電泳結(jié)果，從左及右為綜3(B)、衡白522(A)的擴(kuò)增結(jié)果和編號 為248-310的樣本；
[0028] F為第六次點樣的電泳結(jié)果，從左及右為綜3(B)、衡白522(A)的擴(kuò)增結(jié)果和編號 為311-372的樣本；
[0029] 共檢測了 372個樣本，結(jié)果說明與傳統(tǒng)的一次點樣方法相比，在相差不大的檢測 時間內(nèi)，能夠檢測多5倍數(shù)量的樣品，且與一次點樣方法相比，六次點樣法的相同樣品的檢 測結(jié)果類似，無明顯差異，極大提高了檢測效率。
[0030] 圖2為SSR分子標(biāo)記ND74 -次點樣聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果圖，圖中從左及 右，共64條泳道，分別為綜3 (B)、衡白522 (A)的擴(kuò)增結(jié)果和編號為1-62的樣本檢測結(jié)果， 檢測結(jié)果與圖1中的A排結(jié)果相同。
【具體實施方式】
[0031] 以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0032] 若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段； 實施例中所用的試劑為市售商品。
[0033] 實施例1基因組DNA的小樣提取和SSR分子標(biāo)記引物的合成
[0034] 玉米葉片DNA的提取：（1)將三葉一心期的玉米幼苗葉片剪取2cm，所取葉片置于 研缽中，加入500mL 1. 67%的CTAB提取液，研磨至勻漿，倒入1. 5mL離心管中；
[0035] ⑵65°C水浴30~45min，水浴期間要溫和震蕩2~3次，水浴后取出離心管放于 室溫自然冷卻5min;
[0036] (3)向離心管中加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1體積比），輕輕搖動混勾，然后 于高速離心機(jī)中以12000g的轉(zhuǎn)速離心10min;
[0037] (4)取上清液于新的1. 5mL離心管中，加入兩倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀DNA;
[0038] (5) 12000g離心lOmin，去上清。加75%乙醇清洗DNA沉淀30min，離心后倒掉75% 乙醇。重復(fù)三次，最后去75%乙醇，風(fēng)干DNA;
[0039] (6)待完全干燥后，加200 y L的ddH20溶解DNA，溶解后置于-20°C條件下保存?zhèn)?用。
[0040] SSR分子標(biāo)記引物的合成：由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成兩對在玉 米自交系Z3和HB522具有多態(tài)性的SSR分子標(biāo)記引物，并且在構(gòu)建的F2分離群體中基因型 分離效果較好。兩個自交系雜交后得到F1代，F(xiàn)1代種子自交得到大量的F2代分離群體，這 兩個標(biāo)記主要是在分離群體中進(jìn)行多態(tài)性檢測，來定位玉米某些性狀的QTL。ND74是在玉 米第三號染色體3. 03bin開發(fā)的SSR分子標(biāo)記，BAC名稱，AC204749, SSR重復(fù)是AG15。引 物序列如下：
[0041] ND74-F ：CAAGCACGCATAAAGGAGGA,
[0042] ND74-R ：AGCAACACCCATGACATACC ；
[0043] 合成后的引物不要打開蓋子，先置于高速離心機(jī)中以6000g的轉(zhuǎn)速離心2_3min， 加ddH 20溶解稀釋至5 y M，充分溶解后，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0044] 實施例2 SSR分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增
[0045] PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的配置：PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系表1。針對實施例1的1個SSR分子 標(biāo)記，模板來自玉米兩個自交系Z3和HB522雜交自交后的F2分離群體，共372個樣本，不 同在于采用不同的與其對應(yīng)的上下游引物。引物序列參見實施例1。
[0046] 表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（10 y L)
【主權(quán)項】
1. 一種提高SSR分子標(biāo)記擴(kuò)增和檢測效率的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 基因組DNA的提??； (2) SSR分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增；所述PCR擴(kuò)增包括2個不同的循環(huán)程序； (3) 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測采用六次 點樣法；所述六次點樣法為同一個加樣孔中分時段先后6次加入不同的PCR產(chǎn)物； (4) 銀染顯色。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)中PCR擴(kuò)增方法為：94°C3min; 94。〇308,53-621：308,721：308，15個循環(huán)；941：208,53-621：208,721：308,20個循環(huán) ； 72°C5min〇
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)中PCR擴(kuò)增方法為：94°C3min; 94。〇308,56-601：308,721：308，15個循環(huán)；941：208,56-601：208,721：308,20個循環(huán) ； 72°C5min〇
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)中PCR擴(kuò)增方法為：94°C3min; 94°C30s，58°C30s，72°C30s，15 個循環(huán)；94°C20s，58°C20s，72°C30s，20 個循環(huán)； 72°C5min〇
5. 如權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步驟（3)中，在點樣之前進(jìn)行預(yù)電泳， 使電泳緩沖液的溫度達(dá)到50°C。
6. 如權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步驟（3)中電泳條件為2000V， 100mA，80W恒功率電泳。
7. 如權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步驟（3)所述六次點樣法為在預(yù)電 泳結(jié)束后，向點樣孔中加入擴(kuò)增產(chǎn)物，開始第一次點樣，電泳5-20min之后，進(jìn)行第二次點 樣，電泳時間與第一次時間相同，之后再進(jìn)行第三次電泳，電泳時間比第二次縮短lmin，以 此類推，至第五次點樣后電泳時間比第4次的電泳時間縮短Imin;第六次點樣之后，電泳 20_40min，結(jié)束電泳。
8. 如權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步驟⑶所述六次點樣法為在預(yù)電泳 結(jié)束后，向點樣孔中第一次點樣加入擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳8min后進(jìn)行第二次點樣，電泳8min后 進(jìn)行第三次點樣，電泳7min后進(jìn)行第四次點樣，電泳6min后進(jìn)行第五次點樣，電泳5min后 進(jìn)行第六次點樣，電泳30min，結(jié)束電泳。
9. 權(quán)利要求1-8任一所述的方法在植物遺傳系譜分析中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求1-8任一所述的方法在高通量植物樣本基因型檢測中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種提高SSR分子標(biāo)記擴(kuò)增和檢測效率的方法，屬于SSR分子標(biāo)記檢測應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明通過改進(jìn)傳統(tǒng)的SSR分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增方法以及在聚丙烯酰胺電泳檢測時采用六次點樣方法，極大地縮短了SSR分子標(biāo)記檢測時間。本發(fā)明改進(jìn)后的PCR擴(kuò)增時間較傳統(tǒng)的SSR分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增時間縮短了37min；在聚丙烯酰胺電泳檢測過程中通過六次點樣技術(shù)，與傳統(tǒng)的一次點樣技術(shù)相比，將制膠凝膠時間，預(yù)電泳時間、電泳時間和染色縮短為傳統(tǒng)時間的五分之一，并且能同時檢測大量樣本的基因型，降低了制備凝膠和染色試劑的成本。本發(fā)明方法可用于檢測大量植物樣本的基因型。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104762393
【申請?zhí)枴緾N201510167089
【發(fā)明人】翟立紅, 騰峰, 李知洪, 張祖新
【申請人】湖北文理學(xué)院
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年4月9日