專利名稱：水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度和粒重控制基因bc14及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度和粒重控制基因BC14，該基因編碼的蛋白質(zhì)及其功能類似物，編碼其的核苷酸序列，含有該核苷酸的載體和含有該載體的宿主細(xì)胞；另外，本發(fā)明還涉及控制植物莖稈機(jī)械強(qiáng)度和籽粒重量的方法。
背景技術(shù)：
植株莖稈的機(jī)械強(qiáng)度是植物、尤其是農(nóng)作物重要的農(nóng)藝性狀。而莖稈的機(jī)械強(qiáng)度又與莖稈組織中相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞壁厚度直接有關(guān)，是組成植物細(xì)胞壁各種多聚物物理特性的綜合體現(xiàn)。植物細(xì)胞壁是一種復(fù)雜的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，由不同的結(jié)構(gòu)多糖、芳香族物質(zhì)和蛋白質(zhì)高度有序地組成[1](參考文獻(xiàn)編號(hào)，以下同)，其結(jié)構(gòu)對保持細(xì)胞形態(tài)，維持植株直立生長的機(jī)械支撐力具有重要作用。植物細(xì)胞壁的生物合成是一個(gè)非常復(fù)雜的代謝過程，涉及纖維素、木質(zhì)素和一些非纖維素成分的合成途徑。因此，細(xì)胞壁中纖維素、木質(zhì)素等主要成分的合成與分布以及沉積是影響植株莖稈支撐力的主要影響因素。對不同細(xì)胞壁突變體的研究是揭示與莖稈機(jī)械強(qiáng)度有關(guān)的細(xì)胞壁生物合成生理生化以及分子生物學(xué)機(jī)理的有效途徑。植物莖稈機(jī)械強(qiáng)度首先與纖維素的合成與沉積密切相關(guān)。1996年P(guān)ear等人對 EST隨機(jī)測序，首先從棉花中克隆了植物纖維素合酶催化亞基CesA[2]。而纖維素合酶在植物體中行使功能最直接的證據(jù)則來自于對擬南芥突變體rsw的研究[3]，該突變體側(cè)根發(fā)育異常，且纖維素含量大幅降低，從中以圖位克隆的方法分離到擬南芥中第一個(gè)纖維素合酶催化亞基基因AtCesAl。生物信息學(xué)分析表明，CesA基因是一個(gè)龐大的基因家族，它的各成員之間具有極高的保守性M。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，任何一個(gè)目前已克隆的CesA基因發(fā)生突變后，都會(huì)引起比較嚴(yán)重的表型，這暗示著植物基因組中存在著諸多CesA基因在功能上并不冗余，它們可能分別在不同的發(fā)育時(shí)期和部位起作用，也可能共同參與了同一個(gè)復(fù)合體的形成，協(xié)同作用完成纖維素的合成、晶體化和沉積[5]，但分子機(jī)理還很不清楚。關(guān)于纖維素的沉積，盡管目前已發(fā)現(xiàn)一些蛋白在纖維素的沉積中起著至關(guān)重要的作用，例如擬南芥脆性纖維基因FRAl(Fragile feber 1)編碼的一個(gè)kenesin-like蛋白[6] ；FRA2編碼的 Katanin-Iike蛋白m以及COBRA蛋白te]。但作為細(xì)胞壁最主要的組份，纖維素是高度有序并與細(xì)胞壁的其他組份有機(jī)連接在一起的，目前人們所了解的只是“冰山的一角”。此外，還有大量的糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)參與了非纖維素多糖和蛋白多糖的合成與修飾。以擬南芥為例， 預(yù)測具有415個(gè)GT[9]，但只有極少數(shù)被證明具有生化活性和功能[1°_12]。植物莖稈機(jī)械強(qiáng)度也與細(xì)胞次生壁的木質(zhì)化有關(guān)。在擬南芥的研究中，發(fā)現(xiàn)一些木質(zhì)化異常的突變體。如Jones在2001年[13]對一不正常木質(zhì)部突變體irx4研究證實(shí)， 木質(zhì)素代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶即肉桂酰輔酶A還原酶(Cirmamoy 1-CoAreductase，CCR)。 由于CCR基因的突變，導(dǎo)致木質(zhì)素合成途徑提前終止，細(xì)胞壁中木質(zhì)素含量較正常植株減少了 50%，從而導(dǎo)致莖稈支撐力度的下降。
粒重是一個(gè)直接影響農(nóng)作物產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀，由籽粒大小和籽粒充實(shí)度兩個(gè)因素決定，前者又決定于粒長、粒寬和粒厚三個(gè)要素。研究發(fā)現(xiàn)，水稻粒重是一個(gè)由多基因控制的復(fù)雜的數(shù)量性狀，目前有較多QTL定位的報(bào)道，然而有關(guān)其形成的分子機(jī)制仍然知之甚少，相關(guān)的研究僅有少量零星的報(bào)道。2006年Fan等在第三染色體著絲粒區(qū)附近精細(xì)定位了一個(gè)控制水稻籽粒長度和粒重的主效QTL基因GS3，2009年Takano-Kai等人克隆了該基因。GS3編碼一個(gè)跨膜蛋白，測序比較發(fā)現(xiàn)，與短粒水稻材料相比，所有的長粒水稻 GS3編碼區(qū)都存在一個(gè)由“C”到“A”的堿基突變，導(dǎo)致編碼蛋白在C端產(chǎn)生一個(gè)178個(gè)氨基酸的缺失，因此GS3被認(rèn)為是控制水稻谷粒長度的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子[14’w。2007年Song等通過圖位克隆的方法在水稻第二染色體短臂端克隆了一個(gè)控制谷粒寬度和粒重的主效QTL 基因GW2，該基因編碼一個(gè)新的RING-type E3 ubiquitin ligase，與泛素化降解有關(guān)。GW2 功能的缺失引起穎殼橫向細(xì)胞數(shù)目增加，導(dǎo)致穎殼明顯加寬、粒重顯著增加[’16]。隨后另一個(gè)控制水稻籽粒寬度和粒重的主效QTL基因GW5也通過圖位克隆的方法獲得(Shomura等， 2008[17] ；Weng等，2008[18])，該基因位于水稻第五染色體。GW5的缺失突變基因型也引起外穎橫向細(xì)胞數(shù)目增加，并導(dǎo)致穎殼寬度和粒重的顯著增加。GW5編碼一個(gè)新的核蛋白，酵母雙雜實(shí)驗(yàn)顯示，該蛋白能與多聚泛素互作，預(yù)示著該基因也可能通過泛素化降解途徑調(diào)控水稻籽粒穎殼的細(xì)胞分裂來控制水稻籽粒的大小。通過圖位克隆的方法，2008年Wang等克隆了一個(gè)調(diào)控水稻籽粒充實(shí)度的基因GIF1，該基因定位在第四染色體上，編碼一個(gè)細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶，對于籽粒早期灌漿充實(shí)過程中的碳素營養(yǎng)分配具有控制作用。該基因功能缺失導(dǎo)致籽粒灌漿充實(shí)度降低，堊白增加，粒重降低[19]。綜上所述，植物莖稈機(jī)械強(qiáng)度和粒重都是多基因控制的復(fù)雜性狀，其機(jī)制目前仍不十分了解。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述研究背景，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度和粒重的基因，所述基因的核苷酸序列選自(1)編碼SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(2)與(1)中的核苷酸序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并同時(shí)編碼具有控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度和粒重功能的核苷酸序列。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液(0. 25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7. 2， 7% SDS)中，65°C預(yù)雜交30分鐘；棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液， PH 7.2,7% SDS，同位素標(biāo)記的核苷酸片段)，65°C雜交16小時(shí)；棄雜交液，加入洗膜液 I (20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.2,0. 1% SDS)，65°C洗膜2次，每次10-15分鐘；加入洗膜液 II (10mmol/L 磷酸鈉緩沖液，pH 7. 2,0. 1% SDS)，65°C洗膜 10-15 分鐘。本發(fā)明的控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度和粒重的基因優(yōu)選具有如圖6和SEQID NO :1所示的DNA序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種由本發(fā)明的控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度和粒重的基因所編碼的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)優(yōu)選地具有如圖7和SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種含有本發(fā)明的控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度和粒重的基因的植物表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體是如圖4所示的BC14-BAC，該載體可以表達(dá)由上述核酸序列編碼的多肽。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種培育植物的方法，所述方法可使植物莖稈機(jī)械組織細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分發(fā)生改變，從而引起莖稈機(jī)械強(qiáng)度發(fā)生變化，同時(shí)所述方法還可使粒重發(fā)生改變，所述方法包括下列步驟用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株。本發(fā)明公開的BC14基因是一個(gè)具有控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度和粒重的新基因，該基因的克隆和功能的揭示，將為了解水稻控制莖稈機(jī)械強(qiáng)度和籽粒的分子機(jī)制供了新的線索，對于提高水稻的產(chǎn)量水平和秸稈的合理利用將具有潛在的利用價(jià)值。關(guān)于序列表的說明SEQ ID NO :1是BC14基因的⑶S (氨基酸編碼區(qū)DNA序列)序列；SEQ ID NO :2是BC14基因編碼的氨基酸序列。


下面結(jié)合附圖對理解本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并非對本發(fā)明作限定。圖1.水稻bcl4突變體的表型(1)(野生型(WT)和bcl4突變體(bcl4)的莖稈 (A)和葉片⑶的機(jī)械強(qiáng)度(拉斷力)測定(表型1))；圖2.水稻bcl4突變體的表型( (突變體bcl4與野生型(WT)的種子大小差異 (表型2)籽粒變小(A)、千粒重(千粒種子重量)降低(B))；圖3. BC14基因的圖位克隆(精細(xì)定位)；圖4. BC14基因功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)化載體BC14-BAC的載體圖譜；圖5.BC14基因的功能互補(bǔ)驗(yàn)證(突變體bcl4、野生型(WT)與轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)系 (BC14-BAC)的表型比較莖稈拉斷力(A)、葉片拉斷力(B)、千粒重(C))；圖6. BC14基因的⑶S序列(氨基酸編碼區(qū)DNA序列)；圖7. BC14基因編碼的氨基酸序列；圖8. BC14基因表達(dá)的RNA原位雜交分析；圖9. BC14蛋白的⑶S表達(dá)譜分析；圖10. BC14蛋白的亞細(xì)胞定位；和圖11. BC14蛋白的核苷酸糖基轉(zhuǎn)運(yùn)活性測定。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :BC14基因的克隆1.水稻材料水稻(Oryzasativa ssp.)突變體 brittle culml4 (bcl4)，是原始野生型材料粳稻品種“黃金晴”的自發(fā)突變體材料(購自中國水稻所)。突變體與野生型相比，其主要表現(xiàn)為(1)莖葉變脆。與野生型相比，突變體莖稈和葉片的拉斷力分別下降了約70%和46% (圖1A，B)。( 籽粒變小、千粒重降低。突變體的籽粒與野生型相比明顯偏小，從而導(dǎo)致突變體種子的千粒重僅為野生型的一半(圖2A，B)。2.分析和定位群體純合的BC14突變體和水稻品種Kasalath (購自中國水稻所)進(jìn)行雜交，F(xiàn)1代自交，F(xiàn)2群體共得到192株隱性脆稈個(gè)體，并以此作為定位群體。在苗期每株取2克左右的嫩葉，用來提取DNA。3.通過簡單重復(fù)序列(SSR，Simple Sequence R印eat)，序列標(biāo)記位點(diǎn)(STS， Sequence-tagged Sites)，和酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS，Cleavedamplified polymorphic sequence)標(biāo)記定位BC 14基因。采用改進(jìn)的CTAB方法_從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組DNA。取大約 IOOmg水稻葉片，經(jīng)液氮冷凍，在直徑5cm的小研缽中磨成粉狀，轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管里提取 DNA,獲得的DNA沉淀溶解于100 μ 1超純水中。每一個(gè)SSR、STS或CAPS反應(yīng)用1 μ 1 DNA樣品。4.BC14基因的初步定位對由50個(gè)&脆稈個(gè)體組成的小隱性定位群體，選用水稻12條染色體上相距約 20cM的多態(tài)性SSR引物進(jìn)行連鎖分析。結(jié)果表明第二染色體長臂端上的分子標(biāo)記R1C62、 RM525與突變基因有明顯的連鎖關(guān)系，交換率分別為17%和23%，分子標(biāo)記基因型分析表明，BC14定位于兩者之間。在兩標(biāo)記之間進(jìn)一步發(fā)掘多態(tài)性分子標(biāo)記，將BC14基因定位在 SSR標(biāo)記RM3515和RM13617之間約8151Λ基因組區(qū)間內(nèi)。(引物序列見表1)5.BC14基因的精細(xì)定位利用初步定位的兩個(gè)SSR標(biāo)記RM3515和RM13617對剩余的142個(gè)F2脆性單株進(jìn)行基因型鑒定，分別發(fā)現(xiàn)6個(gè)和11個(gè)交換株。在兩標(biāo)記之間進(jìn)一步開發(fā)了一系列新的具有多態(tài)性的分子標(biāo)記Sl 5(序列見表1)，利用這些標(biāo)記對RM3515和RM13617的全部交換單株進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sl和S2具有與RM3515 —致的3個(gè)交換株，而S3、S4和S5 分別具有1個(gè)、4個(gè)和4個(gè)與RM13617 —致的交換單株。最終將BC14基因精細(xì)定位在STSR 標(biāo)記S2和S3之間57Kb區(qū)間范圍(圖3)表1克隆BC14基因所用引物序列
分子標(biāo)記正向引物序列反向引物序列分子標(biāo)記類型RM262CATTCCGTCTCGGCTCAACTCAGAGCAAGGTGGCTTGCSSRRM525GGCCCGTCCAAGAAATATTGCGGTGAGACAGAATCCTTACGSSRRM3515GGAAAGAAGAiTATGCCATGCAGAGAGAATCAGAAACACCAACSSRRM13617ACCATATAGCGTGTATGCAACCTGCACACATGTACACAGTACACCSSRSlCTCGGGAAGCGGTGGGATTAGCTCTGCCAATAGCGGCSTSS2ATGGGATTCGCCTAGACACCCAGAGAAGAATACGAGTCCGACSTSS3GGAACTCGGAAGCAGTGGAGAAACGCTCGCTGCCTCASTSS4TGTCTACGAAGACACGAAACACGAGAAGGCGGCAATAAGGTTSTSS5TAAAAGTGGAGTCATCCGTCCGAGTCCAGATGTTCGCAAGGSTS6. BC14基因的克隆、全長cDNA的獲得和編碼蛋白結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測對精細(xì)定位的571Λ區(qū)段內(nèi)的候選開放閱讀框(ORF)進(jìn)行了詳細(xì)的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該基因組范圍內(nèi)共包含6個(gè)0RF。為了確定BC14基因，我們對野生型和突變體的6個(gè)ORF進(jìn)行了測序分析，發(fā)現(xiàn)在0RF3的基因組序列中，除了若干在內(nèi)含子區(qū)的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)外，在編碼區(qū)898位存在從胞嘧啶核苷酸(C)到胸腺嘧啶核苷酸(T)的點(diǎn)突變，該突變可導(dǎo)致0RF3編碼的第330位亮氨酸(Leu)突變?yōu)楦彼?ftx))。為了進(jìn)一步確認(rèn)該位點(diǎn)是 bcl4的突變位點(diǎn)，而不是天然的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，針對該位點(diǎn)所在的片段，在多個(gè)秈稻和粳稻品種中進(jìn)行了測序分析，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)在不同的秈稻和粳稻品種中相當(dāng)保守。因而推測 0RF3 (L0C_0s02g40030)是 BC14 的候選基因。通過與KOME中BC14的全長cDNA序列的比對，我們發(fā)現(xiàn)BC14基因組序列全長 4114bp，含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子(圖:3B)。cDNA全長1041bp(圖6)，編碼346個(gè)氨基酸(圖7)，預(yù)測分子量為37183. 9道爾頓，而等電點(diǎn)(pi)為9. 6238。對NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的Blast分析發(fā)現(xiàn)BC14蛋白在植物中相對比較保守，與植物中的同源蛋白質(zhì)間的一致性可以達(dá)到約65%，而與動(dòng)物中同源蛋白(如 HsUGTrel7, CeSQV_7和DmFRC)間只有很低的保守性，一致性不超過32%。然而，植物中還沒有相關(guān)同源基因的功能分析報(bào)道。由于BC14基因在動(dòng)物中的同源基因均為核苷酸糖基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NST)，這意味著BC14蛋白很可能也是轉(zhuǎn)運(yùn)核苷酸糖基的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。各種生物信息學(xué)軟件預(yù)測表明，BC14屬于TPT家族成員。而且核苷酸糖基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是該P(yáng)F03151蛋白家族的亞家族，這與氨基酸序列相似性分析結(jié)果相一致。實(shí)施例2BC14的功能互補(bǔ)及轉(zhuǎn)基因研究為了驗(yàn)證L0C_0s02g40030 (0RF3)就是BC14基因，將水稻BAC克隆 0sJNBb0116L05(購自上海生命所)質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Hind III和)(ba I酶切釋放出BC14的全部基因組片段，共10748bp，包含起始密碼子ATG上游的4996個(gè)堿基、編碼區(qū)的3675個(gè)堿基和終止密碼子TAG后的2077個(gè)堿基。將該基因組片段插入到雙元載體 pCAMBIA1300(購自CAMIA公司，澳大利亞)中的Hind III和)(ba I位點(diǎn)間，從而獲得了用于轉(zhuǎn)化的BC14基因功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)化載體BC14-BAC(圖4)。質(zhì)粒通過電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 (AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105 (購自CAMIA公司，澳大利亞)中并轉(zhuǎn)化突變體 bcl4，其過程如下1.水稻幼胚培養(yǎng).將bcl4突變體的幼胚脫殼，70%乙醇表面消毒;3min后，用 0. 1 %氯化汞5分鐘，10%次氯酸鈉溶液浸泡20分鐘，無菌水沖冼3-4次，點(diǎn)播于NB培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，20天左右從成熟胚盾片處長出的愈傷組織繼代于NB培養(yǎng)基上，以后每2 周繼代一次，每次繼代時(shí)都挑選色澤淡黃較致密的胚性愈傷組織。2.農(nóng)桿菌培養(yǎng)._70°C保存的農(nóng)桿菌菌株接種于含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP培養(yǎng)基上，2648°C，150rpm暗培養(yǎng)16-18小時(shí)活化菌種，YEP固體培養(yǎng)基上劃平板，于暗培養(yǎng)1天，挑取單菌落于YEP液體培養(yǎng)基中，2648°C，150rpm懸浮培養(yǎng) 16小時(shí)，倒入250ml離心管中4000rpm離心收集農(nóng)桿菌菌體，并用液體培養(yǎng)基懸浮菌體至 0. D600為0. 8-1. 0，用于各種水稻材料的轉(zhuǎn)化。3.水稻材料與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng).水稻愈傷組織在與農(nóng)桿菌菌液感染前均需先在新鮮的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天后，才可用于轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化時(shí)先將經(jīng)預(yù)培養(yǎng)4天的愈傷組織轉(zhuǎn)移到IOOml無菌三角錐形瓶中，然后將適量農(nóng)桿菌懸浮液倒入(保證有足夠的菌液把材料淹沒)上述含有水稻材料的錐形瓶中，室溫下放置20分鐘，并不時(shí)晃動(dòng)，然后將水稻材料取出，在無菌濾紙上吸去多余菌液，隨即轉(zhuǎn)移到鋪有一層無菌濾紙的NB-AS固體培養(yǎng)基(加入 100 μ M 乙酰丁香酮 AS 的 NB 培養(yǎng)基)(NB basic+10mg/L glucose+2mg/l 2， 4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D)+500mg/l proline+500mg/lglutamine+300mg/lcasein hydrolysate+100mg/l Inositol+lOOuM AS+3g/lPhytagel, pH 5.8)上，在 26°C條件下暗培養(yǎng)2-3天。共培養(yǎng)后，從固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基上取出轉(zhuǎn)化過的水稻材料，轉(zhuǎn)入含有 50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。4.抗性愈傷組織的篩選及植株再生。第一輪選擇2周后，轉(zhuǎn)到第二輪選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選2周，然后選擇生長旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基(MS basic+16g/ 1 sobitol+lg/1 casein hydrolysate+100mg/lInositol+5mg/L ABA+2mg/L 6-KT+O. 5mg/ L NAA+250mg/l cefotaxime+30-50mg/l hygromycin 3g/l Phytage1, pH 5.8)或直 接轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(MS basic+16g/l sobitol+lg/1 casein hydrolysate+100mg/l Inositol+2mg/L 6-KT+O. 5mg/L NAA+250mg/l cefotaxime+30-50mg/l hygromycin 3g/l Phytagel, pH 5. 8)上分化(16小時(shí)光照/天)，再生的小苗在V2MS上生根壯苗，隨后移入溫室。共獲得互補(bǔ)轉(zhuǎn)化載體BC14-BAC的轉(zhuǎn)基因株系18個(gè)，無論是莖稈和葉片的拉斷力 (圖5A和5B)，還是粒重(圖5C)，均完全恢復(fù)了野生型的表型。這一結(jié)果證明該基因具有調(diào)節(jié)水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度和粒重的作用。實(shí)施例3 :BC14的器官與組織表達(dá)特性研究1. BC14基因的mRNA組織原位雜交分析利用帶有EcoR I和Kpn I的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物從野生型的cDNA中擴(kuò)增出 BC14基因cDNA的289-594bp片段。所用引物序列如下正向5'-CRRatccRRtaccTTTACAAATAGCGAGCCATCC-3'反向5,-gtctagaattcCCCACGAGCATCAAACGAC_3，94°C預(yù)變性5分鐘，94°C 1分鐘，60°C 1分鐘，72°C 0. 5分鐘，35次循環(huán)，72°C延伸 10分鐘獲得PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物連接到T-easy載體(購自！Iomega)，然后通過電擊法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞(購自北京天庚生物科技有限公司)，測序挑選序列完全正確的克隆。從遠(yuǎn)離T7或SP6啟動(dòng)子一側(cè)的多克隆位點(diǎn)區(qū)域選擇限制性內(nèi)切酶I^t I 把質(zhì)粒線性化，取1 μ g線性化的質(zhì)粒DNA作為制備正義或反義RNA探針的模板。采用DIG Northern Starter Kit (2039672，Roche)，按照使用說明，制備地高辛標(biāo)記的RNA探針。制備好的RNA探針在60°C IOOmM碳酸鹽緩沖液(pH10. 2)中裂解80min，水解后的探針使用濃度為 2μ g/ml。水稻材料在4%多聚甲醛中4°C固定過夜。固定后的組織經(jīng)脫水、透明、透蠟后包埋在石蠟(Sigma)中。用切片機(jī)(RM2145，LEICA)將包埋的組織切成7_10 μ m，鋪在預(yù)先用多聚-L-賴氨酸處理的載玻片上(P0425，Sigma)上展片，然后在42°C烤片臺(tái)上烘烤過夜。 切片經(jīng)二甲苯脫蠟和酒精梯度復(fù)水，0. 125mg/ml鏈蛋白酶37°C處理30min，重新固定后風(fēng)干。將固定在載玻片上的切片用2父35(漂洗&1^1后，701變性301^11，1(^8/1111蛋白酶K 室溫消化30min，再加入4%多聚甲醛后固定lOmin。隨后依次用3XPBS、1 XPBS和三乙醇胺漂洗后，向三乙醇胺溶液中加入乙酸酐劇烈攪拌并再次將切片放入三乙醇胺溶液中孵育 5min，依次用2XSSC、50%、70%和100%乙醇中漂洗和脫水，并晾干。 每張載玻片上滴加60 μ 1的RNA探針，48 V雜交過夜。載片在45 °C下用2 X SSC (用 50%甲酰胺溶液稀釋)漂洗2次，并依次用2X馬來酸室溫平衡15分鐘、0.5X馬來酸(含 0. 3% Tween 20) 65°C孵育1小時(shí)、1 X馬來酸(含0. 3% Tween 20和封閉液)室溫孵育1小時(shí)。向每張載片上加入80 μ 1堿性磷酸酶偶聯(lián)地高辛抗體(購自Roche公司)，37°C孵育2小時(shí)，在含有封閉液的IX馬來酸溶液中漂洗3次，每次1小時(shí)。然后在含有 0. 34mg/ml 氮藍(lán)四唑鹽(nitroblue tetrazolium(購自 Sigma 公司)和 0. 175mg/ml 5-溴 4-氯-3-吲哚-磷酸甲苯胺鹽(5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate toluidinium salt(購自Sigma公司)的漂洗液中溫育1-2天。用IOmM Tris, ImM EDTA (pH 8.0)終止顯色反應(yīng)，風(fēng)干后用50%甘油封片。在顯微鏡下觀察并用CCD相機(jī)拍照。原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BC14基因在幼嫩葉片(圖8A)、幼莖(圖8B，C)、幼根(圖8D) 及細(xì)嫩莖稈(圖8E)等組織的維管束中或厚壁組織處在大量表達(dá)。作為實(shí)驗(yàn)負(fù)對照，其正義鏈探針在細(xì)嫩莖稈中沒有檢測到明顯的雜交信號(hào)(圖8F)，證明BC14基因主要在水稻機(jī)械組織(主要由厚壁細(xì)胞和維管束組成)中表達(dá)。這與其可能參與細(xì)胞壁合成的功能預(yù)測相一致。2. BC14基因融合⑶S表達(dá)的轉(zhuǎn)基因材料分析在BC14-BAC互補(bǔ)轉(zhuǎn)化載體(圖4)的基礎(chǔ)上構(gòu)建BC14基因融合⑶S表達(dá)載體。首先利用巢式PCR擴(kuò)增在TAG終止密碼子前引入BamH I酶切位點(diǎn)(首先BC14PstIF+BC14BmR 和BC14BmF+BC14KpnIR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物混合后，再以BC14PstIF+BC14KpnIR進(jìn)行 PCR擴(kuò)增)。將最終PCR產(chǎn)物連接到pGEM Teasy后通過載體上T7和SP6引物進(jìn)行測序驗(yàn)證。然后通過I3St I和Kpn I雙酶切將該片段替換BC14-BAC載體上的相應(yīng)片段。將GusA 基因用帶BamH I酶切位點(diǎn)的GusABmF和GusABmR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接到pGEM Teasy后經(jīng)測序驗(yàn)證后，以BamH I酶切克隆到改造后的BC14-BAC載體上，形成pBC14⑶S載體。將該質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)，挑選陽性克隆用于水稻轉(zhuǎn)化。以上克隆相關(guān)的引物序列如下BCHPstIF 5' -TTTCTGCAGGATTTCTTCACC-3‘BC14BmF 5' _aag収atccTAGATACGGATGTCCAGTGG-3‘BC14BmR 5' -ctaggattcCTTCCCTTTGATCTTGCA_3’BC14KpnIR 5' -RRtaccGGTTCAGTGGTTTATCCACCTT~3‘GusABmF 5' -GGATCCATGTTACGTCCTGTAGAAACCCC-3‘GusABmR 5' -GGATCCTTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3‘經(jīng)抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株。Ttl代轉(zhuǎn)基因植株為野生型表型，說明BC14-GUS具有天然BC14基因的活性。然后取野生型表型的Tl代轉(zhuǎn)基因幼苗和成株的不同組織進(jìn)行GUS 組織化學(xué)顯色反應(yīng)。具體程序?yàn)閷⑺静牧辖氲舰荢顯色液(500ug/ml X-Gluc, IOmM EDTA,lOOmMsodiumphosphate(ρΗ7· 0)，0. 5mM K4Fe(CN)6,0. 5mM K3Fe (CN)6,0. 1 % Triton X-100)中，在37°C適當(dāng)顯色后，依次用30%、50%和70%乙醇脫色，在體視鏡(Leica)上用 CCD相機(jī)拍照。對GUS顯色后的水稻莖桿節(jié)間進(jìn)行徒手切片，然后用50%甘油封片后在普通光學(xué)顯微鏡(Leica)下觀察并用C⑶相機(jī)拍照。⑶S顯色發(fā)現(xiàn)，⑶S信號(hào)主要集中在葉片的葉枕部(圖9A)、幼根的中央維管束(圖 9B)及幼嫩葉片的維管束中(圖9C)。同時(shí)對成株的幼嫩莖稈進(jìn)行了 GUS染色，發(fā)現(xiàn)有明顯的信號(hào)，徒手切片觀察發(fā)現(xiàn)在厚壁細(xì)胞和維管束中顯色較深(圖9D和E)。GUS表達(dá)分析表明BC14基因在不同組織的主要的機(jī)械組織厚壁細(xì)胞和維管束中都有表達(dá)，與RNA原位雜交分析的結(jié)果相一致。GUS融合表達(dá)和RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)分別從翻譯水平和轉(zhuǎn)錄水平上都證明BC14基因主要在機(jī)械組織表達(dá)。這與bcl4突變體在次生壁的嚴(yán)重缺陷表型相一致，也說明BC14基因可能是次生壁合成相關(guān)的重要基因。實(shí)施例4 :BC14蛋白的亞細(xì)胞定位研究通過PCR弓丨物BCHSalF和BC14NcoR擴(kuò)增BC14基因的cDNA，同時(shí)引入SalI和Kpn I酶切位點(diǎn)。將最終PCR產(chǎn)物連接到pGEM Teasy后通過載體上T7和SP6引物進(jìn)行測序驗(yàn)證。然后通過Ml I和Nco I雙酶切將BC14基因克隆到GFP瞬時(shí)表達(dá)載體35SCGFP (購自 Clontech公司)上。挑取陽性克隆經(jīng)過酶切和測序驗(yàn)證后，形成BC14-CGFP。然后通過類似的方法以KpnI和SpeI將BC14基因克隆到35S-NGFP瞬時(shí)表達(dá)載體(購自Clontech公司)上，形成NGFP-BC14載體。相關(guān)的引物序列如下BCHSalF 5' -tgtcgacATGGCGAAGGGAGGG-3’BC14NcoR 5' -tccatggcCTTCCCTTTGATCTTGC~3’BC14KpF 5' -tggatccATGGCGAAGGGAGGG-3’BC14SpR 5' -tactagtCTACTTCCCTTTGATCTTGC~3’將構(gòu)建好的BC14-CGFP和NGFP-BC14載體分別轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體，通過激光共聚集顯微觀察研究BC14蛋白的亞細(xì)胞定位。具體程序?yàn)閷?7°C萌發(fā)的水稻種子播種在PCR板上于暗中培養(yǎng)7-9天。取出幼苗，用藍(lán)吉列刀片順脈方向連續(xù)拉，并浸在0.6M marmitol中平衡lOmin。用200目篩子過濾后，將切碎的組織投入配制的酶液
中，抽真空 5min，在搖床(80rpm)上裂解 4hr。經(jīng) 200目篩子過濾，將懸濁液裝入7ml離心管中，以600rpm離心3-5min后棄掉上清，用aiil W5 溶液(154mMNaCl，125mM CaC 12,5mM KCl,2mM MES(pH 5.7))和預(yù)冷的 2ml Mmg溶液(0· 6M mannitol, 15mM MgC12,4mM MES (pH 5. 7))分別洗滌一次后，棄上清重加入^iilMmg溶液，充分懸浮，冰浴30min。然后600rpm離心收集原生質(zhì)體沉淀。每IOOul原生質(zhì)體，依次加入 20ul純化的瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒，和120ul 40% PEG，充分混勻，室溫放置20min。然后加入Iml W5溶液，混勻后轉(zhuǎn)移到六孔培養(yǎng)板，再加入Iml W5，在培養(yǎng)過液。次日，提籃離心收集原生質(zhì)體，即可用于激光共聚集顯微觀察。激光共聚焦顯微觀察結(jié)果，BC14蛋白C端和N端的GFP融合的GFP熒光信號(hào)都與標(biāo)記高爾基體的Man49-RFP的RFP熒光信號(hào)高度重合(圖10)，表明BC14蛋白定位在水稻高爾基體。實(shí)施例5 :BC14蛋白的體外表達(dá)和功能驗(yàn)證1. BC14表達(dá)載體的構(gòu)建利用帶有Kpn I和Spe I的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物從野生型的cDNA中擴(kuò)增出 BC14基因，同時(shí)引入His標(biāo)簽。所用引物序列如下正向5'-TGGTACCatRcatcatcaccatcaccacRRcATGGCGAAGGGAGGG-3'反向5,-TACTAGTCTACTTCCCTTTGATCTTGC-3’94°C預(yù)變性5分鐘，94°C 1分鐘，60°C 1分鐘，72°C 4分鐘，35次循環(huán)，72°C延伸10 分鐘獲得PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物連接到T-easy載體(購自！Iomega)，然后通過電擊法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞，測序挑選序列完全正確的克隆。通過Kpn I和Spe I酶切插入到具相同酶切位點(diǎn)的酵母表達(dá)載體PYES2 (購自Biovector公司)中，測序驗(yàn)證其編碼框的正確性，形成PYES2-BC14載體。2.BC14蛋白的表達(dá)將構(gòu)建好的pYES2-BC14質(zhì)粒，利用質(zhì)粒提取試劑盒(購自上海申能博彩生物科技有限公司)純化好后，利用PEG/LiAc轉(zhuǎn)化酵母菌株233Mc[21]中進(jìn)行表達(dá)。挑含pYES2_BC 14酵母單菌落到SD-U液體培養(yǎng)基中在30°C搖床上200rpm培養(yǎng)至0D_為3。然后800g離心IOmin收菌，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(加入了誘導(dǎo)劑2%半乳糖的缺脲嘧啶(uracil)的SC培養(yǎng)基)懸起，在30°C以200rpm培養(yǎng)過夜。800g離心IOmin收菌，用含溶壁酶(購自北京天庚生物科技有限公司)的原生質(zhì)球緩沖液(spheroplastbuffer)懸起，于37°C水浴池。然后 800g離心IOmin收集原生質(zhì)球。用冰浴的膜緩沖液懸起，然后用勻漿器裂解原生質(zhì)球。依次用IOOOg(IOmin)、8000gQOmin)和IOOOOOg(60min)離心，最終獲得富含高爾基體囊泡的 P3組分。以Bradford法確定組分的蛋白質(zhì)濃度。3. BC14-GFP融合蛋白的功能對NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的Blast分析發(fā)現(xiàn)，BC14蛋白與動(dòng)物中的一些核苷酸糖基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NST)具有一定的同源性，因此我們將在酵母細(xì)胞中表達(dá)的BC14蛋白進(jìn)行體外核苷酸糖基轉(zhuǎn)運(yùn)活性分析，具體步驟如下將50 μ g P3組分蛋白和0. 3 μ Ci放射性標(biāo)記底物 Uridinediphosphate glucose [glucose_6」H]力口入至Ij 40 μ 1 反應(yīng)緩沖液(0. 8Μ Sorbitol, IOmM Tris, 2mM MgC12)中，然后置于30°C水浴8min。用400 μ 1冰浴的終止緩沖液終止反應(yīng)后，過硝酸纖維素濾膜。并用10倍體積終止緩沖液洗濾膜。將濾膜轉(zhuǎn)移到2mL 管中，完全干燥后添加1.8mL閃爍液(Optiphase supermix，PE)，并使用閃爍儀測定放射性活性。圖11顯示，與陰性對照比較，BC14的確具有一定的UDP-Glc的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，證明BC14 為一種核苷酸糖基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。參考文獻(xiàn)1. Bacic, A. , et al. Edi :Priess, J. The biochemistry of plants. New York, Academic Press,14 :297-3712. Pear, J. R.，et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1996,93 :12637-126423. Arioli, Τ. , et al. Science. 279，717-720.4. Richmond, T. A.，et al. Plant Physiol. 2000，124 :495-498.5. Taylor, N. G.，et al. Plant Cell. 2000，12 :2529-2540.6. Zhong, R.，et al. Plant Cell. 2002，14 :3101-3117.7. Burk, D. H.，et al. Plant Cell. 2001，13 :807-827.8. Roudier, F.，et al. Plant Cell. 2005，17 :1749-1763.9. Scheible, W. R. , et al. Curr Opin Plant Biol. 2004，7 :285-295.10. Sarria, R.，et al. Plant Physiol. 2001，127 :1595-1606.11. Faik，A.，et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2002，99 :7797-7802.12. Madson, M.，et al. Plant Cell. 2003，15 :1662-1670.13. Jones, L.，et al. Plant J. 2001,26 :205-21614.Fan, C.，et al. Theor Appl Genet. 2006，112 :1164-117115Takano-Kai, N.，et al.Genetics. 2009，182 :1323-133416Song, X. J.，et al. Nat. Genet. 2007，39 :623-630
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權(quán)利要求
1.一種控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度和粒重的基因，該基因的核苷酸序列選自(1)編碼SEQID NO :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(2)與(1)中的核苷酸序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并同時(shí)編碼具有控制植物莖稈機(jī)械強(qiáng)度功能的核苷酸序列，所述嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液中，所述預(yù)雜交液是0. 25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7. 2,7% SDS，在65°C預(yù)雜交30分鐘；棄預(yù)雜交液，加入雜交液，所述雜交液是0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.2,7% SDS，同位素標(biāo)記的核苷酸片段，在65°C雜交16小時(shí)；棄雜交液，加入洗膜液I，所述洗膜液I是20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7. 2,0. 1% SDS，在65°C洗膜2次，每次10-15分鐘；加入洗膜液II，所述洗膜液II 是IOmmol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7. 2,0. 1% SDS，在65°C洗膜10-15分鐘。
2.按照權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于它具有SEQID NO :1所示的DNA序列。
3.一種由權(quán)利要求1或2所述的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。
4.按照權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)，其特征在于它具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列。
5.一種植物表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求1或2所述的控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度和粒重基因。
6.按照權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體是BC14-BAC。
7.一種改變植物的莖稈機(jī)械強(qiáng)度的方法，其特征在于包括下列步驟用按照權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株。
8.一種改變植物的籽粒重量的方法，其特征在于包括下列步驟用按照權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述植物是水稻。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因、根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的蛋白質(zhì)、或根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)載體在改變植物的莖稈機(jī)械強(qiáng)度和/或籽粒重量中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度和粒重的基因，該基因的核苷酸序列選自(1)編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(2)與(1)中的核苷酸序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并同時(shí)編碼具有控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度和粒重功能的功能類似物。本發(fā)明還提供了編碼該蛋白質(zhì)的基因，含有該基因的表達(dá)載體，和利用該表達(dá)載體改變植物莖稈機(jī)械強(qiáng)度和粒重的方法。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102344927SQ20101024010
公開日2012年2月8日 申請日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月28日
發(fā)明者周奕華, 張保才, 錢前 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所