應(yīng)用于組織樣本中組蛋白修飾染色體免疫共沉淀方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域,尤其是涉及一種應(yīng)用于組織樣本中組蛋白修飾染色體免疫共沉淀方法。
【背景技術(shù)】
[0002]組蛋白修飾是調(diào)控基因表達(dá)的重要表觀遺傳學(xué)機(jī)制,在保持細(xì)胞的全能性以及癌癥的病理過程中起到了重要的作用。組蛋白修飾染色體免疫共沉淀(Ch1matinImmunoprecipitat1n, ChIP)方法是研宄體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具,通常用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或組蛋白特異性修飾位點(diǎn)的研宄。將ChIP與第二代測序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù),能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段。目前該方法普遍適用細(xì)胞樣本,而在臨床組織樣本應(yīng)用中尚未穩(wěn)定,且沒有達(dá)到廣泛應(yīng)用的目的,導(dǎo)致無法針對國內(nèi)重要疾病(肺癌、胃癌、肝癌等)進(jìn)行研宄。
[0003]目前ChIP-Seq技術(shù)中對染色體預(yù)處理方法均采用交聯(lián)方法ChIP (Cross-1 inkedChIP,以下簡稱XChIP),即用甲醛對DNA-蛋白質(zhì)進(jìn)行可逆的交聯(lián)反應(yīng),用超聲波處理(sonicat1n)將染色體片段化。但是,XChIP的效果受到交聯(lián)時(shí)間、甲醛濃度、超聲波處理時(shí)間和強(qiáng)度等諸多因素影響,交聯(lián)一超聲波一解交聯(lián)三個(gè)步驟的實(shí)驗(yàn)條件需要協(xié)同探討。由于組織樣本與細(xì)胞樣本存在著很大的區(qū)別,在前期處理組織樣本上,需要進(jìn)行條件優(yōu)化,分離出細(xì)胞個(gè)體,達(dá)到抗體結(jié)合的最佳效率。另外由于組織的特異性,交聯(lián)效率和過程可能造成一些抗原決定簇被封閉掉,使得原本特異性很好的抗體在交聯(lián)處理后特異性降低,假陽性升高。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種應(yīng)用于組織樣本中組蛋白修飾染色體免疫共沉淀方法。
[0005]本發(fā)明的方法是采取用組織樣本個(gè)體細(xì)胞的分離、微球菌核酸酶(MicrococcalNuclease,以下簡稱MNase)與超聲等各環(huán)節(jié)優(yōu)化技術(shù)相結(jié)合,來切割自然狀態(tài)下的染色體ChIP (簡稱NXChIP)。ChIP前期時(shí),優(yōu)化對組織樣本的無損傷式細(xì)胞個(gè)體分離,NXChIP采取酶切技術(shù)處理,從而減少ChIP的損失率;同時(shí)鑒于組蛋白H3和H4跟DNA結(jié)合非常緊密,因此在本方法中不進(jìn)行甲醛的前期固定。另外,用Mnase酶切割核小體之間的Iingker區(qū),即可獲得單個(gè)的核小體。因此,該技術(shù)也很適合適合單個(gè)核小體(即核小體分辨率,Nucleosoome resolut1n)的研宄。同時(shí)也因?yàn)镸nase的這一特性使NChIP不適合用于非組蛋白的研宄,這時(shí)就需要用NXChIP來解決。
[0006]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0007]一種應(yīng)用于組織樣本中組蛋白修飾染色體免疫共沉淀方法,包括以下步驟:
[0008](I)組織樣本前處理:
[0009]取組織樣本切割成l-3mm3塊狀,加預(yù)冷的含有蛋白抑制劑的PBS洗滌劑(含I X蛋白抑制劑protein inhibitor,即稀釋至一倍)洗滌3次;所述的蛋白抑制劑具體由AEBSF> EDTA、Leupeptin 及 Pepstatin A 組成。
[0010](2)組織單細(xì)胞分離:
[0011]用組織研磨器,在冰浴中研磨后,用無菌紗布過濾,收集濾液,在顯微鏡下觀察,對活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),收集活細(xì)胞(lOOOrpm, 1min);
[0012](3)細(xì)胞裂解與酶消化:
[0013]收集步驟⑵濾液中的細(xì)胞,懸浮在酶切消化緩沖液(含有50mM Tris-HClUmMCaCl2、0.2v/v% Triton X-100 或 NP-40,pH 為 7.6)中,37°C水浴 2 分鐘;
[0014](4)微球菌核酸酶酶切反應(yīng):
[0015]將加入酶切消化緩沖液的細(xì)胞,加入酶活力為0.1-0.8U的微球菌核酸酶,37°C酶切5分鐘后,加入與微球菌核酸酶等量的酶切終止液(含有1mM Tris與5mM EDTA, pH為7.6);
[0016](5)超聲破碎:
[0017]在冰浴下,使用B1ruptor超聲儀,對步驟(4)所得液進(jìn)行9000g高頻超聲5分鐘,然后4°C離心5分鐘,得到破碎的染色質(zhì)溶液;
[0018](6)抗體結(jié)合:
[0019]取Protein A/G,用500ml含5mg/ml牛血清白蛋白的PBS緩沖液洗滌三次后,加入250ul含5mg/ml牛血清白蛋白的PBS緩沖液,再加2_5ug抗體,4°C孵育2_4小時(shí)后,加入破碎的染色質(zhì)溶液,4°C過夜孵育;
[0020](7) ChIP 后的 DNA 提取:
[0021]孵育過后的溶液,在磁力架上用高鹽溶液多次洗滌,洗滌后用TE溶液(含有1mMTris與5mM EDTA, pH為7.6)洗脫磁力珠上的DNA,用純化液(體積比25:24:1的酚、氯仿與異戊醇的混合液)純化提取DNA,用超純水溶解DNA。
[0022](8)方法有效性評估:
[0023]用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢驗(yàn)ChIP的富集程度。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明采用組織樣本前期處理與細(xì)胞分離,能夠有效的提高抗體的沉淀效率;其次,采用酶切和超聲相結(jié)合的方法,不僅能夠有效的獲取染色質(zhì)片段,而且能夠得到染色質(zhì)上核小體,能夠在高通量水平上精準(zhǔn)定位組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn),提尚了臨床樣本的檢測效果。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0026]實(shí)施例1
[0027]采取臨床肺腺癌組織樣本。具體方法如下:
[0028]在無菌條件下,采集約30-50mg肺腺癌組織,將組織切割成l_3mm3塊狀。加預(yù)冷的Iml PBS(含IX蛋白抑制劑protein inhibitor)洗滌3次;用組織研磨器,在冰浴中研磨后,用無菌紗布過濾,收集濾液,在顯微鏡下觀察,對活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),收集1M(百萬)的活細(xì)胞(lOOOrpm, 1min)。收集細(xì)胞,懸浮在300ul酶切消化緩沖液(50mM Tris-HCl, pH7.6 ;ImM CaCl2;0.2% Triton X-100 (or NP-40))中,37 度水浴 2 分鐘。加入 0.4U 的 MNase 酶,37 度酶切 5 分鐘后,加入 300ul 酶切終止液(1mM Tris, pH7.6,5mM EDTA)。用 B1ruptor超聲儀高頻、冰浴超聲5分鐘,9000g,4度離心5分鐘,取出10ul溶液作為input。取1ulProtein A/G,加 500ml PBS (5mg/ml BSA)洗滌三次,加 250ul PBS (含有 5mg/ml BSA),再加2-5ug抗體,4度孵育2-4小時(shí)后,加入破碎的染色質(zhì)溶液,4度過夜孵育。孵育過