抗人cd83單克隆抗體及其制備、鑒定和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及單克隆抗體技術領域，尤其涉及抗人CD83單克隆抗體，具體地說，針 對人CD83胞外段的第20至145位氨基酸序列有反應性的單克隆抗體。本發(fā)明還涉及產生 該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本發(fā)明還涉及該單克隆抗體的制備方法及鑒定方法。本發(fā) 明還涉及該單克隆抗體的應用及其試劑盒。
【背景技術】
[0002] ⑶83是一種分子量為45kDa的表面糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族。⑶83存在兩 種分子形式，膜結合的（membrane0)83，mCD83)和可溶性的（soluble0)83，sQ)83)，兩者 具有不同的生物學功能。sCD83僅包含mCD83的胞外區(qū)段，具有免疫抑制功能。大量體外實 驗證實從細胞表面脫落或體外重組的sCD83對DC介導的T細胞增殖具有明顯的免疫抑制 作用，動物體內實驗也發(fā)現重組s⑶83蛋白對小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE)以及 同種異型皮膚移植急性排斥反應具有很好的預防或治療作用。這些結果提示，重組s⑶83 很可能在器官移植手術中發(fā)揮重要的抗免疫排斥的作用。此外，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤和風 濕性關節(jié)炎患者中，發(fā)現了高水平的sCD83。然而，sCD83釋放背后的機制仍然未被闡明。
[0003] 為了更加詳盡的研究mCD83和SCD83的功能，開發(fā)出準確快速檢測血液或組織局 部mCD83和s⑶83的蛋白表達的工具以及進一步開發(fā)以⑶83為靶點的生物治療具有重要 的臨床意義。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供抗人CD83單克隆抗體，具體地說，針對人CD83胞外段的 第20至145位氨基酸序列有反應性的單克隆抗體。
[0005] 本發(fā)明的再一個目的是提供產生上述抗人CD83單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0006] 本發(fā)明的又一個目的是提供上述抗人⑶83單克隆抗體的制備方法及鑒定方法。
[0007] 本發(fā)明的又一個目的是提供上述抗人CD83單克隆抗體在免疫印跡、免疫沉淀、免 疫組化、ELISA或流式細胞術的試驗中檢測CD83的應用。
[0008] 為此，本發(fā)明利用畢赤酵母表達CD83胞外段重組蛋白免疫8-10周齡的BALB/c雌 性小鼠后，取小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤SP2/0細胞在聚乙二醇作用下進行體外融合，通過 有限稀釋法和間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA)篩選陽性雜交瘤細胞株。常規(guī)制備腹水，用 MabSelect親和層析純化抗體。并且對抗人CD83單克隆抗體進行效價測定、親和常數的測 定、Ig亞類的測定和特異性的鑒定。抗人CD83單克隆抗體的制備，為CD83分子的檢測以 及CD83功能的研究提供了基礎，抗人CD83單克隆抗體可以廣泛用于分子免疫學的研究中。
[0009] 本發(fā)明為了解決上述技術問題，提供以下各項：
[0010] 本發(fā)明提供了抗人⑶83單克隆抗體，其針對人⑶83胞外段的第20至145位氨基 酸序列有反應性。
[0011] 具體地，抗人⑶83單克隆抗體為IgGl，K亞類。
[0012] 具體地，抗人⑶83單克隆抗體是由保藏號為CCTCCNO:C2014186的雜交瘤細胞株 IHlO分泌產生的單克隆抗體⑶83-1H10。
[0013] 具體地，抗人⑶83單克隆抗體是由保藏號為CCTCCNO:C2014187的雜交瘤細胞株 11A7分泌產生的單克隆抗體⑶83-11A7。
[0014] 具體地，抗人⑶83單克隆抗體是由保藏號為CCTCCNO:C2014188的雜交瘤細胞株 14E4分泌產生的單克隆抗體⑶83-14E4。
[0015] 本發(fā)明還提供了小鼠雜交瘤細胞株1H10,保藏號為CCTCCNO:C2014186。
[0016] 本發(fā)明又提供了小鼠雜交瘤細胞株11A7,保藏號為CCTCCNO:C2014187。
[0017] 本發(fā)明又提供了小鼠雜交瘤細胞株14E4,保藏號為CCTCCNO:C2014188。
[0018] 本發(fā)明又提供了上述抗人CD83單克隆抗體在檢測CD83中的應用，其中所述檢測 是通過免疫印跡、免疫沉淀、免疫組化、ELISA或流式細胞術來進行的。
[0019] 本發(fā)明又提供了用于檢測⑶83的試劑盒，其包含以上所述的抗人⑶83單克隆抗 體。
[0020] 具體地，上述試劑盒用于檢測免疫細胞上的⑶83或血液樣品中的s⑶83。
[0021] 本發(fā)明又提供了一種檢測細胞上的CD83的方法，該方法包括：（1)將以上所述的 抗人CD83單克隆抗體與待檢測的分離的細胞或該細胞的裂解液進行接觸；和（2)判斷是否 有陽性反應。
[0022] 具體地,上述陽性反應是通過免疫印跡、免疫沉淀、ELISA或流式細胞術檢測進行 判斷的。
[0023] 本發(fā)明又提供了一種檢測液體樣品中的SCD83的方法，該方法包括：（1)將以上所 述的抗人CD83單克隆抗體與待檢測血液樣品進行接觸；和（2)判斷是否有陽性反應。
[0024] 具體地,上述陽性反應是通過免疫印跡、免疫沉淀、ELISA或流式細胞術檢測進行 判斷的。
[0025] 對
【發(fā)明內容】
進行詳述：
[0026] 本發(fā)明的一個方面涉及對人CD83有特異性的單克隆抗體，所述抗人CD83單克隆 抗體針對⑶83 (Genbank登記號CAG33300. 1)第20位至145位氨基酸中的序列有反應性； 優(yōu)選地，所述抗人⑶83單克隆抗體為⑶83-1H10、⑶83-11A7和⑶83-14E4。
[0027] 本發(fā)明的另外一個方面涉及穩(wěn)定分泌抗人CD83單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株 1H10、11A7和14E4,保藏號依次為CCTCCNO:C2014186、CCTCCNO:C2014187和CCTCCNO: C2014188。
[0028] 本發(fā)明的另一個方面涉及所述抗人CD83單克隆抗體的制備方法，利用畢赤酵母 表達的重組CD83蛋白免疫8-10周齡的BALB/c雌性小鼠后，取小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤 SP2/0細胞在聚乙二醇作用下進行體外融合，通過有限稀釋法和間接ELISA法篩選陽性雜 交瘤細胞株。常規(guī)制備腹水，用MabSelect親和層析純化抗體。
[0029] 本發(fā)明的另一個方面涉及所述抗人CD83單克隆抗體的鑒定方法，包括：效價的測 定、親和常數的測定、抗體亞類的測定和特異性的鑒定。
[0030] 本發(fā)明的另一方面涉及抗人⑶83單克隆抗體在免疫印跡檢測⑶83試驗中應用。 用本發(fā)明的抗人CD83單克隆抗體用于免疫印跡試驗檢測CD83,結果顯示，抗人CD83單克隆 抗體能用于免疫印跡試驗中檢測重組CD83蛋白和細胞內源表達CD83蛋白。
[0031] 本發(fā)明的另一方面涉及抗人⑶83單克隆抗體在ELISA檢測⑶83試驗中的應用。 用本發(fā)明的抗人CD83單克隆抗體檢測不同濃度的CD83,結果顯示，抗人CD83單克隆抗體能 用于ELISA檢測⑶83,并可用于檢測腫瘤患者血液樣品的中s⑶83。
[0032] 本發(fā)明的另一方面涉及抗人CD83單克隆抗體在流式細胞術檢測CD83試驗中的應 用。用本發(fā)明的抗人CD83單克隆抗體可以和CD83陽性細胞結合，而不和CD83陰性細胞結 合。表明抗人CD83單克隆抗體能用于流式細胞術檢測細胞表面CD83。
[0033] 本發(fā)明中，術語"單克隆抗體的特異性"是指單克隆抗體識別抗原上的特定表位或 者抗原決定簇并與之結合的性質。
[0034] 術語"單克隆抗體的反應性"是指在合適的反應條件下，單克隆抗體與抗原結合的 能力。
[0035] 術語"細胞株"是指通過篩選或者有限稀釋方法，從原代培養(yǎng)物或者細胞系獲得的 單細胞培養(yǎng)物。
[0036] 本發(fā)明提供了抗人CD83單克隆抗體及其制備、鑒定、應用。該單克隆抗體具有效 價高、特異性高等特點，應用也較為廣泛?？寺√枮?H10U1A7和14E4的單克隆抗體針對 的表位是CD83的空間構象，可以很好用于流式細胞術和ELISA的檢測。特別是克隆號為 IHlO的單克隆抗體可以識別sCD83,但不能識別mCD83,因此可以用于流式檢測時區(qū)分兩種 不同類型的⑶83。
[0037]與已有的單克隆抗體不同，本發(fā)明制備的抗人CD83單克隆抗體所用的免疫原是 畢赤酵母表達的⑶83重組蛋白，其針對的是包含完整功能區(qū)域的⑶83胞外段即⑶83第20 位至第145位氨基酸序列，通過ELISA篩選對⑶83重組蛋白高反應性的雜交瘤細胞株。
[0038] 本發(fā)明的抗人CD83單克隆抗體與已有的抗體針對的CD83區(qū)域或位點不同，其效 價、特異性和應用隨之發(fā)生變化。
[0039] 本發(fā)明所得的抗人CD83單克隆抗體具有效價高、特異性高和適用范圍廣等優(yōu)點， 本發(fā)明提供的抗人CD83單克隆抗體可以廣用于免疫印跡、免疫沉淀、ELISA、流式細胞術等 不同手段檢測CD83蛋白，為研究CD83的功能提供了基礎。
【附圖說明】
[0040] 圖1為本發(fā)明提出的抗人CD83單克隆抗體純化過程中典型的層析峰型圖。
[0041] 圖2為本發(fā)明提出的抗人⑶83單克隆抗體純度鑒定結果。
[0042] 圖3-A和圖3-B為本發(fā)明提出的抗人⑶83單克隆抗體特異性鑒定結果。
[0043] 圖4為本發(fā)明提出的抗人⑶83單克隆抗體檢測發(fā)酵液中的s⑶83。
[0044] 圖5-A和圖5-B為本發(fā)明提出的抗人⑶83單克隆抗體檢測頂9細胞膜表面⑶83。
[0045] 圖6-A和圖6-B為本發(fā)明提出的抗人⑶83單克隆抗體和多克隆抗體組裝ELISA 試劑盒優(yōu)化實驗。
[0046] 圖7為本發(fā)明提出的兩個抗人⑶83單克隆抗體組裝ELISA試劑盒抗體組合優(yōu)化。
[0047] 圖8-A和圖8-B為高靈敏度ELISA試劑盒抗體濃度優(yōu)化。
[0048] 圖9-A和圖9-B為低靈敏度ELISA試劑盒抗體濃度優(yōu)化。
[0049] 圖IO-A