一對(duì)特異識(shí)別IκBα基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一對(duì)特異識(shí)別IkBa基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]目前，人類同種器官移植面臨供體器官稀缺的情況，而異種器官移植被認(rèn)為是解決問題的有效途徑。豬在解剖學(xué)、生理學(xué)和生化指標(biāo)等方面與人極其相似，是人類異種移植供體來源的理想動(dòng)物。異種器官移植通常會(huì)帶來嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)，通過對(duì)豬基因進(jìn)行修飾與改造，可以有效地減輕異種器官移植引起的免疫排斥反應(yīng)。免疫排斥反應(yīng)分為兩種，一種是超急性免疫排斥反應(yīng)，另一種是延緩性免疫排斥反應(yīng)。核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB(Nuclearfactor-kappaB)在延緩性排斥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。IkBa(InhibitorkappaBalpha)，即核轉(zhuǎn)錄因子I-kB抑制因子a，是NF-kB的重要抑制因子。然而，IkBa可在炎性介質(zhì)的刺激下被磷酸化而降解，從而導(dǎo)致NF-kB的激活。有報(bào)道稱IkBa的突變體可有效抵抗磷酸化。所以對(duì)豬IkBa基因進(jìn)行改造對(duì)研究延緩性排斥反應(yīng)有著一定的意義。[0003]尋找一種能靶向切割豬IkBa基因的技術(shù)相當(dāng)重要。傳統(tǒng)的打靶技術(shù)效率非常的低，其主要是依賴細(xì)胞內(nèi)部的同源重組隨機(jī)交換完成的，效率非常低。[0004]近年來發(fā)展的主要方法為依托序列特異的核酸酶進(jìn)行基因的精確修飾。序列特異的核酸酶主要由一個(gè)DNA識(shí)別域與一個(gè)能非特異性切割DNA的內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域連接而成。其主要原理為先由DNA識(shí)別域識(shí)別并結(jié)合到需要改造的DNA片段上，然后由與DNA相連的非特異性內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域?qū)NA進(jìn)行切割，造成DNA的雙鏈斷裂（Double-strandbreak，DSB)，DSB會(huì)激活DNA的自我修復(fù)而引起基因的突變從而促進(jìn)該位點(diǎn)的同源重組。[0005]鋅指核酸酶技術(shù)（ZincFingerNuclease,ZFN)就是前一段所述的基因精確修飾技術(shù)，由一個(gè)特異性的DNA識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成。在ZFN識(shí)別結(jié)構(gòu)域中，一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)可以特異識(shí)別多個(gè)（通常是3個(gè)）連續(xù)的堿基，多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)能夠識(shí)別一連串的堿基。所以，在ZFN的設(shè)計(jì)過程中，鋅指識(shí)別結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是重點(diǎn)，特別是設(shè)計(jì)如何將多個(gè)賴氨酸2-組氨酸2(Cys2-His2)鋅指蛋白串聯(lián)，以及如何通過改變a螺旋的16氨基酸殘基決定每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別的特定三聯(lián)體堿基。[0006]ZFN技術(shù)在基因靶向修飾方面的可行性使得其廣泛應(yīng)用于個(gè)體水平和細(xì)胞水平的基因修飾。首先人們通過利用ZFN技術(shù)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞水平的基因定向修飾。如Sangamo公司于2005年首次在人類培養(yǎng)細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)ZFN介導(dǎo)的基因打靶，2007年應(yīng)用同樣的ZFN通過同源重組基因?qū)崿F(xiàn)了基因定點(diǎn)插入。最近，人們利用ZFN分別在人的iPS和ES細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因的靶向突變。[0007]相比之下，轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALEN)有更多優(yōu)勢(shì)，它是繼鋅指核酸酶技術(shù)以來的另一種能夠?qū)蚪M進(jìn)行高效定點(diǎn)修飾的新技術(shù)。轉(zhuǎn)錄因子激活效應(yīng)物家族中有一種蛋白（TALEs)能夠識(shí)另ij、結(jié)合DNA。TALE與DNA序列特異性結(jié)合主要是由TAL結(jié)構(gòu)內(nèi)34個(gè)恒定氨基酸序列介導(dǎo)。將TALEs與FokI核酸內(nèi)切酶的切割域相連接，形成TALEN，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組DNA雙鏈在特定位點(diǎn)進(jìn)行修飾。[0008]在TALE的中央存在著一個(gè)重復(fù)區(qū)域，這個(gè)區(qū)域通常是由33-35個(gè)氨基酸的數(shù)量可變的重復(fù)單元構(gòu)成。重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（RepeatDomain)負(fù)責(zé)識(shí)別特異性的DNA序列。每個(gè)重復(fù)序列基本上都是一樣的，除了兩個(gè)可變的氨基酸，即重復(fù)序列可變的雙氨基酸殘基(Repeat-VariableDiresidues,RVD)。TALE識(shí)別DNA的機(jī)制在于一個(gè)重復(fù)序列上的RVD能夠識(shí)別DNA靶點(diǎn)上的一個(gè)核苷酸，再融合FokI核酸內(nèi)切酶，組合成TALEN。TALEN是一種異源二聚體分子（兩單位的TALEDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合到一單位的催化性結(jié)構(gòu)域），能夠切割兩個(gè)相隔較近的序列，從而使得特異性增強(qiáng)。該酶的效率高，毒性小，制備周期短，成本低等優(yōu)勢(shì)越來越明顯。【
發(fā)明內(nèi)容】[0009]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一對(duì)能夠特異識(shí)別IkBa基因的多肽。[0010]為實(shí)現(xiàn)上述目的，依托TALEN載體系統(tǒng)構(gòu)建識(shí)別IKBa基因的多肽，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：[0011]本發(fā)明提供了一對(duì)特異識(shí)別IkBa基因的多肽對(duì)，該多肽對(duì)由多肽甲和多肽乙組成；所述多肽甲由18個(gè)TAL核酸識(shí)別單元組成，每個(gè)TAL核酸識(shí)別單元中具有兩個(gè)雙連氨基酸；所述多肽乙由18個(gè)TAL核酸識(shí)別單元組成，每個(gè)TAL核酸識(shí)別單元中具有兩個(gè)雙連氨基酸；[0012]所述多肽甲中的18個(gè)雙連氨基酸依次如下：序列表的序列3自N末端第12-13位氨基酸殘基、第46-47位氨基酸殘基、第80-81位氨基酸殘基、第114-115位氨基酸殘基、第148-149位氨基酸殘基、第182-183位氨基酸殘基、第216-217位氨基酸殘基、第250-251位氨基酸殘基、第284-285位氨基酸殘基、第318-319位氨基酸殘基、第352-353位氨基酸殘基、第386-387位氨基酸殘基、第420-421位氨基酸殘基、第454-455位氨基酸殘基、第488-489位氨基酸殘基、第522-523位氨基酸殘基、第556-557位氨基酸殘基和第590-591位氣基酸殘基；[0013]所述多肽乙中的18個(gè)雙連氨基酸依次如下：序列表的序列3自N末端第12-13位氨基酸殘基、第46-47位氨基酸殘基、第80-81位氨基酸殘基、第114-115位氨基酸殘基、第148-149位氨基酸殘基、第182-183位氨基酸殘基、第216-217位氨基酸殘基、第250-251位氨基酸殘基、第284-285位氨基酸殘基、第318-319位氨基酸殘基、第352-353位氨基酸殘基、第386-387位氨基酸殘基、第420-421位氨基酸殘基、第454-455位氨基酸殘基、第488-489位氨基酸殘基、第522-523位氨基酸殘基、第556-557位氨基酸殘基和第590-591位氨基酸殘基。[0014]上述多肽甲如序列表的序列2所示；所述多肽乙如序列表的序列4所示。[0015]本發(fā)明還提供了編碼上述多肽對(duì)的DNA分子。[0016]上述DNA分子由編碼多膚甲的DNA分子甲和編碼多膚乙的DNA分子乙組成。[0017]上述DNA分子甲中，編碼所述多肽甲的18個(gè)雙連氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的序列2自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷酸、第1564-1569位核苷酸、第1666-1671位核苷酸和第1768-1773位核苷酸；[0018]上述DNA分子乙中，編碼所述多肽乙的18個(gè)雙連氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的序列2自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷酸、第1564-1569位核苷酸、第1666-1671位核苷酸和第1768-1773位核苷酸。[0019]其中，上述DNA分子甲如序列表的序列1所示；上述DNA分子乙如序列表的序列3所示。[0020]本發(fā)明還提供了一對(duì)質(zhì)粒，由質(zhì)粒甲和質(zhì)粒乙組成；所述質(zhì)粒甲為含有DNA分子甲的質(zhì)粒；所述質(zhì)粒乙為含有DNA分子乙的質(zhì)粒。[0021]本發(fā)明還提供了上述多肽對(duì)在特異識(shí)別IkBa基因中的應(yīng)用，所述IkBa基因可為豬的IkBa基因。[0022]本發(fā)明還提供了上述質(zhì)粒對(duì)在特異切割I(lǐng)kBa基因中的應(yīng)用。[0023]本發(fā)明還提供了上述質(zhì)粒對(duì)在構(gòu)建IkBa基因突變庫中的應(yīng)用。[0024]本發(fā)明提供了特異識(shí)別IkBa基因的多肽對(duì)，并提供了該多肽對(duì)的編碼基因。本發(fā)明同時(shí)提供了用于基因工程的質(zhì)粒對(duì)，將所述質(zhì)粒對(duì)導(dǎo)入含有目的基因的細(xì)胞，可以使細(xì)胞中的目的基因被特異切割，在細(xì)胞自身修復(fù)系統(tǒng)的作用下，可以得到目的基因的突變庫。本發(fā)明提供的多肽對(duì)可以特異識(shí)別IkBa基因，通過在豬上對(duì)IkBa基因進(jìn)行敲除或改造研究豬的延緩性排斥反應(yīng)有著重要的意義?！靖綀D說明】[0025]圖1是pTALE-A質(zhì)粒、pTALE-G質(zhì)粒、pTALE-C質(zhì)粒和pTALE-T質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；[0026]圖2是pTALE-A質(zhì)粒、pTALE-G質(zhì)粒、pTALE-C質(zhì)粒和pTALE-T質(zhì)粒的工作原理示意圖；[0027]圖3(A)是重組質(zhì)粒TALE-1L的構(gòu)建過程圖，圖3(B)是重組質(zhì)粒TALE-1R的構(gòu)建過程圖；[0028]圖4是重組質(zhì)粒TALEN-1L和重組質(zhì)粒TALEN-1R的酶切電泳圖；以及[0029]圖5是重組質(zhì)粒pSSA-IkBa的工作原理示意圖。【具體實(shí)施方式】[0030]以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明的范疇。[0031]pSSA載體（文獻(xiàn)中的名稱為"SSAreporterplasmid"）：參考文獻(xiàn)：HeritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedTALENs.HuangP,XiaoA,ZhouM,ZhuZ，LinS，ZhangB.NatBiotechnol.2011Aug5;29(8):699_700.doi:10.1038/nbt.1939.。[0032]Renillaluciferase質(zhì)粒（文獻(xiàn)中的名稱為"Renillaplasmid"）：參考文獻(xiàn)：HeritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedTALENs.HuangP,XiaoA,ZhouM,ZhuZ,LinS,ZhangB.NatBiotechnol.2011Aug5；29(8):699-700.doi:10.1038/nbt.1939.。[0033]實(shí)施例1TALEN的構(gòu)建[0034]一、四種模塊以及將模塊進(jìn)行組合的機(jī)理描述[0035]TAL的核酸識(shí)別單元為間隔34個(gè)氨基酸序列的雙連氨基酸。雙連氨基酸與A、G、C、T有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即NI識(shí)別A、NG識(shí)別T、HD識(shí)別C、NN識(shí)別G。pTALE-A質(zhì)粒、pTALE-G質(zhì)粒、pTALE-C質(zhì)粒和pTALE-T質(zhì)粒為單模塊載體，為分別具有上述四種TAL的核酸識(shí)別單元的編碼DNA的質(zhì)粒，且在編碼DNA的5'末端具有SpeI酶切識(shí)別序列、3'末端具有連續(xù)的NheI酶切識(shí)別序列和HindIII識(shí)別序列。通過單模塊載體上的SpeI、NheI和HindIII酶切位點(diǎn)按照靶點(diǎn)序列當(dāng)前第1頁1 2