專利名稱：谷氨酸脫氫酶的一種提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及以動(dòng)物肝臟為原料提取谷氨酸脫氫酶的一種方法。
背景技術(shù)：
谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase)是一種催化使氨還原性地固定到 α-酮戊二酸上形成谷氨酸反應(yīng)的酶。它廣泛分布于細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物組織中，其中動(dòng)物肝臟內(nèi)含量最高，該酶在氮素代謝中起著中心作用，對(duì)細(xì)胞內(nèi)氨的固定或氫的轉(zhuǎn)運(yùn)起著重要的生物學(xué)作用，催化反應(yīng)如下所示，可將氨固定形成谷氨酸，氨基被用于許多其他氨基酸的合成中。目前，谷氨酸脫氫酶已應(yīng)用到醫(yī)療診斷中，此外，谷氨酸脫氫酶是制備尿素氮試劑盒(速率法)的必需酶之一。
權(quán)利要求
1.谷氨酸脫氫酶的一種提取方法，其特征在于以動(dòng)物肝臟為原料提取獲得谷氨酸脫氫酶粗酶液，依次經(jīng)酸沉淀、硫酸銨鹽析、磷酸鈣凝膠吸附、透析、柱層析及冷凍干燥后獲得谷氨酸脫氫酶成品。
2.如權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫氫酶的一種提取方法，其特征在于動(dòng)物肝臟包括豬、牛、羊、雞等畜禽。
3.如權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫氫酶的一種提取方法，其特征在于粗酶制備工藝為 稱取定量動(dòng)物新鮮肝臟，在高速組織搗碎機(jī)中搗碎10分鐘QOOOrmp)，加入0. 05M, pH 7. 6 磷酸鹽緩沖液(內(nèi)含0. 15M NaCl)，充分?jǐn)嚢?，?°C冰箱中過夜抽提，SOOOrmp離心20分鐘，收集上清液獲得粗酶液，其中加入的磷酸緩沖液體積為動(dòng)物肝臟的3 5倍。
4.如權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫氫酶的一種提取方法，其特征在于酸沉淀工藝為谷氨酸脫氫酶粗酶液用10%酸溶液調(diào)節(jié)pH，4°C放置1小時(shí)(期間緩慢攪拌數(shù)次)，8000rmp離心15分鐘，沉淀用0. IM pH值7. 6磷酸緩沖液溶解，其中10%的酸溶液可以為甲酸、乙酸、 鹽酸，PH值調(diào)節(jié)為4. 5 4. 8。
5.如權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫氫酶的一種提取方法，其特征在于硫酸銨鹽析工藝為第一次鹽析在室溫下將酸沉淀定量樣品慢慢加入固體(NH4)2SO4到飽和度，4°C 過夜，8000rmp離心10分鐘。第二次鹽析取(NH4)2SO4鹽析后的上清液定量，加固體(NH4)2SO4到48%飽和度， 4°C過夜，離心，沉淀溶解在pH 7.6的磷酸緩沖液中。第三次鹽析在48%硫酸銨飽和度鹽析沉淀溶解液中加(NH4) #04至49%飽和度，沉淀溶解在PH 7. 6磷酸鹽緩沖液中。
6.如權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫氫酶的一種提取方法，其特征在于磷酸鈣凝膠吸附工藝為取定量49 %硫酸銨鹽析沉淀溶解液按比例加Qi3 (PO4) 2凝膠，充分?jǐn)嚢瑁?°C冰箱過夜，得上清液，其中硫酸銨鹽析液同磷酸鈣凝膠的比例為1 0.25 1 0.5(v/w)。1
7.如權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫氫酶的一種提取方法，其特征在于柱層析工藝為 磷酸鈣凝膠吸附溶液4°C透析后，濃縮上樣，用磷酸緩沖液(0.05mol/L，pH 7.6)進(jìn)行洗脫， 流速18mL/h，每管收集3mL ；測定谷氨酸脫氫酶活性，收集活性較高的各管酶液，濃縮后冷凍干燥，制備獲得谷氨酸脫氫酶產(chǎn)品，其中柱層析選用柱料為kphadex G-150或kphadex G-250
8.如權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫氫酶的一種提取方法，其特征在于制備獲得的谷氨酸脫氫酶產(chǎn)品的比酶活高于7900U/mg，酶活回收率高于17%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種谷氨酸脫氫酶的提取方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法的主要步驟為動(dòng)物肝臟原料預(yù)處理、粗酶制備、酸沉淀、硫酸銨鹽析、磷酸鈣凝膠吸附、透析、柱層析、冷凍干燥獲得谷氨酸脫氫酶成品。本發(fā)明工藝成熟，操作簡單、安全，成本低，提取率高，產(chǎn)品回收率可達(dá)到17％以上，產(chǎn)品活性高，比酶活可達(dá)到7900U/mg以上，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)資源的高效利用，減少廢液排放，有效降低環(huán)境污染，適合于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/06GK102409030SQ20111042283
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者高聚霞 申請(qǐng)人:西藏金稞集團(tuán)有限責(zé)任公司