利用微生物發(fā)酵甘油生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體是指一種利用微 生物發(fā)酵甘油生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 3-羥基丙酸（3-hydroxypropionicacid，簡稱3-HP)是一種重要的平臺(tái)化合物， 它可以通過脫水、氧化還原、酯化反應(yīng)等生成丙烯酸、丙二酸、1，3-丙二醇等多種重要的化 學(xué)物質(zhì)。它也可以作為單體合成環(huán)境友好的高分子材料-聚羥基烷酸。另外，它還可以作 為化工原料用于涂料、粘膠劑、水處理化學(xué)品和個(gè)人護(hù)理用品的生產(chǎn)，2004年美國能源部曾 將其列為最具開發(fā)價(jià)值的12種化工產(chǎn)品之一。
[0003] 目前3-羥基丙酸的制備主要為化學(xué)法，如丙烯酸水合法，3-羥基丙醛氧化法， 3_羥基丙腈水解法及雷福爾馬斯基（Reformatsky)反應(yīng)等。但化學(xué)法原料多來自石油，且 存在對(duì)設(shè)備要求高，能耗高，污染大等問題。與之相比，生物法具有操作簡單、條件溫和、綠 色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，因此倍受關(guān)注備受國內(nèi)外研宄人員的青睞。
[0004] 微生物產(chǎn)3-HP早在上世紀(jì)60年代就有報(bào)道，但是天然存在的菌株所需底物價(jià)格 高且3-HP產(chǎn)率都比較低，因此長期處于實(shí)驗(yàn)室階段。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展， 大量研宄開始集中于對(duì)天然菌株進(jìn)行途徑改造，利用重組菌以甘油或葡萄糖等廉價(jià)碳源為 底物生產(chǎn)3-HP?；蚬こ叹臉?gòu)建按照底物的不同主要分成葡萄糖為底物和甘油底物兩 種。葡萄糖為底物的轉(zhuǎn)化路線以美國嘉吉（Cargill)公司的研宄最為成熟，該公司構(gòu)建了 多條從葡萄糖到3-HP的路徑，其中最具代表性的過程為：葡萄糖經(jīng)酵解途徑到丙酮酸，丙 酮酸還原生成乳酸，乳酸在丙酰CoA轉(zhuǎn)移酶的作用下生成乳酰CoA，后者在乳酰CoA脫水酶 作用下生成丙烯酰CoA，進(jìn)而在3-羥基丙酰脫水酶的作用下，生成3-羥基丙酰CoA，最終生 成3-羥基丙酸。
[0005] 以甘油為底物生成3-HP通常有兩步反應(yīng)組成：甘油先經(jīng)甘油脫水酶脫水生成 3-羥基丙醛，3-羥基丙醛經(jīng)醛脫氫酶脫氫生成3-HP。與葡萄糖相比，甘油到3-HP生成路徑 短，構(gòu)建和調(diào)控更加簡單有效。而且，近年來生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，其生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大 量副產(chǎn)物甘油，如能被合理利用則可以降低生物柴油的生產(chǎn)成本，提高其市場競爭力。因此 以甘油為原料產(chǎn)3-HP契合了生物能源和環(huán)保需求，具有良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，是當(dāng) 前生物法產(chǎn)3-HP的研宄熱點(diǎn)。
[0006] 以甘油為底物構(gòu)建基因工程菌根據(jù)宿主菌不同主要又包括兩大類，一類是在含有 dha操縱子具有甘油脫水酶活性的菌株（如肺炎克雷伯桿菌，Klebsiellapneumoniae)內(nèi) 引入醛脫氫酶。另一類是在不含甘油脫水酶的菌株（常用的為大腸桿菌，Escherich.coli) 中同時(shí)表達(dá)甘油脫水酶和醛脫氫酶。如韓國釜山國立大學(xué)的Kumar，Ashok等曾分別報(bào)道 以K.pneumoniae為出發(fā)菌株，引入醛脫氫酶基因構(gòu)建3-HP合成途徑。Jung等則在E.coli 中同時(shí)表達(dá)甘油脫水酶和醛脫氫酶構(gòu)建了 3-HP的生產(chǎn)途徑，并對(duì)宿主進(jìn)行了多方面改造， 以提高3-HP的產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率。Rathnasingh等對(duì)Raj構(gòu)建的E.coli進(jìn)行了進(jìn)一步改造， 并以半醛脫氫酶KGSADH代替醛脫氫酶ALDH后，以提高重組菌產(chǎn)3-HP濃度。Kim也對(duì)Kwak等構(gòu)建的E.coli工程菌進(jìn)行了進(jìn)一步的改造，用更高效的半醛脫氫酶PSALDH代替醛脫氫 酶ALDH，重組菌3-HP濃度達(dá)到了 57.3g/L。韓國的Chu從Cupriavidusnecator中篩選到 高活性的脫氫酶GabD4,該酶經(jīng)定向進(jìn)化后，在E.coli中與甘油脫水酶共表達(dá)，最終重組菌 40h產(chǎn)3-羥基丙酸濃度達(dá)到了 71. 9g/L。這是目前報(bào)道以甘油為底物產(chǎn)3-羥基丙酸的最 高水平。
[0007] 國內(nèi)華東理工大學(xué)、南京工業(yè)大學(xué)、江南大學(xué)、北京化工大學(xué)也有類似的工作報(bào) 道，其中北京化工大學(xué)田平芳教授研宄團(tuán)隊(duì)運(yùn)用了全局?jǐn)_動(dòng)、反義RNA等多種新型生物學(xué) 技術(shù)手段對(duì)K.pneumoniae進(jìn)行調(diào)控，研宄最為深入，但其3-HP產(chǎn)量目前沒有大的突破。華 東理工大學(xué)的黃艷娜等在K.pneumoniae中表達(dá)E.coli的醛脫氫酶ALDH，經(jīng)優(yōu)化，微氧條件 下3-HP濃度達(dá)到49. 8g/L。這是目前報(bào)道重組K.pneumoniae產(chǎn)3-HP的最高水平。
[0008] 迄今為止構(gòu)建基因工程菌制備3-羥基丙酸的研宄取得了一定的進(jìn)展，但是還存 在諸多的問題：1)途徑改造本身需要繁瑣的分子生物學(xué)操作，后期培養(yǎng)往往還需要額外加 入抗生素和誘導(dǎo)劑等，增加操作難度加大生產(chǎn)成本。2)構(gòu)建工程菌時(shí)宿主菌的選擇問題。以 K.pneumoniae為宿主，3-HP產(chǎn)生過程中產(chǎn)生大量1，3-丙二醇，后者是K.pneumoniae天然 的終端產(chǎn)物，生成途徑很難完全切斷，這就使得3-HP濃度和轉(zhuǎn)化率都難以提高。以E.coli 為宿主，3-HP產(chǎn)量相對(duì)較高，但由于其自身不具有甘油脫水酶酶活，構(gòu)建過程更加復(fù)雜。而 且E.coli自身不能生成甘油脫水酶的輔酶VB12，需要在發(fā)酵體系中額外加入，因其價(jià)格昂 貴，從而使得發(fā)酵成本大增。3)重組菌中甘油脫水酶和醛脫氫酶的平衡問題也制約了 3-HP 產(chǎn)量的提高。目前發(fā)現(xiàn)的甘油脫水酶只在厭氧和微好氧條件下才具活性，而在此條件下 NAD(P)H不能及時(shí)的生成醛脫氫酶的輔因子NAD(P) +，這不僅使得3-HP產(chǎn)生速率降低，還會(huì) 導(dǎo)致強(qiáng)細(xì)胞毒性的3-羥基丙醛積累，從而致使細(xì)胞死亡發(fā)酵中止。
[0009] 綜上所述，目前本領(lǐng)域需要一種簡單有效的工藝能將相對(duì)低廉的碳水化合物轉(zhuǎn)化 為3-羥基丙酸，并能獲得較高產(chǎn)物濃度和產(chǎn)率，以適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是克服了上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供了一種能夠?qū)崿F(xiàn)的將相對(duì)低 廉的甘油利用兩種微生物分段、混菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酸的利用微生物發(fā)酵甘油生產(chǎn) 3-羥基丙酸的方法，所述的方法為利用兩種微生物進(jìn)行分段、混菌發(fā)酵；
[0011] 上述兩種微生物包括：
[0012] 具有甘油脫水活性，轉(zhuǎn)化甘油生成3-羥基丙醛或1，3-丙二醇的微生物一；
[0013] 轉(zhuǎn)化3-羥基丙醛或1，3-丙二醇生成3-羥基丙酸的微生物二；
[0014] 前段發(fā)酵過程條件為含甘油20~120g/L的培養(yǎng)基，接入微生物一的種子培養(yǎng)液， 接種量3~10%，通入空氣或氮?dú)猓?0~42°C，發(fā)酵10~45小時(shí)，pH為6. 0~8. 0 ;
[0015] 后段發(fā)酵過程條件為在前段培養(yǎng)液中微生物二的種子液或微生物細(xì)胞，種子液接 種量為10~20 %，細(xì)胞接種量為3~20g/L，通入空氣或氧氣，20~37°C，培養(yǎng)10~40小 時(shí)，pH為 5. 0 ~7. 0 ;
[0016] 所述的微生物二將1，3-丙二醇或3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化生成3-羥基丙酸的相關(guān)酶為 膜結(jié)合蛋白。
[0017]優(yōu)選的，所述的微生物一選自：克雷伯氏肺炎桿菌（Klebsiellapneumoniae)，弗 氏朽1 檬酸桿菌（Citrobacterfreundii), 丁酸梭狀芽抱桿菌（Clostridiabutyricum)，巴 氏固氮梭狀芽孢桿菌（Clostridiapastruianu)，以及它們的基因工程菌。
[0018]優(yōu)選的，所述的微生物二為氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacteroxydans)，以及其 基因工程菌。
[0019] 優(yōu)選的，所述的膜結(jié)合蛋白以P比略喹啉醌（PyrroloquinolinequinonePQQ)為輔 因子。
[0020] 優(yōu)選的，所述的微生物一的種子液通過以下方法獲得：
[0021] 將菌種接種于種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度28~37°C，通入空氣或氮?dú)膺M(jìn)行有氧或厭氧 培養(yǎng)10~15小時(shí)，即得到微生物一的種子液。
[0022] 優(yōu)選的，所述的微生物二的種子液通過以下方法獲得：
[0023] 將氧化葡萄糖酸菌種接種于種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度25~32°C，培養(yǎng)20~30小時(shí)， 即得到微生物二的種子液。
[0024] 優(yōu)選的，所述的微生物二的微生物細(xì)胞通過以下方法制備：
[0025]將氧化葡萄糖酸菌種接種于種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度25~32°C，培養(yǎng)20~30小時(shí)， 低溫離心，收集菌體沉淀，用磷酸緩沖液洗滌，棄去上清，即得到微生物細(xì)胞。
[0026] 本發(fā)明利用兩種微生物分段、混菌發(fā)酵甘油產(chǎn)3-HP，與目前常用基因工程菌轉(zhuǎn)化 甘油相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0027] 1)本發(fā)明所用兩種微生物可以是自然界存在的天然微生物，省卻了繁瑣的基因操 作步驟。
[0028] 2)本發(fā)明利用兩種微生物，分段、混合發(fā)酵，發(fā)酵體系中接入微生物二氧化葡萄糖 酸桿菌，可將體系中3-羥基丙醛和1，3-丙二醇均轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酸，從而提高產(chǎn)物濃度 和甘油到3-HP的轉(zhuǎn)化率。
[0029] 3)本發(fā)明中氧化1，3-丙二醇及3-羥基丙醛及的脫氫酶為微生物二的細(xì)胞膜結(jié) 合蛋白，所產(chǎn)生3-HP直接分泌在細(xì)胞外，從而避免了物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的能耗和速率限制，具 有更高的生產(chǎn)強(qiáng)度；另外也使得細(xì)胞對(duì)3-HP的耐受性更高，因而可以具有更高的終產(chǎn)物濃 度，本發(fā)明3-HP濃度可達(dá)75gI71以上，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
[0030] 4)通常用大腸桿菌或克雷伯桿菌等微生物生產(chǎn)3-羥基丙酸時(shí)，微生物利用甘油 產(chǎn)3-HP同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量乳酸，乳酸是3-羥基丙酸的同分異構(gòu)體且物化性質(zhì)與3-羥基丙酸 極為接近從而導(dǎo)致分離純化困難，本發(fā)明接入微生物二氧化葡萄糖