專(zhuān)利名稱(chēng)：一種茶樹(shù)谷氨酸脫氫酶基因CsGDH及其編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及茶樹(shù)谷氨酸脫氫酶基因CsGDH、該基因編碼的蛋白以及該基因的應(yīng)用， 通過(guò)茶樹(shù)谷氨酸脫氫酶基因CsGDH基因工程技術(shù)的研究，培育氨基酸含量高的茶樹(shù)新品 種，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehyd rogenase，⑶H ；EC 1. 4. 1. 2)普遍存在于植物體 內(nèi)，該酶主要位于植物線(xiàn)粒體內(nèi)，由兩個(gè)亞基(α和β)按不同比例組成七種同工酶形式。 GDH既能催化銨與α-酮戊二酸結(jié)合生成谷氨酸，也能催化谷氨酸氧化脫羧。GDH曾被認(rèn)為 是植物同化銨的主要酶，直到1974年證實(shí)谷氨酰胺合成酶(GQ-谷氨酸合酶(GOGAT)循環(huán) 才是高等植物體內(nèi)銨同化的主要途徑，因此，對(duì)于高等植物的GDH功能的研究與解釋一直 存在爭(zhēng)議。較為普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為，GDH在植物體內(nèi)只要行使同化銨離子的功能，是高等植物 N代謝途徑中的一個(gè)重要成員。基于⑶H在植物氮素吸收利用過(guò)程中的重要作用，近年來(lái)關(guān)于利用⑶H基因進(jìn)行 轉(zhuǎn)基因植物的研究比較多。已有研究表明，將大腸桿菌的gdhA轉(zhuǎn)入煙草，提高了煙草產(chǎn)量， 轉(zhuǎn)基因煙草中游離氨基酸和碳水化合物的含量與野生型相比有所提高。將大腸桿菌的gdhA 轉(zhuǎn)入玉米，同樣提高了玉米的產(chǎn)量，并且同時(shí)提高了玉米對(duì)于干旱的耐受力。將小球藻GDH 基因轉(zhuǎn)入煙草內(nèi)，增加了煙草對(duì)于銨離子的吸收和利用，提高了煙草對(duì)氮素的利用效率。將 番茄GDH基因Iegdhl轉(zhuǎn)入番茄后，轉(zhuǎn)基因番茄中總游離氨基酸的量是正常番茄的2. 3倍， 特別是谷氨酸的含量明顯增加。GDH基因能夠顯著改變植物生長(zhǎng)狀態(tài)，提高植物的產(chǎn)量以及 對(duì)于一些脅迫環(huán)境的耐受力，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。茶樹(shù)[Camellia sinensis (L.) 0. Kuntze]屬于山茶科山茶屬，為多年生常綠木本 植物。茶樹(shù)是重要的葉用經(jīng)濟(jì)植物，因此是喜氮作物，對(duì)氮的需求量最大。氮素被茶樹(shù)吸收 后，在茶樹(shù)體內(nèi)主要轉(zhuǎn)化為各類(lèi)氨基酸。氨基酸是茶葉鮮爽為的主要物質(zhì)，是決定茶葉香、 味的主要化學(xué)成分，尤其對(duì)綠茶滋味的影響尤為明顯，與茶葉品質(zhì)呈顯著正相關(guān)。因此，通 過(guò)植物基因工程技術(shù)，培育氨基酸含量高的茶樹(shù)新品種，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個(gè)問(wèn)題是提供一種茶樹(shù)谷氨酸脫氫酶基因CsGDH，其具有 如序列表SEQ ID NO 1所示的基因序列。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下一種茶樹(shù)谷氨酸脫氫酶基因Cs⑶H，通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物RDOl和RD02進(jìn)行PCR
擴(kuò)增，其主要特點(diǎn)是簡(jiǎn)并引物RD01，其序列為5-CGC CCG GGG CCC NAT GAARGG-3 ；簡(jiǎn)并引物RD02，其序列為5-TCA CGC CCA GGG TGA ANG CNCCCAT-3 ；茶樹(shù)谷氨酸脫氫酶基因Cs⑶H保守片段的PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性!Min ；95°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C終止延伸IOmin0擴(kuò)增反應(yīng)后得到序列長(zhǎng)度為的Cs⑶H基因的保守序列片段。對(duì)Cs⑶H基因進(jìn)行5' RACE和3' RACE操作。根據(jù)已經(jīng)獲得的Cs⑶H保守片段 設(shè)計(jì)兩個(gè)基因特異性引物，其主要特點(diǎn)是基因特性引物5' -GSP，其序列為5' -AGT GAC ATC ACC GGA GCAGTT AAG A-3'；基因特性引物3' -GSP，其序列為5' -ACC ACG TCC AGT TGC AGCCTC CCT A-3'。5' RACE PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性anin ;95°C變性30s，64°C退火45s， 72°C延伸40s，;35個(gè)循環(huán)；72°C終止延伸lOmin。3' RACEPCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性 2min ；95°C變性 30s，64°C退火 45s，72°C延伸 40s，;35 個(gè)循環(huán)；72°C終止延伸 IOmin0通過(guò)5' RACE和3' RACE，分別獲得了長(zhǎng)度為512bp和498bp的Cs⑶H基因的5' 端和3'端序列(圖4)。將三段基因片段拼接后獲得了 Cs⑶H的cDNA序列，如序列表SEQ ID NO 1 所示。CsGDH 全長(zhǎng) 1667bp。本發(fā)明所要解決的第二個(gè)問(wèn)題是提供上述基因所編碼的蛋白質(zhì)CsGDH及其制備 方法，其具有如序列表SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下通過(guò)ORFinder軟件預(yù)測(cè)，Cs⑶H基因編碼一個(gè)411個(gè)氨基酸的多肽，如序列表SEQ ID NO 2 所示。本發(fā)明所要解決的第三個(gè)問(wèn)題是提供含有茶樹(shù)Cs⑶H基因的重組質(zhì)粒 pMAL-Cs⑶H及其構(gòu)建方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下利用設(shè)計(jì)的兩種擴(kuò)增引物Cs⑶H-Pl和Cs⑶H-P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所述兩種擴(kuò)增 引物的序列分別為CsGDH-Pl 5' -AAT ATC GCG GATCCA TGA ACG CTC TCG CCG CCA CAA ACC-3‘ ；CsGDH-P2 5' -ATAAGA ATA AGC TTC GCT TCC CAA CCC CTT AAT ACA GTT-3‘。所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性:3min ；95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延 伸lmin30s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pMAL_p2X分別經(jīng)BamHI和 HindIII雙酶切4小時(shí)候后進(jìn)行連接，獲得原核表達(dá)質(zhì)粒pMAL-Cs⑶H。本發(fā)明所要解決的第四個(gè)問(wèn)題是提供在大腸桿菌中異源表達(dá)的茶樹(shù)CsGDH蛋白。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下構(gòu)建了一種含有茶樹(shù)Cs⑶H基因的重組質(zhì)粒pMAL-Cs⑶H。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 E. coliRosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C，225rpm，培 養(yǎng)12h。取Iml菌液接種于50ml的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37°C，225rpm，振蕩培養(yǎng)至 OD600 0. 6-0. 8，加入IPTG至終濃度0. 5mM，22°C誘導(dǎo)表達(dá)20h。將誘導(dǎo)后的菌液于4°C， 5，OOOrpm,離心5min，收集菌體，超聲波破碎后SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白MBP-Cs⑶H存 在于可溶性的上清蛋白中(圖4)。本發(fā)明所要解決的第五個(gè)問(wèn)題是提供茶樹(shù)CsGDH基因在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是茶樹(shù)[Camellia sinensis (L. ) 0. Kuntze]屬于山茶科山茶 屬，為多年生常綠木本植物。茶樹(shù)是重要的葉用經(jīng)濟(jì)植物，因此是喜氮作物，對(duì)氮的需求量最大。氮素被茶樹(shù)吸收后，在茶樹(shù)體內(nèi)主要轉(zhuǎn)化為各類(lèi)氨基酸。氨基酸是茶葉鮮爽為的主 要物質(zhì)，是決定茶葉香、味的主要化學(xué)成分，尤其對(duì)綠茶滋味的影響尤為明顯，與茶葉品質(zhì) 呈顯著正相關(guān)。因此，通過(guò)植物基因工程技術(shù)，培育氨基酸含量高的茶樹(shù)新品種，具有重要 的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


圖1茶樹(shù)總RNA電泳圖。圖2茶樹(shù)總cDNA電泳圖。圖3Cs⑶H基因的保守片段、5' RACE產(chǎn)物以及3' RACE產(chǎn)物電泳圖。M,DNA marker ； lane 1，CsGDH基因的保守片段，965bp ;lane2，CsGDH基因 5 ‘ RACE 產(chǎn)物，512bp ;lane 3，CsGDH 基因 3' RACE 產(chǎn)物，498bp。圖4MBP-Cs⑶H融合蛋白SDS-PAGE電泳圖。M, protein molecular marker ；lane 1，pMAL_p2X 空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Rosetta (DE3) 菌，誘導(dǎo)表達(dá)后的上清蛋白，融合標(biāo)簽MBP蛋白分子量約為43kDa ;lane 3，pMAL_Cs⑶H 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)菌，誘導(dǎo)表達(dá)后的上清蛋白，CsGDH本身分子量約為45kDa， MBP-Cs⑶H融合蛋白分子量約為88kDa。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例一一種茶樹(shù)谷氨酸脫氫酶基因Cs⑶H。采用SV Total RNA Isolation System(Promega)提取茶葉總 RNA(圖 1)。提取 的總 RNA利用 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成 cDNA第一鏈(圖2)。依據(jù)谷氨酸脫氫酶蛋白家族的保守性，設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物RD01(5-CGC CCG GGG CCC NATGAA RGG-3)和 RD02 (5-TCA CGC CCA GGG TGA ANG CNC CCAT-3)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性:3min ；95°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin， 35個(gè)循環(huán)；72°C終止延伸lOmin。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物(圖3)。使用DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收 PCR 產(chǎn)物。將該 DNA 片段連接到 pMD 19-T 載體(TaKaRa)， 陽(yáng)性克隆送到上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序，得到96^p Cs⑶H基因的保守序列片段。使用GeneRacer Kit (Invitrogen)進(jìn)行 CsBDP 的 5 ‘ RACE 和 3 ‘ RACE 操作。根 據(jù)已經(jīng)獲得的CsBDP的保守片段設(shè)計(jì)兩個(gè)基因特異性引物，分別為5' -GSP(5‘ -AGTGAC ATC ACC GGA GCA GTT AAG A-3 ‘)禾口 3 ‘ -GSP (5 ‘ -ACC ACG TCC AGT TGC AGC CTC CCT A-3')。5' RACE PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性^iiin ；95°C變性30s，64°C退火45s， 72°C延伸40s，;35個(gè)循環(huán)；72°C終止延伸lOmin。3' RACEPCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性 2min ；95°C變性 30s，64°C退火 45s，72°C延伸 40s，35 個(gè)循環(huán)；72°C終止延伸 IOmin0瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。切膠回收PCR產(chǎn)物。使用Τ0Ρ0 TACloning Kit(Invitrogen)克隆RACE PCR產(chǎn)物，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將陽(yáng)性克隆送至上海生工生物 工程有限公司測(cè)序。通過(guò)5' RACE和3' RACE,分別獲得了 512bp和498bp的CsBDP的5'端和3'端序列(圖3)。將三段基因片段拼接后獲得了 CsBDP的全長(zhǎng)cDNA序列，如序列表 SEQ ID NO 1 所示。CsBDP 全長(zhǎng) 1667bp。實(shí)施例二 一種由Cs⑶H基因編碼的蛋白質(zhì)Cs⑶H。通過(guò)ORFinder軟件預(yù)測(cè)，CsBDP基因編碼一個(gè)411個(gè)氨基酸的多肽，如序列表SEQ ID NO 2 所示。實(shí)施例三一種含有茶樹(shù)Cs⑶H基因的重組質(zhì)粒pMAL-Cs⑶H。利用CsGDH-P 1 (5 ‘ -AAT ATC GCG GAT CCA TGA ACG CTC TCGCCG CCA CAA ACC-3 ‘)禾口 CsGDH-P2 (5 ‘ -ATA AGA ATA AGC TTCGCT TCC CAA CCC CTT AAT ACA GTT-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性:3min ；95°C變性30s，55°C退火30s，72°C 延伸lmin30s，反應(yīng)；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pMAL_p2X (NewEngland Biolabs)分別經(jīng)BamHI和HindiII雙酶切4小時(shí)候后進(jìn)行連接，獲得原核表達(dá)質(zhì)粒 pMAL-CsGDHo實(shí)施例四一種含有茶樹(shù)Cs⑶H蛋白的融合蛋白MBP-Cs⑶H。將pMAL-Cs⑶H重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli Rosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆于 5ml LB液體培養(yǎng)基中，37 0C，225rpm,培養(yǎng)12h。取Iml菌液接種于50ml的LB液體培養(yǎng)基 中擴(kuò)大培養(yǎng)，370C，225rpm,振蕩培養(yǎng)至OD6tltl ^ 0. 6-0. 8，加入IPTG至終濃度0. 5mM, 22°C誘 導(dǎo)表達(dá)20h。將誘導(dǎo)后的菌液于4°C，5，OOOrpm,離心5min，收集菌體，超聲波破碎后SDS-PAGE 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白MBP-Cs⑶H存在于可溶性的上清蛋白中(圖4)。序列表
SEQUENCE LISTING
<110>安徽師范大學(xué)
<120>茶樹(shù)CsGDH基因序歹Ij
<130>1
<140>1
<141>2009-11-27
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1667
<212>DNA
<213> 茶樹(shù)(Camellia sinensis)
<400>1
tcgactggag cacgaggaca ctgacatggactgaaggagtagaaaattcc
tttgatccat60
tataatctct cactacacag tttccattta 3. 3. 3. 3. 3.
tttgaactgt120
ttgatccatt ttagtttctg ggtattgcttgtttgagtgattctcacaca
accatgaacg1800068]ctctcgccgccacaaaccgcaactttcgtcgtgcggctcgcattcttgga0069]ttggactcta2400070]ggattgagaagagtcttttgattccgttcagagaaatcaaggtagaatgc0071]acaattccta3000072]aggatgatggaactctggtgtcctacgttggattcagagtccaacatgat0073]aattctcgag3600074]gccccatgaaaggagggatcagataccatcctgaggttgatcctgatgag0075]gtaaatgctc4200076]tagctcaattgatgacatggaagactgctgtagcagacattccttatggt0077]ggagctaagg4800078]gtggaattggatgcaagccaaaggatttaggtaatagtgaattggaacgt0079]ctcactcggg5400080]tcttcactca￡1￡1￡1￡1￡Ι 0￡Ι gatctaattggggttaatagggatgtccct0081]gcgccggaca6000082]tggggactaatgcacagaccatggcttggattttggatgaatactcgaag0083]tttcatggtc6600084]attcaccagctgttgtgaccgggaagcccatagatcttggtgggtccctg0085]ggtagggagg7200086]ctgcaactggacgtggtgttatttatgccacagaagctttactcgctgaa0087]tatggaaaat7800088]caatcaaggatttgacatttgccatacagggttttggcaacgtggggtct0089]tgggcagcaa8400090]ggcttattcatgagagaggtggtaaggtcattgcagtgagtgacatcacc0091]ggagcagtta9000092]agaacccaaatgggattgatattccaattttgcttaatcataaggaagca0093]acggggagct9600094]tgaaaaattttgatggtggagatgccatgcatccaaatgaattgctccta0095]cataaatgtg10200096]atgtcctgattccatgtgccttgggaggagttatcaacagagaaaacgct0097]gataatgtaa10800098]gggccaagttcattgtaggagcggcaaatcatcctactgatccagaggca0099]gatgagattc11400100]tatctaagaaaggagttataatactacctgatatatatgcaaattctgga0101]ggtgtgacgg12000102]tcagctattttgagtgggtccagaatattcaaggtttcatgtgggacgaa0103]gagaaggtga12600104]acaaagagcttcataggtacatgacaagagctttcggtaacatcaaaagc0105]atgtgtcaga13200106]cacacaattgcaacctccgaatgggtgcgttcacgctgggagtgaatcgt0107]gttgcacggg13800108]caactgtattaaggggttgg gaagcgtgat ￡1￡1￡Ι 0￡100 tcacattcta0109]tttctccttt14400110]ttttcgtcttacaaataaat gcatttttgccgctgaagaatgcagcttga0111]tagcggttct15000112]ttgttttttttttttgggta agtaattgatagccgttcttaccctcccatttatagactg0113]15600114]tccgtgacttgaactcacgc tttcaggacgctggtcttaaaaaagttaaa0115]agactgtgta16200116]ctgttgtctgaaaatttgag gatcaaaaaa-&￡l￡l￡l￡l￡l￡l￡l￡l￡lSLSLSLSLSLSLSL0117]16670118]<210>1<211>4110119]<212>RT0120]<213> 茶樹(shù)(Camelliasinensis)0121]<400>20122]MetAsnAlaLeuAlaAlaThrAsnArgAsnPheArgArgAlaAla Arg0123]1510150124]IleLeuGlyLeuAspSerArglieGluLysSerLeuLeuliePro Phe0125]2025300126]ArgGlulieLysValGluCysThrlieProLysAspAspGlyThr Leu0127]3540450128]ValSerTyrValGlyPheArgValGlnHisAspAsnSerArgGly Pro0129]5055600130]MetLysGlyGlylieArgTyrHisProGluValAspProAspGlu Val0131]657075800132]AsnAlaLeuAlaGlnLeuMetThrTrpLysThrAlaValAlaAsp lie0133]8590950134]ProTyrGlyGlyAlaLysGlyGlylieGlyCysLysProLysAsp Leu0135]1001051100136]GlyAsnSerGluLeuGluArgLeuThrArgValPheThrGlnLys lie0137]1151201250138]HisAspLeulieGlyValAsnArgAspValProAlaProAspMet Gly0139]1301351400140]ThrAsnAlaGlnThrMetAlaTrplieLeuAspGluTyrSerLys Phe0141]1451501551600142]HisGlyHisSerProAlaValValThrGlyLysProlieAspLeu Gly0143]1651701750144]GlySerLeuGlyArgGluAlaAlaThrGlyArgGlyVallieTyr Ala0145]1801851900146]ThrGluAlaLeuLeuAlaGluTyrGlyLysSerlieLysAspLeuThr0147]1952002050148]PheAlalieGlnGlyPheGlyAsnValGlySerTrpAlaAlaArgLeu0149]2102152200150]IleHisGluArgGlyGlyLysVallieAlaValSerAsplieThrGly0151]2252302352400152]AlaValLysAsnProAsnGlylieAsplieProlieLeuLeuAsnHis0153]2452502550154]LysGluAlaThrGlySerLeuLysAsnPheAspGlyGlyAspAlaMet0155]2602652700156]HisProAsnGluLeuLeuLeuHisLysCysAspValLeulieProCys0157]2752802850158]AlaLeuGlyGlyVallieAsnArgGluAsnAlaAspAsnValArgAla0159]2902953000160]LysPhelieValGlyAlaAlaAsnHisProThrAspProGluAlaAsp0161]3053103153200162]GlulieLeuSerLysLysGlyVallielieLeuProAsplieTyrAla0163]3253303350164]AsnSerGlyGlyValThrValSerTyrPheGluTrpValGlnAsnlie0165]3403453500166]GlnGlyPheMetTrpAspGluGluLysValAsnLysGluLeuHisArg0167]3553603650168]TyrMetThrArgAlaPheGlyAsnlieLysSerMetCysGlnThrHis0169]3703753800170]AsnCysAsnLeuArgMetGlyAlaPheThrLeuGlyValAsnArgVal0171]3853903954000172]AlaArgAlaThrValLeuArgGlyTrpGluAla0173]405410
權(quán)利要求
1.一種茶樹(shù)谷氨酸脫氫酶基因Cs⑶H，其特征在于，含有所述Cs⑶H基因的CDNA全長(zhǎng) 1667bp，其包括長(zhǎng)度為1236bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)以及17!3bp的5'端非翻譯區(qū)和258bp 的3'端非翻譯區(qū)。
2.一種由權(quán)利要求1所述的茶樹(shù)谷氨酸脫氫酶基因CsGDH編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于， 該蛋白質(zhì)為CsGDH基因編碼的含有411個(gè)氨基酸的多肽。
3.一種含有如權(quán)利要求1所述的茶樹(shù)谷氨酸脫氫酶基因Cs⑶H的重組質(zhì)粒 pMAL-Cs⑶H，其特征在于，由兩種擴(kuò)增引物Cs⑶H-Pl和Cs⑶H-P2經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后， 擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pMAL-p2X分別經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切4小時(shí)候后進(jìn)行連接獲得；所 述PCR方法中設(shè)計(jì)的兩種擴(kuò)增引物Cs⑶H-P1和Cs⑶H-P2的基因型分別為Cs⑶H-P1 5' -AAT ATC GCG GAT CCA TGA ACG CTC TCG CCG CCA CAAACC-3‘禾口 CsGDH_P2 5' -ATA AGA ATA AGC TTC GCT TCC CAACCC CTT AAT ACA GTT-3‘；所述PCR方法反應(yīng)條件為95°C， 預(yù)變性 3min ；95°C，30s，55°C，30s，72°C，Imin 30s，反應(yīng) 35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
4.一種含有如權(quán)利要求2所述的茶樹(shù)谷氨酸脫氫酶Cs⑶H的重組蛋白MBP-Cs⑶H，其 特征在于，該重組蛋白是將PMAL-Cs⑶H重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì) 胞，經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)并通過(guò)超聲波破碎的方法獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種茶樹(shù)谷氨酸脫氫酶基因CsGDH。所述茶樹(shù)谷氨酸脫氫酶基因CsGDH含有所述CsGDH基因的cDNA全長(zhǎng)1667bp，其包括長(zhǎng)度為1236bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)以及173bp的5′端非翻譯區(qū)和258bp的3′端非翻譯區(qū)。將本發(fā)明茶樹(shù)谷氨酸脫氫酶基因CsGDH與表達(dá)載體pMAL-p2X連接，轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了可溶性融合蛋白MBP-CsGDH。本發(fā)明茶樹(shù)谷氨酸脫氫酶基因CsGDH在轉(zhuǎn)基因植物中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，可用于茶樹(shù)的基因改良，通過(guò)轉(zhuǎn)入CsGDH基因，可調(diào)節(jié)茶樹(shù)體內(nèi)的氮素代謝，提高茶葉中的氨基酸，特別是谷氨酸的含量。
文檔編號(hào)C12N15/53GK102121019SQ20101004652
公開(kāi)日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日
發(fā)明者宋平, 朱國(guó)萍, 王寶娟, 王暉, 王鵬, 葛亞?wèn)| 申請(qǐng)人:安徽師范大學(xué)