一種無(wú)血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無(wú)血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液。
【背景技術(shù)】
[0002]因創(chuàng)傷或骨病導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨缺損在臨床十分常見。由于軟骨無(wú)血供及神經(jīng)，軟骨細(xì)胞含量較低且為終末分化細(xì)胞，因此，軟骨再生能力十分有限。經(jīng)過十多年的臨床應(yīng)用及技術(shù)發(fā)展，自體軟骨細(xì)胞移植(AutologousChondrocytelmplantat1n, ACI)技術(shù)已成為臨床治療軟骨損傷最有效的方法，短、中、長(zhǎng)期隨訪結(jié)果療效優(yōu)良率在75、5%。但因軟骨細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力有限，如何獲得足夠的并保持細(xì)胞表型的種子細(xì)胞(即軟骨細(xì)胞)已成為制約該技術(shù)臨床應(yīng)用的瓶頸。
[0003]大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都不同程度地依賴血清才能在體外生長(zhǎng)增殖。常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)，是在含有10%血清的DMEM或者DF12培養(yǎng)液條件下進(jìn)行的，軟骨細(xì)胞也是如此。血清除了供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)成分，還能促使細(xì)胞合成DNA。而血清的使用也會(huì)帶來以下諸多風(fēng)險(xiǎn)，例如血清成分復(fù)雜，在對(duì)細(xì)胞產(chǎn)物進(jìn)行分析或者提純時(shí)會(huì)受到血清成分的干擾；不同批次血清的質(zhì)量難以保持一致，當(dāng)實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)、使用血清量較多時(shí)很難保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精度和可靠性必然產(chǎn)生一定影響；血清中還含有一定量的細(xì)胞毒性物質(zhì)和抑制物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞有去分化作用，影響某些細(xì)胞功能的表達(dá)等。
[0004]在有血清的培養(yǎng)條件下，隨著傳代次數(shù)和數(shù)量的增大，軟骨細(xì)胞很容易去分化產(chǎn)生成纖維細(xì)胞狀態(tài)，無(wú)法分泌軟骨細(xì)胞及軟骨組織特異性膠原蛋白及蛋白聚糖，失去正常細(xì)胞表型，形成的“軟骨組織”不能正常發(fā)揮生物活性，嚴(yán)重影響臨床治療效果。
[0005]研究結(jié)果表明，無(wú)血清培養(yǎng)液能夠更好的維持細(xì)胞表型及其功能的發(fā)揮，在延緩細(xì)胞老化等諸多方面均優(yōu)于有血清培養(yǎng)液。目前已有的無(wú)血清培養(yǎng)液主要用于培養(yǎng)以下幾種細(xì)胞:中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。無(wú)血清培養(yǎng)液特異性很強(qiáng)，沒有廣泛的適應(yīng)性。盡管國(guó)內(nèi)外關(guān)于軟骨細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)的文獻(xiàn)及專利報(bào)道較多，但由于可用于自體軟骨細(xì)胞移植的起始軟骨組織十分有限，并且在軟骨細(xì)胞培養(yǎng)過程中，數(shù)量較少情況下易出現(xiàn)成活困難、去分化及易老化等現(xiàn)象，增加了軟骨細(xì)胞培養(yǎng)特別是在無(wú)血清培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)的難度。
[0006]中國(guó)專利200780027449.5公開的用于培養(yǎng)成纖維細(xì)胞、特別是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)液，添加了一種或者多種IL-6家族細(xì)胞因子，而文獻(xiàn)報(bào)道該家族細(xì)胞因子對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝具有干預(yù)作用，主要表現(xiàn)為抑制透明軟骨特征性I1、IV型膠原的合成，而促進(jìn)1、111型膠原的合成使軟骨細(xì)胞變性，抑制軟骨細(xì)胞增殖和蛋白多糖的合成。同時(shí)，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的降解作用主要表現(xiàn)在促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成和分泌金屬蛋白酶，并提高軟骨基質(zhì)中溶解蛋白分子酶類的活性。
[0007]中國(guó)專利200580037602.3,200710096843.6,200510030198.9,200910265976.0、200610024459.0公開的可用于細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)液，在制備過程中部分添加了植物蛋白，這些成分尚無(wú)符合細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的，增加了制備難度；同時(shí)，發(fā)明未針對(duì)特異性細(xì)胞，其對(duì)軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)效果未見報(bào)道，而研究結(jié)果表明，使用確定的無(wú)血清培養(yǎng)液對(duì)于軟骨細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)擴(kuò)增及其基質(zhì)分泌特別有利，能夠維持該細(xì)胞表型。
[0008]中國(guó)專利201310003115.1發(fā)明的用于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)液，是針對(duì)成纖維細(xì)胞的特異性培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液未針對(duì)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)，調(diào)整細(xì)胞因子添加量，會(huì)造成軟骨細(xì)胞去分化速率加快，軟骨細(xì)胞表型無(wú)法維持。
[0009]其他用于細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)液也存在諸如以下問題:添加血清白蛋白及多種貼壁因子等，導(dǎo)致培養(yǎng)液成本升高。另外，由于臨床及臨床前研究過程中，可獲得的軟骨組織量有限。而臨床對(duì)軟骨細(xì)胞種子細(xì)胞量要求較大，在軟骨細(xì)胞培養(yǎng)前期，采用低密度單層培養(yǎng)，前3代細(xì)胞增殖迅速，但很快去分化，傳代之后增殖緩慢，細(xì)胞表型大部丟失，無(wú)法維持正常軟骨細(xì)胞表型，因此對(duì)軟骨細(xì)胞正常功能的發(fā)揮及其在臨床應(yīng)用造成較大困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種針對(duì)低密度軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)液，其中不添加白蛋白，能避免使用血清造成的潛在隱患，同時(shí)，能夠延緩軟骨細(xì)胞的去分化速率，提高軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力，達(dá)到人軟骨細(xì)胞增殖速率，接近在含血清培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)增殖狀態(tài)。
[0011]本發(fā)明所提出的無(wú)血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，是在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加外源添加物，其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)液是指DMEM培養(yǎng)液或F12培養(yǎng)液或DMEM培養(yǎng)液與F12培養(yǎng)液的混合培養(yǎng)液(V: V=1:1);外源添加物為:葡聚糖為5?20g/L，脂類濃縮劑為0.f lmL/L，丙酮酸鈉為5(Tl00mg/L，三碘甲狀腺氨酸(T3)為0.01?2μΜ，氫化可的松為0.05?5mg/L，地塞米松為0.1?10 μ g/L,亞硒酸鈉為I?5 μ g/L, β -巰基乙醇為25?50 μ Μ,維生素C (Vc)為10?100mg/L,谷氨酰胺為50?500 μ g/mL,轉(zhuǎn)鐵蛋白為I?20 mg/L,胰島素或胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)為5?100 μ g/L，生長(zhǎng)激素(GH)為10?200 μ g/L、孕酮為5?20nM，丁二胺為2(Γ?00μΜ，非必需氨基酸為1%，細(xì)胞生長(zhǎng)因子添加成分為:堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)為5?50 μ g/L,表皮生長(zhǎng)因子(EGF)為0.5?25 μ g/L,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF- β )為I?25 μ g/L，骨形成蛋白(BMP)為I?10 μ g/L，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)為I?20 μ g/L。
[0012]為了提高低密度條件下軟骨細(xì)胞體外擴(kuò)增能力、維持軟骨細(xì)胞表型及其細(xì)胞外基質(zhì)分泌能力，細(xì)胞生長(zhǎng)因子添加成分可優(yōu)選為:堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF-2)為10?25 μ g/L，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)為10?20 μ g/L，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β )為5?15μ g/L，骨形成蛋白(BMP)為5?10 μ g/L，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)為5?10 μ g/L。
[0013]軟骨形成是極其復(fù)雜的過程，生長(zhǎng)因子作為信號(hào)物質(zhì)參與軟骨形成的精細(xì)調(diào)節(jié)。目前認(rèn)為，生長(zhǎng)因子不僅指對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育具有促進(jìn)作用的物質(zhì)，同時(shí)也包括對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用的因子，他們共同參與軟骨細(xì)胞的增殖、分化和基質(zhì)代謝活動(dòng)，在軟骨形成過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。TGF-β廣泛存在于各種組織內(nèi)，在骨和軟骨的表達(dá)尤其高，它具有誘導(dǎo)軟骨形成的能力。BMP家族的成員，可以在非骨骼部位誘導(dǎo)軟骨和骨形成。成骨素還能使體外培養(yǎng)中已經(jīng)表現(xiàn)反分化的軟骨細(xì)胞恢復(fù)軟骨表型，重新表達(dá)軟骨細(xì)胞特異性物質(zhì)。EGF、PDGF、bFGF與BMP結(jié)合，可產(chǎn)生協(xié)同作用，加強(qiáng)成骨素對(duì)軟骨細(xì)胞反分化的逆轉(zhuǎn)效果，使已反分化的軟骨細(xì)胞重新表達(dá)II型膠原蛋白。研究表明，IGF、TGF-13、H)GF、bFGF和EGF等能增加人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞DNA合成，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。但是，生長(zhǎng)因子對(duì)于細(xì)胞分裂增殖的影響可以是促進(jìn)作用，也可以是抑制作用。因此，需要根據(jù)軟骨細(xì)胞表型進(jìn)行調(diào)整。
[0014]本發(fā)明所制備的軟骨細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液，能夠維持軟骨細(xì)胞在低密度條件下正常生長(zhǎng)擴(kuò)增能力和軟骨細(xì)胞表型，促進(jìn)細(xì)胞功能的發(fā)揮。該培養(yǎng)體系在軟骨細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)過程中，與在含血清培養(yǎng)液中的培養(yǎng)效果一致；并對(duì)于低密度接種軟骨細(xì)胞的去分化速率控制及基質(zhì)分泌能力的提高，明顯的優(yōu)于有血清培養(yǎng)液。
[0015]本發(fā)明無(wú)血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液的制備方法為:采用超純水配制基礎(chǔ)培養(yǎng)液；在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中先加入葡聚糖攪拌溶解，再分別加入脂類濃縮劑、丙酮酸鈉、T3、氫化可的松、地塞米松、亞硒酸鈉、β -巰基乙醇、V。、谷氨酰胺、bFGF、EGF、TGF-β、PDGF, BMP、轉(zhuǎn)鐵蛋白、IGF、GH、孕酮、丁二胺、非必需氨基酸；調(diào)pH7.2，定容后用濾膜過濾除菌，4°C保存。
[0016]采用本發(fā)明無(wú)血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)原代細(xì)胞按以下操作:將消化后獲得的軟骨細(xì)胞用PBS溶液清洗干凈，離心后用無(wú)血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，按0.5 X 14?5 X 14個(gè)/cm2的細(xì)胞密度接種培養(yǎng)；2)培養(yǎng)2?5天后換液，之后每2?3天換液一次；3)待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至70 %時(shí)，可進(jìn)行傳代。
[0017]采用本發(fā)明培養(yǎng)液進(jìn)行軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)，按以下操作:1)胰酶消化原代軟骨細(xì)胞，將消化后獲得的細(xì)胞用PBS溶液清洗，離心后用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按0.2 X 14?5X 14個(gè)/cm2的細(xì)胞密度接種培養(yǎng)；2)每2?3天換液一次，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至75?85%時(shí)，進(jìn)行傳代。
[0018]本發(fā)明是針對(duì)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的特異性培養(yǎng)液，能夠解決低密度軟骨細(xì)胞難培養(yǎng)、擴(kuò)增效率低、細(xì)胞表型較難維持等問題，其特點(diǎn)如下:①該培養(yǎng)液無(wú)任何動(dòng)物來源蛋白成分及貼壁因子，適用于軟骨細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)，而且原代培養(yǎng)不添加血清，原代細(xì)胞在本發(fā)明培養(yǎng)液中能夠保持較好的細(xì)胞形態(tài)，呈多邊形，輪廓清晰，折光率良好，伸展良好；②能滿足多次傳代需要，培養(yǎng)代數(shù)較長(zhǎng)，本發(fā)明培養(yǎng)液能維持軟骨細(xì)胞從原代傳至51代，且能保持軟骨細(xì)胞形態(tài)特征，細(xì)胞在培養(yǎng)液中伸展良好，呈多邊形；③可滿足軟骨細(xì)胞低密度條件下的培養(yǎng)要求；④軟骨細(xì)胞在該無(wú)血清培養(yǎng)過程中，能夠維持軟骨細(xì)胞特性，保持良好的細(xì)胞外基質(zhì)分泌能力，能夠形成良好的組織工程移植物；⑤可在無(wú)血清培養(yǎng)條件下增強(qiáng)細(xì)胞的附著力及增殖，維持軟骨細(xì)胞表達(dá)軟骨特異性表型的能力，該培養(yǎng)液可以提供一種可用于基礎(chǔ)研究直至用于軟骨損傷患者的細(xì)胞培養(yǎng)體系。
【附圖說明】
[0019]附圖1為采用本發(fā)明無(wú)血清培養(yǎng)液與含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞效果對(duì)比照片，其中A為無(wú)血清培養(yǎng)組(無(wú)血清組)，B為含血清培養(yǎng)組(血清組)；通過觀察兩組細(xì)胞形態(tài)，可知軟骨細(xì)胞在本發(fā)明培養(yǎng)液中也能夠正常的貼壁生長(zhǎng)