一種水稻穗頸長(zhǎng)度基因qPNL-12的分子標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水稻遺傳改良與農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種水稻穗頸長(zhǎng)度基因 qPNL-12的分子標(biāo)記，尤其涉及與qPNL-12基因緊密連鎖分子標(biāo)記的核苷酸序列及用于擴(kuò) 增分子標(biāo)記的正、反向特異引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 穗頸長(zhǎng)度又稱為穗抽出度，指劍葉葉鞘到穗基部的距離，它作為連接莖桿和穗的 一個(gè)重要農(nóng)藝性狀，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分從莖桿和葉片到穗部的運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮著極其關(guān)鍵 的作用。目前生產(chǎn)上所用的大多數(shù)水稻不育系具有不同程度的包穗特征（由穗抽出度過(guò) 短導(dǎo)致），大大影響了雜交稻制種產(chǎn)量的提高。二十世紀(jì)八十年代，水稻長(zhǎng)穗頸基因eui的 發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是三系雜交水稻種子生產(chǎn)中繼不育系、保持系和恢復(fù)系后的第四要素。導(dǎo)入 eui基因的不育系從遺傳水平上緩解了其包穗現(xiàn)象，提高了其對(duì)外源GA3的敏感性（Rutger JN，etal.，CropSci，1981，21:373-376)。然而，單基因的使用并不能完全解除不育系 的包穗問(wèn)題（梁康逕等，福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1992, 21:380-385;何祖華等，中國(guó)水稻科 學(xué)，1991，5:1-6)。楊仁崔等（中國(guó)工程科學(xué)，2005,7(8):26-30)利用攜帶 61111基因的協(xié)青 早eA不育系育成的雜交稻在生產(chǎn)上卻出現(xiàn)生長(zhǎng)過(guò)快、植株偏高和葉面積較大等不良性狀。 因此，挖掘更多有用的穗頸長(zhǎng)度基因?qū)Ω玫馗牧茧s交稻不育系或恢復(fù)系的穗頸長(zhǎng)度具有 重要意義，也可為研宄穗頸伸長(zhǎng)的遺傳機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
[0003] 迄今為止，有多個(gè)穗頸長(zhǎng)度相關(guān)基因已經(jīng)被克隆或精細(xì)定位。EUI1和EUI2 為兩個(gè)已克隆的控制水稻穗頸伸長(zhǎng)的基因，EUI1基因編碼一個(gè)細(xì)胞色素P450單加氧 酶（LuoA，etal.，PlantCellPhysiol, 2006, 47:181-191;ZhuYY，etal.，Plant Cell, 2006, 18:442-456)，位于水稻第5染色體上。EUI2基因編碼一個(gè)環(huán)氧化物酶的同 源蛋白，位于水稻第10染色體上（朱宏波，福建農(nóng)林大學(xué)博士論文，2003 ;黃偉素，浙江 大學(xué)碩士論文，2006)。EUI1和EUI2基因在水稻內(nèi)源赤霉素合成途徑中起負(fù)調(diào)控功能， 功能缺失后會(huì)造成赤霉素在最上節(jié)間大量積累，從而使水稻穗頸極具伸長(zhǎng)。目前僅有1 個(gè)短穗頸或包穗基因SUI1被克隆。SUI1位于水稻第1染色體上，編碼一個(gè)磷脂酰絲氨 酸合成酶，通過(guò)調(diào)節(jié)倒一節(jié)的細(xì)胞長(zhǎng)度來(lái)調(diào)控水稻穗頸長(zhǎng)度（ZhuL，etal.，PlantMol Biol，2011，77:475-487)，該基因突變后導(dǎo)致包穗特征，并引起突變體的谷粒產(chǎn)量明顯下 降。已經(jīng)精細(xì)定位或初步定位的短穗頸基因的研宄則相對(duì)較多，ESP2、SHP6、SUI4分別被 精細(xì)定位于水稻第1、2和7染色體上（朱克明，揚(yáng)州大學(xué)碩士論文，2006 ;官華忠等，科 學(xué)通報(bào)，2011，56:741-745;JiH，etal.，PlantBiotechnolR印，2014, 8:125-134)，SHP1， SHP3,SHP4和SHP5分別被初定位于水稻第1，5,3和4染色體上（劉莊等，中國(guó)農(nóng)學(xué)通 報(bào)，2006, 22 (12) : 409-412 ;王偉平等，中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008, 24 (6) : 212-216)?；谝陨媳?述，尚未有關(guān)于水稻穗頸長(zhǎng)度相關(guān)基因定位于第12條染色體上的報(bào)道。
[0004] 申請(qǐng)工作人員前期以秈稻品種9311為受體親本、粳稻品種日本晴為供體親本經(jīng) 過(guò)雜交、多代回交和自交，構(gòu)建了一套高代回交置換系群體，并建立了高密度物理圖譜（趙 春芳等，植物學(xué)報(bào)，2012, 47:594-601)，為農(nóng)藝性狀的QTL定位奠定了基礎(chǔ)。隨后，申請(qǐng)工 作人員對(duì)置換系群體中穗頸長(zhǎng)度性狀進(jìn)行調(diào)查，鑒定出一個(gè)極短穗頸表型的置換系C115， 與受體親本9311的穗頸長(zhǎng)度具有極顯著差異（P〈0. 01)。以C115和9311為親本，構(gòu)建了 F2分離群體，利用遺傳分析和基因連鎖分析，初步定位了C115短穗頸表型的控制基因，將 其定位于水稻第12染色體的兩個(gè)SSR標(biāo)記RM7102和RM277之間，兩標(biāo)記間的物理距離為 5. 10Mb，命名為qPNL_12(趙春芳等，植物學(xué)報(bào)，2015)。經(jīng)與已克隆的穗頸長(zhǎng)度相關(guān)基因 比較，該基因?yàn)橐粋€(gè)新的穗頸長(zhǎng)度基因。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步尋找更加逼近目標(biāo)基因 qPNL-12的分子標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)對(duì)qPNL-12基因的精細(xì)定位，篩選到了比通用SSR標(biāo)記更緊密連 鎖甚至共分離的分子標(biāo)記。這些緊密連鎖標(biāo)記將為qPNL-12基因的克隆奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為 水稻育種中穗頸長(zhǎng)度的標(biāo)記輔助選擇提供更有效的分子標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)目前雜交稻生產(chǎn)上利用的穗頸長(zhǎng)度基因過(guò)于單一，而且En基因的使 用還帶來(lái)了不利效應(yīng)，因此本發(fā)明提供了一種水稻穗頸長(zhǎng)度基因qPNL-12的分子標(biāo)記。
[0006] 本發(fā)明具體通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 本發(fā)明以水稻為物種，通過(guò)對(duì)qPNL-12初定位區(qū)間內(nèi)秈粳稻的基因組序列差異性 比較，在堿基插入/缺失處設(shè)計(jì)InDel分子標(biāo)記，確定了Indl529和Indl561是與qPNL-12 基因連鎖最緊密的兩個(gè)分子標(biāo)記，并克隆測(cè)序了這兩個(gè)標(biāo)記的核甘酸序列，其中分子標(biāo)記 Indl529的核苷酸序列為SEQIDNO. 1 ;分子標(biāo)記Indl561的核苷酸序列為SEQIDNO. 2。
[0008] 基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種水稻穗頸長(zhǎng)度基因qPNL-12的分子標(biāo)記，分為 上游分子標(biāo)記Indl529和下游分子標(biāo)記Indl561，其中分子標(biāo)記Indl529和Indl561分別基 于核苷酸序列如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示的特異性插入/缺失位點(diǎn)多態(tài)。
[0009] 所述的水稻穗頸長(zhǎng)度基因qPNL-12分子標(biāo)記的引物組合物，用于擴(kuò)增分子標(biāo)記 Indl529的特異性正反向引物分別如SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4所示，用于擴(kuò)增分子標(biāo)記 Indl561的特異性正反向引物分別如SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6所示。
[0010] 本發(fā)明分子標(biāo)記的核苷酸序列還包括在SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2序列中添加、 取代、插入和缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸生成的衍生序列。
[0011] 本發(fā)明還提供了所述的分子標(biāo)記的引物組合物用于水稻穗頸長(zhǎng)度新基因qPNL-12 的精細(xì)定位或克隆的應(yīng)用，還用于含qPNL-12基因的水稻材料穗頸長(zhǎng)度性狀的標(biāo)記輔助選 擇育種的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的有益效果為：
[0013] 1)本發(fā)明方法中的分子標(biāo)記進(jìn)一步定位了水稻穗頸長(zhǎng)度新基因qPNL-12。標(biāo)記的 特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高，并且標(biāo)記的使用方法簡(jiǎn)便快捷，不涉及DNA測(cè)序、限制性內(nèi)切酶等的 使用，不存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力、價(jià)格昂貴等弊端。
[0014] 2)本發(fā)明方法中的分子標(biāo)記均為擴(kuò)增短片段的PCR標(biāo)記，具有試驗(yàn)試劑用量少、 速度快、成本低、高通量等優(yōu)點(diǎn)，并且對(duì)DNA模板質(zhì)量和檢測(cè)設(shè)備要求不高，非常適合現(xiàn)代 農(nóng)業(yè)中的分子育種趨勢(shì)。
[0015] 3)本發(fā)明方法中的分子標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，可以實(shí)現(xiàn)分離群體中短穗頸單株、長(zhǎng) 穗頸單株以及雜合單株的同時(shí)鑒定。
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