來自阿富汗鏈霉菌的l-谷氨酸氧化酶基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種來自淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的L-谷 氨酸氧化酶基因及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 1983年，日本人Kamei等首次從淺紫鏈霉菌（Streptomyces violascens)麥 麩培養(yǎng)基抽提物中發(fā)現(xiàn)一種能催化谷氨酸氧化產(chǎn)生α-酮戊二酸和過氧化氫的酶，該 酶是典型的氧化酶而不是脫氫酶，NAD+，NADP+不能作為該酶的電子受體，因此將其命 名為L-谷氨酸氧化酶（L-Glutamate oxidase，LG0X)。該酶的分子量約為60KD，具有 黃素蛋白（FAD)的特征性吸收光譜（吸收峰為490nm)，每摩爾酶中含有1個摩爾的 FAD (Chemical&pharmaceutical bulletin，1983, 31，1307-1314)。底物特異性研宄表明， 在pH5. 0-6. 5范圍內(nèi)，它能有效地催化L-谷氨酸的氧化，并且對L-谷氨酰胺、L-酪氨酸和 L-組氨酸有微弱的氧化作用；在pH6. 8時，對L-谷氨酰胺和L-組氨酸的相對活性分別為 L-谷氨酸的32. 1 %和13. 1 %，Km值分別3. 3和5. OmM。在pH5. 0時，對L-谷氨酸和L-谷 氨酰胺的Km值分別為I. ImM和10mM。該酶的穩(wěn)定性尚好，在pH3. 0-7. 0范圍內(nèi)，37°C可穩(wěn) 定 1 小時（Chemical&pharmaceutical bulletin，1983,31，3609_3616)〇
[0003] 同年，Kusakabe 等從另外一株鏈霉菌 X-119-6 (Streptomyces sp. X-119-6)菌株 中分離出特異性更好的L-谷氨酸氧化酶，以L-谷氨酸為底物的Km值僅為0. 2mM。該酶分 子量大約為140000,由三個亞基組成，每個酶分子上結(jié)合有2個FAD。最適pH為7. 0-8. 0。 該酶耐熱性較強(qiáng)，在PH5. 5的條件下，65°C加熱15分鐘不失活；75°C加熱15分鐘，活性為 87% ;85°C加熱15分鐘，活性仍能保留47%。該酶除催化L-谷氨酸氧化外，僅對L-天 冬氨酸有微弱的催化作用（在ρΗ7· 4時，相對活性為L-谷氨酸的0· 6% ) (Agricultural and Biological Chemistry，1983,47,1323-1328)。1989 年，德國 Bohmer 等從內(nèi)涂鏈霉 菌（Streptomyces endus)中分離純化到對L-谷氨酸完全特異的L-谷氨酸氧化酶。其 分子量為90000,由兩個亞基構(gòu)成，亞基分子量為50000,每個亞基含有一個非共價結(jié)合的 FAD。在 ρΗ7· 0 時對 L-谷氨酸 km 值為 I. ImM(European Journal of Bi°C hemistry，1989， 182, 327-332)。2001 年，臺灣 Chen 等從普拉特鏈霉菌 NTU3304 (Streptomyces platensis NTU3304)純化獲得L-谷氨酸氧化酶，該酶對L-谷氨酸?；院?，用作生物傳感器時只 對 L-谷氨酸反應(yīng)（Canadian Journal of Microbiology，2001，47,269-275);2004 年俄 羅斯Sukhacheva等篩選到一株產(chǎn)L-谷氨酸氧化酶的鏈霉菌Streptomyces sp. Z-11-6， 經(jīng)過亞硝酸誘變，酶的比活為50. 8U/mg，該酶特異性好，只氧化L-谷氨酸，不受其它氨基 酸的影響（Applied Bi°Chemistry and Microbiology，2004,40，146_150)。2004 年，泰 國Wachiratianchai等從另一株鏈霉菌Streptomyces sp. 18G中純化獲得了 一個新的 L-谷氨酸氧化酶，該酶由兩個亞基組成分子量為120000,最適pH為pH7. 0,對L-谷氨酸底 物比較專一，對D-谷氨酸和D-天冬氨酸的相對活性只有0.79 %和0.53 % (Journal of Biotechnology，2004, 7, 277-284)〇
[0004] 早在90年代初華東理工大學(xué)李友榮教授在尋找L-谷氨酸氧化酶產(chǎn)生菌方面做了 一系列工作，他們報道從土壤分離到能產(chǎn)生L-谷氨酸氧化酶鏈霉菌菌株，其后通過對該菌 株進(jìn)行誘變，理性化篩選獲得了穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株N14,經(jīng)發(fā)酵后，每毫升發(fā)酵液中酶活性可 達(dá)14. 83U(華東化工學(xué)院學(xué)報，1993,19 (5)，567-573)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國外報道的產(chǎn)酶量，可惜 對酶的性質(zhì)等未做進(jìn)一步的研宄報道，該菌種也沒有開發(fā)出產(chǎn)品。
[0005] 酶法分析是國際公認(rèn)的谷氨酸分析方法，已經(jīng)被多個國際權(quán)威組織采納：如國際 果汁生產(chǎn)協(xié)會（IFU)、歐盟果蔬汁及飲料生產(chǎn)聯(lián)盟（AIJN)、中歐釀造分析委員會（MEBAK)等 均利用酶法進(jìn)行谷氨酸檢測。然而，在谷氨酸酶法檢測中使用最多的是谷氨酸脫氫酶，如美 國Bio Vision公司谷氨酸檢測試劑盒、Sigma公司推出的谷氨酰胺和谷氨酸檢測試劑盒、 臺灣Abnova公司谷氨酸檢測試劑盒等等。以L-谷氨酸氧化酶進(jìn)行谷氨酸監(jiān)測很早就在食 品和醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域開展。如1986年，Kamei等就利用自己提取的LGOX建立起測定丙氨酸 氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST)的熒光分析方法，以高香草酸為色原，在過 氧化物酶的催化下，H202與高香草酸反應(yīng)形成熒光物質(zhì)，通過測定熒光強(qiáng)度而求得酶活性 (Chemical&pharmaceutical bulletin，1986, 34,409-412)。我國至今還沒有研發(fā)出谷氨酸 檢測試劑盒，蘇州艾杰生物科技有限公司2007年曾試圖開發(fā)以谷氨酸氧化酶為基礎(chǔ)的谷 氨酸測定試劑盒（中國專利2007100233857)，但是至今沒有應(yīng)用，一個重要的制約因素為 L-谷氨酸氧化酶的供給問題沒有解決。
[0006] L-谷氨酸氧化酶還可以廣泛地應(yīng)用于生物傳感器，由于谷氨酸在LGOX催化下產(chǎn) 生H202, H202在一定的電位下能氧化，導(dǎo)致局部pH的變化，因此通過測定H202氧化電流 的增加就能間接地測定谷氨酸的含量。最早日本人Karube利用微型氧電極研制出谷氨酸 氧化酶電極，利用此電極測定溶液中谷氨酸含量范圍在5-50mM，但是該電極響應(yīng)時間長達(dá) 5分鐘（Biosensors，1987, 2,471) ; 1989年德國Wollenberger研制的基于谷氛酸氧化酶的 酶電極，響應(yīng)時間短、選擇性較好，利用該LGOX生物傳感器能在谷氨酸生產(chǎn)過程中進(jìn)行有 效的監(jiān)測（Biosensors，1989,4, 381)。由于谷氨酰胺能在轉(zhuǎn)氨酶催化下產(chǎn)生谷氨酸，將轉(zhuǎn)氨 酶與LGOX共同固定在電極膜上，也能用于測定液體中谷氨酰胺含量（US patent4780191)。 在動物細(xì)胞培養(yǎng)中，谷氨酰胺對細(xì)胞的生長非常關(guān)鍵，利用雙酶法研制的傳感器在動物細(xì) 胞培養(yǎng)中得到很好的應(yīng)用（US patent5411866)。利用LGOX制成的更精細(xì)的生物傳感器還 可以用于腦組織中谷氨酸含量測定[14]，如：2011年美國人Braeken將丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶 和LGOX結(jié)合，制造出雙酶電極傳感器，由于L-谷氨酸在LGOX氧化產(chǎn)生的α -酮戊二酸可 以作為轉(zhuǎn)氨酶的底物，導(dǎo)致底物循環(huán)利用，從而使信號增強(qiáng)，該電極可以用于測定腦細(xì)胞中 谷氨酸的變化，診斷精神疾病（US patent20110003322Al)。其它一些轉(zhuǎn)氨酶如ALT和AST 都能將氨基轉(zhuǎn)化到α -酮戊二酸上，產(chǎn)生L-谷氨酸，因此這些酶的活性均可以通過谷氨酸 氧化酶電極測定出來，L-谷氨酸氧化酶在診斷醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景非常。
[0007] 尋找L-谷氨酸氧化酶產(chǎn)生菌的研宄至今方興未艾，然而，至今所篩選到的L-谷氨 酸氧化酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶能力都很低，即使經(jīng)過誘變，產(chǎn)酶能力也不高，因此實現(xiàn)基因工程化 生產(chǎn)成為解決該酶來源的根本途徑。
[0008] 2000年，臺灣國防醫(yī)學(xué)院Yu-Tien Liu教授首先通過篩庫法獲得了普拉特鏈霉 菌NTU3304中的LGOX基因，該基因長2130bp，在變鉛青鏈霉菌（Streptomyces Iividans) 中表達(dá)的前體蛋白為78KDa，且含有信號肽序列，成熟的LGOX由三個亞基組成，分別稱為 α、β、γ，分子量分別為39,19和16KDa。三種亞基在前體多肽鏈中從N端到C端的排 列順序是α-γ-β。此酶屬于黃素酶類，活性中心含一分子FAD(Canadian Journal of Microbiology，2001，47, 269-275)。2006 年日本 Yamasa 公司構(gòu)建了鏈霉菌 X-119-6 基因組 文庫，通過探針篩選獲得了 LGOX基因，該基因長2103bp，編碼701個氨基酸，含有14個信號 肽序列，成熟的蛋白也是由α、β、γ三個亞基組成，一般組成二聚體形式，分子量大約為 140KDa。他們構(gòu)建大腸桿菌強(qiáng)啟動子調(diào)控LGOX基因表達(dá)的載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，實現(xiàn) 了 LGOX前體蛋白在大腸桿菌的高效表達(dá)，表達(dá)的前體蛋白經(jīng)過內(nèi)切蛋白酶處理后可以變 成活性蛋白（US patent7109008)。目前該產(chǎn)品轉(zhuǎn)由Kikkoman公司生產(chǎn)并壟斷了市場。
[0009] 2009年Arima以蛇毒中的氨基酸氧化酶為模板建模，獲得了鏈霉菌X-119-6中 LGOX的三維結(jié)構(gòu)模型。通過與氨基酸氧化酶結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)：LGOX三維結(jié)構(gòu)表面比氨基酸氧 化酶多3個區(qū)域，其中一個區(qū)域構(gòu)成LGOX的第二個底物入口；LGOX底物入口到活性中心處 的過道更加狹長；此外在LGOX中，由于氨基酸氧化酶活性位點的異亮氨酸和甘氨酸分別由 空間結(jié)構(gòu)更大的色氨酸和精氨酸取代，使得LGOX活性區(qū)域更加狹小，這些結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致 LGOX 的底物更專一（FEBS Journal，2006,276,3894-3903)。Utsumi 等人近來對該區(qū)域進(jìn) 行了初步研宄，他們將精氨酸突變?yōu)楸彼岷蟀l(fā)現(xiàn)，LGOX的底物專化性消失，此時，LGOX變 化為氨基酸氧化酶，可以催化多種氨基酸氧化（Bi°Chemical and Biophysical Research Communications，2012,417,951-955) 〇
[0010] 由于LGOX生產(chǎn)被國外企業(yè)控制，我國在上述領(lǐng)域研宄相對滯后，而至今所篩選到 的L-谷氨酸氧化酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶能力大多很低，即使經(jīng)過誘變，產(chǎn)酶能力也不高，因此獲 得新型LGOX基因并實現(xiàn)基因工程化生產(chǎn)成為解決該酶來源的根本途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種L-谷氨酸氧化酶基因，該基因源自于阿富汗鏈 霉菌。
[0012] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種L-谷氨酸氧化酶基因的原核表達(dá)載體。
[0013] 本發(fā)明的還有一個目的在于提供一種原核表達(dá)L-谷氨酸氧化酶在L-谷氨酸含量 檢測中的應(yīng)用方法。
[0014] 本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0015] 所述的來自阿富汗鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID Nol， 其編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID N02。
[0016] 所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因的獲取方法如下：
[0017] 利用含50ppm重鉻酸鉀的高氏一號培養(yǎng)基（高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g/L， KN03lg/L，K2HPO4O. 5g/L，MgSO4 · 7Η200· 5g/L，NaClO. 5g/L，F(xiàn)eSO4 · 7Η200·