY20 u 1 1M MgS0420 u 1 1M MgS042u llOOOXmetals2 u llOOOXmetals125 ill 40% glucose200 u 1 50X5052500 ul 5% aspartate200 u 1 50XM200 ill 50 XM其中上述培養(yǎng)基的成分配比如下50 XM
以蒸餾水調(diào)節(jié)終體積為100mL17. 75g Na2HP0417. Og KH2P0413. 4g NH4C13. 55g Na2S04lOOOXmetals以蒸餾水調(diào)節(jié)終體積為100ml36ml sterile H2050ml 0. 1M FeCl3in 0. 12M HC1 270. 3050 u M Fe2ml 1M CaCl2 110.99 20 u M Calml 1M MnCl2-4H20 197.91 10 u M Mnlml 1M ZnS04-7H20 287. 56 10 u M Znlml 0. 2M CoC12_6H20 237. 95 2 u M Co2ml 0. 1M CuC12-2H20 170.486 2 u M Culml 0. 2M NiCl2-6H20 237. 722 u M Ni2ml 0. 1M Na2Mo04_5H20 241.98 2 u M Mo2ml 0. 1M Na2Se03_5H20 263.03 2 u M Se2ml 0. 1M H3B0350X5052以蒸餾水調(diào)節(jié)終體積為100ml25g glycerol73ml H202. 5g glucoselOg a -lactoseZY以蒸餾水調(diào)節(jié)終體積為1000ml10g tryptone5g yeast extract1 liter of H205. 3人IL-15亞型融合蛋白的SDS-PAGE電泳鑒定收集lml表達培養(yǎng)基中的菌體，12000g、30s離心，棄上清、PBS重懸菌體，12000g、 30s離心，小心吸凈管壁上的液滴，盡可能使沉淀物不帶有殘留液體。加入20 25倍于菌 體沉淀體積的PBS，振蕩混勻，加入等體積的2X上樣緩沖液，繼續(xù)振蕩20秒；沸水浴中放 置3-5min，12000g離心lOmin，將上清夜移至另一離心管中，吸取上清樣品10 yl進行SDS 聚丙烯酰胺電泳分析融合蛋白是否表達(圖3A)，剩余樣品保存于-20°C備用。6.人IL-15基因原核表達產(chǎn)物的NTA-Agarose親和層析法純化6. 1人IL-15基因原核表達產(chǎn)物可溶性的鑒定將100ml的以上所得的表達菌液4000rpm離心15min，棄上清，10ml裂解液重懸 菌體，室溫放置15min。將重懸菌液置于超聲破碎儀中，以工作功率400W、工作時間10s、間歇時間4s工作50次，于冰上超聲裂解1小時。取超聲裂解后的菌液于12000rpm，4°C離心 20min。吸取上清樣品10 yl進行SDS聚丙烯酰胺電泳分析，并同時以未經(jīng)超聲裂解10 yl 制備好的表達產(chǎn)物樣品作為對照(圖3B)。6. 2保持功能活性的人IL-15基因原核表達產(chǎn)物的制備經(jīng)以上檢測證明該表達產(chǎn)物是可溶性的，因此在制備過程中，只需裂解液是 非變性的，就有可能得到有功能活性的蛋白。按以下配方配制非變性裂解液50mM Tris-HC1(PH8. 0), 500mM NaCl,5mM MgCl2，0. 1% NP_40，2mM 咪唑。將 100ml 的以上所得的 表達菌液4000rpm離心15min，棄上清，10ml非變性裂解液重懸菌體并同時加入PMSF防止 蛋白降解。將重懸菌液置于超聲破碎儀中，于冰上超聲裂解1小時。取超聲裂解后的菌液 于12000rpm，4°C離心20min。所得上清即為可溶的有活性的表達蛋白，置于4°C備用。6. 3AKTA蛋白純化工作站純化蛋白1)平衡層析系統(tǒng)上樣緩沖液清洗A泵，洗脫緩沖液清洗B泵。開啟A泵，用上樣緩沖液平衡管路， 上樣環(huán)和histrap HP預(yù)裝柱。2)上樣切換工作站于load位，使用BDlOml注射器將5ml樣本緩緩?fù)迫?ml上樣環(huán)中。切 換工作站于inject位，啟動A泵用上樣緩沖液以0. lml/min的速度將上樣環(huán)中的樣本推入 到預(yù)裝柱中。3)洗滌上樣結(jié)束后，啟動A泵，用15個柱體積的上樣緩沖液以lml/min的速度沖洗柱子。 同時啟動A泵與B泵，以95%上樣緩沖液加5%洗脫緩沖液的輸出比例，用15個柱體積的 液體以lml/min的速度沖洗柱子。4)梯度洗脫同時啟動A泵與B泵，設(shè)定程序，使輸出比例由95%上樣緩沖液加5%洗脫緩沖液 逐步過渡到100%洗脫液。在輸出比例變化中，工作站監(jiān)控圖出現(xiàn)峰時，點擊hold選項，維 持輸出比例不變，直至峰消失，取消hold選項。收集出現(xiàn)的每一個層析峰所對應(yīng)的樣品。6. 4純化蛋白樣本的鑒定與質(zhì)控1)SDS-PAGE電泳檢測各個層析峰所對應(yīng)的樣品(圖4A)。根據(jù)電泳結(jié)果確定目標(biāo) 蛋白的洗脫峰，并且通過軟件分析目標(biāo)蛋白的純度。2)取0.8ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)(20mgBSA)中，充分溶解后配制成 25mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。取適量25mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)，稀釋至終濃度為0. 5mg/ml。根據(jù)樣 品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B (50 1)配制適量BCA工作液，充分混 勻。將標(biāo)準(zhǔn)品按0，1,2,4,8,12，16,20u 1加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補 足到20iU。加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到20 yl。各孔加入 200 ul BCA工作液，37°C放置20-30分鐘。測定各孔0D值(562nm)，根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計 算出樣品的蛋白濃度。7.獲取無大標(biāo)簽片段的目的蛋白因在以上純化所得的蛋白中，有大片段的用于提高表達蛋白的可溶性的Nus-Tag， 為了排除其對目的蛋白功能活性可能具有的影響，純化后需利用腸激酶將其切掉。
7.1咪唑的去除上步所得純化蛋白處于咪唑環(huán)境中，無法進行腸激酶酶切反應(yīng)，吸1ml純化蛋 白于30KD超濾離心截留管，12000rpm, 4 °C離心30min，將截留管倒置，2000rpm, 4 °C離心 15min，所得液體即為去除咪唑的純化蛋白。7. 2腸激酶酶切用稀釋液將10X酶切緩沖液稀釋為IX酶切緩沖液，置于4°C待用，取2U/iU的 腸激酶做i、o. i、o. 01,0. 001,0. 0001,0. 00001,0. 0000001七個稀釋度的稀釋，取各稀釋度 稀釋好的腸激酶1 yl加入50 i! g的融合蛋白中，再加入相應(yīng)體積的1 X酶切緩沖液，室溫 孵育16h，取各個酶切反應(yīng)體系中的樣品lOiil，通過SDS-PAGE電泳檢測，從而確定最佳的 腸激酶用量。將蛋白樣品按照最佳條件進行腸激酶酶切，利用50KD的超濾離心截留管，離 心，截留，離心所得濾膜的下層液，即為酶切后的小片段的目的蛋白(圖4B)。8. Western blot檢測純化所得人IL-15亞型基因蛋白的表達取制備好的蛋白10iU，加2iU 5X上樣緩沖液混勻煮沸后上樣，進行 SDS-PAGE (20 %濃縮液，5 %分離膠)電泳40v，4h。40v濕轉(zhuǎn)7h，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。麗春紅s染膜、考馬斯亮藍染膠，通過與蛋白marker比較，確定目的條帶位置。 5% TBST脫脂奶粉封閉lh，一抗37°C孵育1小時，充分洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗37°C 孵育1小時，充分洗膜，ECL顯色(圖5)。鼠抗人IL-15 —抗工作濃度為1 200，-actin 工作濃度為1 800，兔抗鼠IgG 二抗工作濃度1 2000。實施例2本實施例中步驟1中所用的LPS的濃度為10ii g/ml，作用時間為24小時。其余的 試劑和操作步驟完全一樣。實施例3本實施例中步驟1所用的LPS的濃度為20 u g/ml，作用時間為24小時；其余的試 劑和操作步驟完全一樣。實施例4本實施例中步驟1所用的LPS的濃度為70 u g/ml，作用時間為36小時。其余的試 劑和操作步驟完全一樣。實施例5本實施例中步驟1所用的LPS的濃度為100 ii g/ml，作用時間為36小時。其余的 試劑和操作步驟完全一樣。實施例6本實施例中步驟1所用的LPS的濃度為50 u g/ml，作用時間為24小時。其余的試
劑和操作步驟完全一樣。實施例7 人IL-15亞型蛋白的功能檢測1.人IL-15亞型蛋白結(jié)構(gòu)模擬及功能預(yù)測由上述結(jié)果可見，這種人IL-15亞型蛋白是在細胞經(jīng)LPS刺激后也即免疫系統(tǒng)被 激活后經(jīng)選擇性剪切缺失6號外顯子表達形成的。本發(fā)明經(jīng)過軟件初步分析處理預(yù)測了 這種在免疫系統(tǒng)激活狀態(tài)下產(chǎn)生的人IL-15亞型發(fā)揮何種功能?？梢缘玫降某醪浇Y(jié)論是 人IL-15亞型蛋白由于6號外顯子的缺失，無法折疊形成正常的二聚體，但是其單體仍能和人IL-15受體結(jié)合，即人IL-15亞型蛋白可能競爭性的和受體結(jié)合，但并不能發(fā)揮正常人 IL-15的功能活性(圖6)。2.人IL-15亞型蛋白的負向調(diào)節(jié)功能本發(fā)明利用需依賴IL-2或IL-15基因生長的CTLL-2細胞，體外實驗驗證人IL-15 亞型蛋白發(fā)揮的功能。取對數(shù)生長期的CTLL-2細胞，臺盼藍染色確定活細胞率達95%以 上，無血清1640培養(yǎng)基洗滌細胞兩遍。調(diào)整細胞濃度至5X105/ml，備用。取以上實驗所得 的純化的人IL-15及其亞型蛋白各10 y g，于96孔培養(yǎng)板中用1640完全培養(yǎng)基進行倍比 稀釋，每個稀釋度設(shè)三個復(fù)孔，取CTLL-2細胞100 u 1/孔加入96孔培養(yǎng)板中，37°C,5% C02 培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，于檢測前6h加入3H(1 u Ci/孔)，收集細胞，0液閃計數(shù)器計數(shù)(圖7A)。 結(jié)果顯示，正常的人IL-15蛋白可以顯著促進CTLL-2細胞的增殖，而人IL-15亞型蛋白不 能促進CTLL-2細胞的增殖。為進一步驗證人IL-15亞型蛋白是否可以負調(diào)控正常IL-15蛋白的功能活性，在 以上的實驗體系中又增設(shè)了以下幾個實驗組取純化得到的正常人IL-15蛋白1 P g/孔加 入96孔培養(yǎng)板中，取8 u g人IL-15亞型蛋白倍比稀釋加入相應(yīng)孔中，每個稀釋度設(shè)3個 復(fù)孔；取rhIL-15標(biāo)準(zhǔn)品500ng/孔加入96孔培養(yǎng)板中，取8 u g人IL-15亞型蛋白倍比稀 釋加入相應(yīng)孔中，每個稀釋度設(shè)3個復(fù)孔；取rhIL-15標(biāo)準(zhǔn)品500ng/孔加入96孔培養(yǎng)板 中，取8 y g純化所得正常人IL-15蛋白倍比稀釋加入相應(yīng)孔中，每個稀釋度設(shè)3個復(fù)孔；取 rhIL-15標(biāo)準(zhǔn)品500ng/孔加入96孔培養(yǎng)板中，并倍比稀釋，每個稀釋度設(shè)3個復(fù)孔。同樣 通過3H嵌入法檢測CTLL-2的增殖(圖7B，C)。結(jié)果表明，8 y g的人IL-15亞型蛋白可以 顯著降低1 y g正常IL-15蛋白及500ngrh IL-15標(biāo)準(zhǔn)品對CTLL-2細胞的增殖促進作用， 并且IL-15亞型蛋白的這種負調(diào)節(jié)作用，隨著其加入量的倍比稀釋而降低。本發(fā)明設(shè)計以下體外實驗進一步確認人IL-15亞型蛋白的負性調(diào)控功能。取外 周血單個核細胞PBMC懸液，調(diào)整細胞濃度至5 X 106/ml, 100 u 1/孔加至96孔板中，加入以 1. 25 u g/ml為起始濃度進行倍比稀釋的LPS培養(yǎng)24h，另設(shè)兩組在此基礎(chǔ)上分別加入倍比 稀釋的8 u g純化所得IL-15蛋白及IL-15亞型蛋白培養(yǎng)24h，各組稀釋度均設(shè)3個復(fù)孔， 37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，于檢測前6h加入3H(lyCi/孔)，收集細胞，0液閃計數(shù)器 計數(shù)。結(jié)果顯示，8 y g的小鼠IL-15亞型蛋白可以顯著降低LPS對脾臟細胞的刺激增殖作 用，且其負調(diào)節(jié)作用隨加入量的倍比稀釋而降低，而純化所得正常IL-15蛋白對LPS刺激無 此負向調(diào)控作用。本發(fā)明公開了一種拮抗正常IL-15蛋白功能的人IL-15亞型蛋白，所述該IL-15 亞型蛋白由人外周血在LPS刺激下經(jīng)選擇性剪切形成缺失第六號外顯子的小鼠IL-15亞型 基因表達產(chǎn)生。其功能經(jīng)體外實驗檢測可以在免疫激活狀態(tài)下拮抗正常人IL-15蛋白的 功能，因此，本發(fā)明所述拮抗正常人IL-15基因功能的IL-15亞型蛋白為制備預(yù)防或治療 IL-15基因高表達相關(guān)疾病的藥物或制劑提供了新的、較好的選擇。實施例8本研究同樣取臨床上進行初診的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的外周血進行實驗，經(jīng)紅細 胞裂解處理后，取病人外周血直接進行培養(yǎng)，并加入LPS刺激培養(yǎng)72h，同時取正常人外周 血同樣經(jīng)過或未經(jīng)LPS刺激進行培養(yǎng)作為對照。取所培養(yǎng)的外周血細胞抽提總RNA并進 行逆轉(zhuǎn)錄-PCR。結(jié)果顯示，正常人外周血經(jīng)LPS刺激72h后出現(xiàn)小片段的亞型條帶，而患者的外周血則刺激不出小片段的亞型條帶。該實驗?zāi)壳耙咽占?名患者外周血進行研究， 均能得到很好的重復(fù)，從而證明在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中無法產(chǎn)生此種具有拮抗作用的人 IL-15亞型。實施例9人IL-15蛋白及其亞型蛋白對不同用量的抗⑶3⑶28抗體激活的初診類風(fēng)濕病人 外周血單個核淋巴細胞增殖活性的影響將抗0)30)28抗體按照2118/60111/1、4118/60111/、8118/60111/孔的量加入96 孔板中，每種抗體用量設(shè)3個復(fù)孔，4°C過夜包被培養(yǎng)板。實驗前將抗體從孔板中吸走。取 初診類風(fēng)濕病人外周血4ml，用Ficoll分離液分離得到外周血單個核淋巴細胞并進行細胞 計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至5X 105個/ml, 100 u 1/孔加入已包被的96孔板中。取純化所得人 IL-15蛋白及其亞型蛋白按10ii g/100iil/孔加入96孔板中。37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng) 18h，于檢測前6h加入1微居/孔的3H繼續(xù)培養(yǎng)后，通過細胞收集器進行收集，經(jīng)0液閃計 數(shù)器進行讀數(shù)。結(jié)果證明病人外周血單個核淋巴細胞在被抗CD3CD28抗體激活后，人IL-15 亞型蛋白的加入能顯著抑制T細胞的增殖，而加入野生型的小鼠IL-15蛋白則顯著促進了 T 細胞的增殖，即人IL-15亞型蛋白的加入能夠顯著抑制類風(fēng)濕病人外周血T細胞的增殖活 性，從而對自身免疫性疾病的病程起到減緩及治療的作用。
權(quán)利要求
一種人IL-15亞型蛋白，其特征在于氨基酸序列為Seq NO.4。
2.—種人IL-15亞型蛋白，其特征在于編碼基因序列為Seq NO. 3。
3.—種人IL-15亞型蛋白的制備方法，其特征包括以下步驟(1)擴增人IL-15亞型基因片段取正常人外周血，制備外周血單個核細胞PBMC懸液， 使用0. 1 u g/ml-100 u g/m LPS作用24h_72h刺激，獲得刺激后的外周血單個核細胞PBMC 懸液，通過Trizol-氯仿法抽提總RNA ；根據(jù)NCBI所公布人IL_15cDNA序列NM-000585及 PET43. 1原核表達載體的結(jié)構(gòu)設(shè)計特異性引物Seq NO. 1和SeqNO. 2，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-PCR操作擴 增獲得人IL-15目的片段；(2)獲取人IL-15亞型基因克隆取步驟1所得PCR產(chǎn)物，按照凝膠回收試劑盒說明回 收IL-15基因亞型片段；將回收所得PCR產(chǎn)物與PGEM-T克隆載體連接、4°C連接過夜；取連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH10B的感受態(tài)細菌，挑菌并酶切鑒定獲得陽性質(zhì)粒；取該質(zhì)粒進一步測序 鑒定其編碼基因序列Seq NO. 3 ；(3)構(gòu)建重組人IL-15的pET43.1原核表達載體取測序鑒定正確的步驟2所得質(zhì)粒 及原核表達載體PET43. 1，分別進行SacI、Xhol內(nèi)切酶雙酶切并按照凝膠回收試劑盒說明 書回收酶切所得片段；將回收所得酶切片段連接過夜，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH10B菌，挑 菌，按照質(zhì)粒小抽試劑盒說明抽提質(zhì)粒酶切鑒定；(4)pET43.1-IL-15亞型基因轉(zhuǎn)化菌的表達取鑒定正確的步驟3中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化感受態(tài)細胞BL21(DE3)，挑取單菌落，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，篩選正確轉(zhuǎn)化的表達菌 pET43. 1-IL-15/BL21 ；(5)純化并獲得無標(biāo)簽的人IL-15亞型蛋白SeqNO. 4。
4.一種人IL-15亞型蛋白在制備自身免疫性疾病藥物的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的自身免疫性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、多發(fā)性硬化、強直性脊柱炎、炎癥性腸病、難治性乳糜泄、銀屑病、丙型病毒性肝炎、逆轉(zhuǎn) 錄病毒HTLV-1相關(guān)疾病、阿狄森病、兒童哮喘、纖維肌痛、慢性疲勞綜合征、甲狀腺炎、血管 炎、克隆病、腸炎或雷諾氏病。
6.一種人IL-15亞型蛋白在制備用于流感所致的急性肺炎治療藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人單抗蛋白的制備，特別涉及一種人IL-15亞型蛋白的制備及其應(yīng)用；制備在免疫體系處于激發(fā)態(tài)下制備人IL-15亞型蛋白，通過體外實驗檢測其對正常人IL-15蛋白的拮抗作用，提供該亞型蛋白在自身免疫性疾病等臨床治療中的應(yīng)用；本研究證明，未經(jīng)LPS刺激的外周血細胞檢測不到該種亞型，而在LPS刺激后的正常人外周血中可檢測到該亞型，提示該亞型有可能在免疫系統(tǒng)激活的條件下發(fā)揮著重要的負反饋調(diào)控功能；本發(fā)明首次在免疫系統(tǒng)激活狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)了該亞型蛋白，并做了其功能的相關(guān)研究，從而為其在機體免疫調(diào)控中發(fā)揮的作用提供了更為直接的證據(jù)。
文檔編號A61P5/44GK101838327SQ201010180688
公開日2010年9月22日 申請日期2010年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月24日
發(fā)明者劉海燕, 胡博 申請人:劉海燕