用于活體外測定致肥胖風(fēng)險的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測致肥胖風(fēng)險的方法，尤指利用多個特定基因的單一核苷酸多 型性于活體外測定致肥胖的風(fēng)險的方法
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪代謝與熱生成（thermogenesis)的調(diào)節(jié)影響到動物利用能量的效 率，而線粒體為動物體內(nèi)涉及能量的位置，主要功能是產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP)作為能量來源供給細(xì)胞利用。ATP的產(chǎn)生是通過內(nèi)膜上的ATP合成酶 進行二磷酸腺苷（adenosinediphosphate,ADP)的磷酸化稱合反應(yīng)而得。所謂稱合反應(yīng) (coupling)是指線粒體結(jié)合磷酸化反應(yīng)與質(zhì)子流動（protonflow)的一種化學(xué)滲透作用。 ATP生成可通過去f禹合蛋白（uncouplingprotein，UCP)進調(diào)節(jié)，使能量不以ATP形式儲存， 而是以熱能的形式釋放。編碼去耦合蛋白的基因，主要區(qū)分為去耦合蛋白Uuncoupling proteinl，UCPl)、去稱合蛋白 2(uncouplingprotein2，UCP2)及去稱合蛋白 3(uncoupling protein3，UCP3)三種，其在人體表達(dá)的位置不同。UCP1主要表達(dá)在褐色脂肪，UCP2在各個 組織都有表達(dá)，UCP3則同時表達(dá)于褐色脂肪以及骨胳肌，其功能除了參與去耦合作用外，也 有調(diào)節(jié)脂肪代謝與熱生成的功能。
[0003] 實驗中發(fā)現(xiàn)提高線粒體內(nèi)膜外質(zhì)子梯度濃度的消耗可以促進基礎(chǔ)代謝率（AmJP hysiol. 19960ct;271(4Ptl) :C1380-9)，因此UCP3可調(diào)節(jié)骨胳肌線粒體內(nèi)膜質(zhì)子流動產(chǎn)生 熱能，影響人體基礎(chǔ)代謝能力，并增加能量消耗，減少過多的能量轉(zhuǎn)換成脂肪儲存。UCP3的 基因變異研究中，位在外顯子3 (exon3)內(nèi)的rsl800006 (Tyr99Tyr,T-C)變異被發(fā)現(xiàn)C對 偶基因與法國高加索人肥胖有關(guān)，且與功能性啟動子（promoter)區(qū)域內(nèi)的rsl800849變異 (-55C-T)有很強的連鎖不平衡（linkagedisequiliburium，LD)，該變異可能影響UCP3 基因mRNA表達(dá)的穩(wěn)定性（Diabetologia. 2000Feb; 43 (2) : 245-9)。但在歐洲其他的研究中， 發(fā)現(xiàn)rsl800006 與糖尿病及胰島素抗性有關(guān)（HormRes. 2008; 69(1) : 31-6.Epub2007Dec4; Diabetes. 2008Apr; 57 (4) : 1101-7.doi: 10. 2337/db07-1269.Epub2008Jan25)。因此，目前 尚未有利用UCP3基因變異來判斷測定致肥胖風(fēng)險的技術(shù)，仍待有進一步改進的技術(shù)，以增 加利用UCP3基因變異的檢測準(zhǔn)確性。
[0004] 多配體蛋白聚糖（syndecan,SDC)是一種硫酸肝素蛋白聚糖（heparansulfate proteoglycan,HSPG),主要由核心蛋白（coreprotein)及硫酸肝素聚糖鏈（heparin sulfatechain)兩個部分所組成。SDC基因家族主要存在于細(xì)胞膜上，由4個成員組成 (SDC1~SDC4)，其中多配體蛋白聚糖3(syndecan3,SDC3)主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，包含控制 食欲的下視丘。在正常小鼠禁食實驗中，發(fā)現(xiàn)禁食狀態(tài)下大腦下視丘神經(jīng)細(xì)胞SDC3基因表 有顯著上升，推測此時SDC3可能是Agouti相關(guān)肽（Agouti-relatedpeptide,AGRP)的共同 受體，并通過AGRP結(jié)合褪黑素受體（melanocortinreceptor)傳遞增加食欲的信號，促進 攝食行為。當(dāng)給予喂食時，SDC3膜外結(jié)構(gòu)（ectodomain)會脫離細(xì)胞膜使a黑色素刺激荷 爾蒙（a-MSH)可與褪黑素受體結(jié)合傳遞抑制食欲的信號。SDC3基因剔除小鼠（SDC3null mice)也發(fā)現(xiàn)其脂肪量低于正常小鼠，且攝食量下降，能量消耗上升，推論SDC3基因可以調(diào) 節(jié)體重及身體能量的平衡。然而，在針對歐洲人種的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SDC3的變異與肥胖發(fā)生 無顯著相關(guān)，再者，各個SDC3的SNP位點與肥胖發(fā)生的關(guān)聯(lián)性有所不同。
[0005] 基于上述可見，單獨以UCP3或SDC3基因作為肥胖基因指標(biāo)恐仍有爭議之處，特定 而言，單獨利用UCP3或SDC3基因檢測致肥胖風(fēng)險恐仍有不準(zhǔn)確的疑慮。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于現(xiàn)有技術(shù)檢測致肥胖風(fēng)險的方法，仍有檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的問題，本發(fā)明的 目的在于提供一種具有提高準(zhǔn)確率的檢測致肥胖風(fēng)險的方法。
[0007] 為達(dá)上述目的，本發(fā)明提供一種用于活體外測定致肥胖風(fēng)險的方法，其利用多基 因的基因型判定致肥胖的風(fēng)險，而具有相比于單一基因的基因型，可增加預(yù)測的準(zhǔn)確度，以 降低不同個體僅由相同的特定單一基因判定致肥胖風(fēng)險的產(chǎn)生錯誤的可能性，并可供用于 作為提供對應(yīng)保健對策的依據(jù)。
[0008] 在一方面，本發(fā)明提供一種用于活體外測定致肥胖風(fēng)險的方法包括下列步驟：
[0009] 齊備一含核酸的樣品，
[0010] 偵測該樣品的去|禹合蛋白3(uncouplingprotein3，UCP3)與多配體蛋白聚糖 3(syndecan3,SDC3)的對偶基因的基因型，以及，
[0011] 鑒別該樣品的UCP3與SDC3對偶基因的基因型，取得一鑒別結(jié)果，該鑒別結(jié)果是 UCP3與SDC3對偶基因的同時變異，該樣品為源自于一具有增加的致肥胖風(fēng)險的個體。
[0012] 另一方面，本發(fā)明提供一種測定致肥胖風(fēng)險的基因多型性標(biāo)記，其是由UCP3與 SDC3基因型所形成的組合。
[0013] 依據(jù)本發(fā)明，所述的變異是例如，但不限于：核苷酸重復(fù)、核苷酸插入、核苷酸缺 失、復(fù)本變異或單一核苷酸多型性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)，所述的變 異造成插入子（intron)的序列變異、無義突變（nonsensemutation)或閱讀框架位移 (readingframeshift)〇
[0014] 依據(jù)本發(fā)明，該含核酸的樣品來自于一為亞洲人種的族群的個體；特定的，該個體 是漢人（HanChinese)。
[0015] 依據(jù)本發(fā)明，所述的核酸是脫氧核糖核酸或核糖核酸，優(yōu)選為基因組脫氧核糖核 酸（genomicDNA)。如所知者，當(dāng)所述的核酸是核糖核酸時，齊備一含核酸的樣品的步驟包 括，提供一核糖核酸，并且形成互補脫氧核糖核酸。
[0016] 依據(jù)本發(fā)明，所述的偵測UCP3與SDC3的對偶基因的基因型的步驟包括利用此 領(lǐng)域中所知的任何以一般遺傳工程、生物化學(xué)等方法鑒別UCP3與SDC3的對偶基因的基 因型的技術(shù)，例如，但不限于：聚合酶鏈鎖反應(yīng)配合定序分析（PCRandSequencing)、即 時聚合酶鏈鎖反應(yīng)（RealtimePCR)、限制性片段長度多型性（restrictionfragment lengthpolymorphism,RFLP)、質(zhì)譜儀分析（MassSpectrometry);或者，任何其他合適的 分析基因型的高通量篩選方法（high-throughputscreeningmethod),諸如配合連接子 聚合酶鏈鎖反應(yīng)（Linker-PCR)的生物晶片（Biochip)或次世代定序（Nextgeneration sequencing,NGS)〇
[0017]依據(jù)本發(fā)明，所述的UCP3對偶基因的變異發(fā)生于外顯子區(qū)域及非編碼區(qū) (Untranslatedregion,UTR)內(nèi)，所述的鑒別該樣品的UCP3與SDC3對偶基因的基因型包 括：分析UCP3與SDC3對偶基因的變異，以取得該鑒別結(jié)果，其中UCP3對偶基因的變異發(fā) 生于選自于由下列者所構(gòu)成的群組的位置：rsl800849 (5端非編碼區(qū)）、rsl800006 (外顯子 3)、rs2075577 (外顯子5)、rs647126 (3端非編碼區(qū)）及rsl5763 (3端非編碼區(qū)）；特別是 在具有如SEQIDNO. 1所示序列的區(qū)域，該SNPrsl800006A-G對偶基因變異位在UCP3 基因外顯子區(qū)域內(nèi)，為一同義單苷酸多型性（synonymousSNP)，雖不改變編碼出的酪氨酸 (Tyrosine)，但一般所知通常會影響UCP3mRNA的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)譯效率。
[0018] 依據(jù)本發(fā)明，所述的SDC3對偶基因的變異發(fā)生于外顯子區(qū)域內(nèi)，其中SDC3的 SNP系選自于由下列者所構(gòu)成的群組：rs2282440、rs2491132以及rs4949184。特別是具 有如SEQIDN0. 2所示序列的區(qū)域內(nèi)，該SNPrs2282440C-T對偶基因變異位在SDC3基 因外顯子區(qū)域上，使該基因轉(zhuǎn)譯后第329號氨基酸由蘇氨酸（Threonine)變異成異亮氨酸 (Isoleucine)〇
[0019] 依據(jù)本發(fā)明，所述的鑒別該樣品的UCP3與SDC3對偶基因的基因型包括：分析 UCP3與SDC3對偶基因，以取得該鑒別結(jié)果，其中UCP3對偶基因的變異發(fā)生于選自于由下列 者所構(gòu)成的群組的位置：rsl800849、rsl800006、rs2075577、rs647126 及rsl5763。
[0020] 依據(jù)本發(fā)明，SDC3對偶基因的變異發(fā)生于選自于由下列者所構(gòu)成的群組的位置： rs2282440、rs2491132 以及rs4949184。
[0021] 依據(jù)本發(fā)明，所述的測定致肥胖風(fēng)險的基因多型性標(biāo)記，其是由UCP3的SNP rsl800849、rsl800006、rs2075577、rs647126 及rsl5763 ;與SDC3 的SNPrs2282440、 rs2491132和/或rs4949184所形成的組合。
[0022] 更佳的，偵測該樣品的UCP3與SDC3對偶基因的基因型的步驟包含：將該樣品與兩 不同專一性探針相結(jié)合，所述專一性探針是分別針對UCP3的SNPrsl800006,以及SDC3的 SNPrs2282440 ;以及，其中該鑒別結(jié)果是UCP3的rsl800006為C同時SDC3的rs2282440 為T，則該樣品為源自于具有增加致肥胖的風(fēng)險的個體。
[0023] 所述的UCP3對偶基因的變異發(fā)生于具有如SEQIDNO. 1所示序列的區(qū)域，優(yōu)選 的，該序列的第26堿基位置為C。
[0024] 所述的SDC3對偶基因的變異發(fā)生于具有如SEQIDN0. 2所示序列，優(yōu)選的，該序 列的第26堿基位置為T。
[0025] 依據(jù)本發(fā)明，所述的肥胖以選自于下列所構(gòu)成的群組的數(shù)值為指標(biāo)：個體的身體 質(zhì)量指數(shù)（bodymassindex,BMI)、腰圍、腰臀比、體脂肪比率，以及血液中三酸甘油酯含 量。
[0026] 依據(jù)本發(fā)明，所述的個體的身體質(zhì)量指數(shù)，如本領(lǐng)域所公知的，是體重（公斤）/身 商 2 (公尺2)。
[0027] 依據(jù)本發(fā)明，所述的腰圍為任何此領(lǐng)域中所接受的方式進行量測所得到的數(shù)值， 優(yōu)選的是指除去腰部覆蓋的衣物，輕松站立，雙手自然下垂，將皮尺繞過腰部，調(diào)整高度，讓 皮尺能通過左右兩側(cè)骨盆上緣(腸骨上緣）至肋骨下緣的中間，注意皮尺與地面保持平行， 并緊貼、不擠壓皮膚，維持正常呼吸，在吐氣結(jié)束時，量取的腰圍數(shù)值。
[0028] 依據(jù)本發(fā)明，所述的腰臀比（WaisttoHipRatio,WHR)是指腰圍和臀圍的比例， 數(shù)值等于腰圍除以臀圍，其中腰圍如前所述，而臀圍指在雙腿并攏時以水平最大寬度處的 量度值。一般而言，腰圍反映脂肪總量和脂肪分布的綜合指標(biāo)，臀圍反映髖部骨胳和肌肉的 發(fā)育情況。腰臀比越大時，表示傾向于肥胖。
[0029] 依據(jù)本發(fā)明，前述的指標(biāo)可以以一般正常人為基準(zhǔn)，定義所述的肥胖，優(yōu)選的，當(dāng) 個體的身體質(zhì)量指數(shù)（bodymassindex,BMI) 3 27公斤/公尺2、腰圍男性3 90公分，女 性蘭80公分、腰臀比男性蘭0.9,女性蘭0.85、體脂肪比率男性蘭30%，女性蘭35%，為所