一種提高酵母β-D-葡聚糖水溶性的硫酸酯化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品加工領(lǐng)域，尤其涉及一種提高酵母e-D-葡聚糖水溶性的硫酸酯 化制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，大量的研宄證實(shí)0-D-葡聚糖具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗菌和愈合傷口等 顯著的生理功效，日益引起了人們?nèi)找骊P(guān)注。然而，酵母e-D-葡聚糖呈中性，呈聚集狀，不 溶于水，稍溶于DMSO中，這嚴(yán)重制約了其在工業(yè)上的應(yīng)用。
[0003] 酵母-D-葡聚糖水溶性與聚合度、分支度和化學(xué)修飾等有關(guān)，改善其溶解性的 方法主要有物理方法和化學(xué)方法兩大類，具體為：
[0004] 物理方法：對(duì)酵母e-D-葡聚糖物理修飾經(jīng)常采用的主要是超聲法、臭氧法和過(guò) 氧化氫法。然而單獨(dú)用超聲法處理對(duì)于增加酵母e-D-葡聚糖的溶解性效果并不顯著，且 用臭氧法和過(guò)氧化氫法等氧化降解法制備的可溶性酵母e-D-葡聚糖分子量分布范圍寬， 并易引入氧化劑等雜質(zhì)。
[0005] 化學(xué)方法：化學(xué)修飾法可明顯地增加e-D-葡聚糖的溶解性，但會(huì)改變其天然結(jié) 構(gòu)，造成其生物活性下調(diào)或上調(diào)。通過(guò)羧甲基化的方法對(duì)酵母e-D-葡聚糖進(jìn)行增溶改性， 可增加其水溶性，但羧甲基化對(duì)酵母e-D-葡聚糖生理活性增強(qiáng)沒(méi)有硫酸酯化的效果明 顯O
[0006] 葡聚糖硫酸酯因其具有廣泛的生物學(xué)性質(zhì)，包括抗病毒、抗腫瘤、抗凝活性等，關(guān) 于葡聚糖硫酸酯化的方法有如下報(bào)道：
[0007] 黃國(guó)宏在酵母0-1，3-D葡聚糖硫酸酯制備工藝的研宄一文寫(xiě)明了酵母0-1，3-D葡聚糖硫酸酯的制備方法，具體為：稱取〇.3g酵母0-1，3-D葡聚糖于錐形瓶中，加入IOmL 二甲基甲酰胺，在室溫下劇烈攪拌，使酵母e-l，3-D葡聚糖充分懸浮于二甲基甲酰胺中， 然后逐漸加入氯磺酸濃度在15%的酯化劑15mL，在60°C下攪拌反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后，立即 倒入IOOmL的冰水中，用10%氫氧化鈉中和至pH7. 2,加入3-5倍體積的無(wú)水乙醇，靜置， 離心，將沉淀用自來(lái)水偷襲48h，蒸餾水透析24h，透析液經(jīng)冷凍干燥得到白色的酵母0 -1， 3-D葡聚糖硫酸酯（黃國(guó)宏，酵母0-1，3-D葡聚糖硫酸酯制備工藝的研宄，食品工業(yè)科技， 2009,30 (08) :261-263)
[0008] CN99116588. 8(CN1283632A)公開(kāi)了具有抗腫瘤活性的靈芝a-（1 - 3) -D- 葡聚糖硫酸酯化衍生物及其用途和制備方法，其中，該衍生物為靈芝a- (1 - 3)-D-葡聚糖 硫酸酯化衍生物的制備方法包括：該方法將a-（1 - 3) -D-葡聚糖溶于含0. 25MLiCl 的二甲基亞砜混合溶劑中，在攪拌下加入磺化試劑（如實(shí)施例1所示為4. 9mL氯磺酸滴加 到24mL吡啶），反映4-6小時(shí)，最后用氫氧化鈉水溶液中和至中性，在用丙酮沉淀并用丙酮 /水混合溶液洗滌后，即得到多糖的硫酸酯衍生物。
[0009] 而常規(guī)的硫酸化方法如：氯磺酸-吡啶法、氯磺酸-甲酰胺法等普遍采用氯磺酸等 劇毒試劑為酯化劑。而在正丙醇非均相體系中，以硫酸為酯化劑進(jìn)行酯化反應(yīng)，雖容易分離 得到生成的酵母e-D-葡聚糖硫酸酯，但產(chǎn)品得率僅為37.4% (w/w)，且反應(yīng)是在非均相體 系中進(jìn)行，制備的酵母0-D-葡聚糖水溶性衍生物一般取代度低且分布不均一。本專利中 采用的二甲基亞砜是一種微毒性物質(zhì)，其毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于氯磺酸等劇毒試劑。目前尚未見(jiàn)一 種利用超聲聯(lián)合硫酸酯化法有效改善酵母0 -D-葡聚糖溶解性方法的報(bào)道

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是的是提供一種提高酵母0 -D-葡聚糖水溶性的硫酸酯化方法， 該方法采用超聲處理和硫酸酯化結(jié)合，對(duì)酵母e-D-葡聚糖進(jìn)行修飾改性，可顯著提高 e-D-葡聚糖水溶性。
[0011] 本發(fā)明所提供的一種提高酵母0 -D-葡聚糖水溶性的硫酸酯化方法，包括如下步 驟：
[0012] 1)以酵母e-D-葡聚糖為原料，溶于含有尿素的二甲基亞砜溶液中，攪拌溶解后 得到溶液a;
[0013] 2)所述溶液a置于冰浴中，經(jīng)過(guò)超聲處理后，仍置于冰浴中，邊攪拌邊緩慢滴加含 有H2SO^DMSO溶液得到溶液b;
[0014] 3)將溶液b置于油浴恒溫振蕩器中進(jìn)行酯化反應(yīng)，將酯化后的溶液快速冷至室 溫，并加去離子水，稀釋后，過(guò)聚酯膜微濾，再依次經(jīng)超濾處理、濃縮和干燥即得到所述硫酸 酯化酵母0-D-葡聚糖。
[0015] 上述方法中：
[0016] 步驟1)中：
[0017] 所述含有尿素的二甲基亞砜溶液中尿素含量為4-6M;
[0018] 所述酵母0 -D-葡聚糖原料與含尿素的二甲基亞砜溶液的質(zhì)量體積g/ml比為1 : 20-25 ；
[0019] 步驟2)中
[0020] 所述超聲工作頻率范圍為15-20KHZ，功率范圍為200-400W，循環(huán)處理時(shí)間20s，間 歇時(shí)間5s，循環(huán)10-12次；
[0021] 含有H2SO^DMSO溶液中為含有5 %H#04的DMSO溶液；
[0022] 所述溶液b中，溶液a與含有H2SOj^DMSO溶液的體積比為：I: 1。
[0023] 步驟3)，所述油浴恒溫振蕩器的溫度為100°C，轉(zhuǎn)速為IOOrpm，時(shí)間為2-3h;
[0024] 所述酯化后的溶液用去離子水加至酵母0 -D-葡聚糖重量g的500-800倍體積 ml；
[0025] 所述聚酯膜的孔徑大小為0. 8ym;
[0026] 所述超濾包括以下步驟：使用去離子水與溶液e的體積比例為25 :1，操作壓力為 0. 15Mpa，溫度為35°C，循環(huán)處理10次；
[0027] 經(jīng)過(guò)超濾后的分子量大小可為：10,000 ;
[0028] 所述濃縮時(shí)的為原體積的1/10 ;
[0029] 所述干燥方式為噴霧干燥。
[0030] 優(yōu)選地，所述硫酸酯化方法，包括如下步驟：
[0031] 1)以酵母e-D-葡聚糖為原料，溶于含有5M尿素的二甲基亞砜溶液中，攪拌溶解 后得到溶液a，其中酵母0-D-葡聚糖原料與含尿素的二甲基亞砜溶液的質(zhì)量體積g/ml比 為I:20-25 ;
[0032] 2)所述溶液a置于冰浴中，經(jīng)過(guò)超聲處理后，置于冰浴中，邊攪拌邊緩慢滴加含有 5%H2SO^DMSO溶液得到溶液b，超聲工作頻率范圍為15-20KHZ，功率范圍為200-400W， 循環(huán)處理時(shí)間20s，間歇時(shí)間5s，循環(huán)10-12次，溶液a與含有H2SOj^DMSO溶液的體積比 為 1 :1 ;
[0033] 3)將溶液b置于油浴恒溫振蕩器中進(jìn)行酯化反應(yīng)，溫度為100°C，轉(zhuǎn)速為lOOrpm， 反應(yīng)時(shí)間為2-3h，將酯化后的溶液快速冷至室溫，并加去離子水至溶液的量為酵母 0 -D-葡聚糖重量g的500-800倍體積ml，然后過(guò)0. 8ym聚酯膜微濾，再依次經(jīng)超濾處理、 濃縮和干燥，即得到所述硫酸酯化酵母0 -D-葡聚糖。
[0034] 本發(fā)明還提供了上述硫酸酯化方法制備得到的酵母0 -D-葡聚糖，其0 -D-葡聚 糖的取代度為0.51，得率為90. 12%。
[0035] 本發(fā)明提供的酵母0 -D-葡聚糖的制備方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0036] 1、方法上：
[0037] 采用超聲聯(lián)合硫酸酯化方法制備的酵母0 -D-葡聚糖易溶于水，應(yīng)用范圍廣；
[0038] 采用二甲基亞砜加入尿素作為酯化的均相體系進(jìn)行硫酸酯化改性增溶，其毒性遠(yuǎn) 低于普遍采用的利用氯磺酸等劇毒試劑為酯化劑，降低了操作風(fēng)險(xiǎn)；
[0039] 采用此方法制備的酵母0 -D-葡聚糖硫酸酯具有增強(qiáng)免疫的功效，其中經(jīng)高壓微 射流處理和硫酸酯化后的酵母0-D-葡聚糖衍生物對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)轉(zhuǎn)化率、小鼠 血清中總補(bǔ)體溶血活性（CH50)和小鼠NK細(xì)胞活性均具有極顯著性差異（P< 0. 01)。
[0040] 2、本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)工業(yè)副產(chǎn)物廢啤酒酵母的綜合利用，增加工業(yè)副產(chǎn)物的利用率和 附加價(jià)值，具有重大的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)保意義。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0042] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043] 下述實(shí)施例每步驟的數(shù)據(jù)處理都是采用DPS軟件完成。
[0044] 實(shí)施例1、提高酵母0 -D-葡聚糖水溶性的硫酸酯化方法
[0045] 1)將100g酵母0 -D-葡聚糖溶于2L的DMSO(含5M的尿素）中，攪拌溶解后，得 到溶液a。
[0046] 2)將溶