大豆生育期基因j及其編碼蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及大豆生育期基因 J及其編碼蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆為人類提供重要的植物蛋白質(zhì)和油份。在世界范圍內(nèi)，北至高煒度的北歐瑞 典和北美加拿大，南至巴西及阿根廷等廣泛區(qū)域內(nèi)均有大豆栽培，但單個(gè)品種或種質(zhì)資源 一般適宜種植的煒度跨度較小。長(zhǎng)青春期性狀，即短日照條件下生育期延長(zhǎng)，對(duì)于大豆品種 適應(yīng)范圍向低煒度的延伸起重要的作用，而且對(duì)于為熱帶國(guó)家大豆的栽培管理方式提供了 理論依據(jù)。
[0003] Kiihl在1979年的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，三個(gè)隱性基因決定了大豆在短日照條件下晚花的 性狀。在巴西，長(zhǎng)青春期性狀對(duì)于大豆生產(chǎn)向北延伸有積極地意義。所以巴西對(duì)于長(zhǎng)青春 期性狀做了廣泛的研宄。巴西的研宄認(rèn)為五個(gè)基因控制了長(zhǎng)青春期性狀，且至少有兩個(gè)基 因必須是隱性基因。但是，目前關(guān)于大豆長(zhǎng)青春期性狀基因的研宄僅此而已，所以本試驗(yàn)針 對(duì)這個(gè)分子研宄空缺，設(shè)計(jì)了一個(gè)F2代雜交群體，利用分子標(biāo)記技術(shù)，找到與長(zhǎng)青春期有 關(guān)的QTL，并成功的找到相關(guān)聯(lián)的基因。此發(fā)明對(duì)于大豆品種的廣泛適應(yīng)性有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供大豆生育期基因 J及其編碼蛋白。
[0005] 本發(fā)明的大?生育期基因 J的基因序列如序列表Seq ID No : 1所不。
[0006] 本發(fā)明的大?生育期基因 J的編碼蛋白的氣基酸序列如序列表Seq ID No :2所 不〇
[0007] 本發(fā)明的有益效果：
[0008] 本發(fā)明是在遺傳數(shù)量性狀研宄的基礎(chǔ)上，利用分子手段首次成功地克隆出生育期 基因 J。
[0009] 本發(fā)明利用大豆品種BR121和Harosory雜交后代所產(chǎn)生127個(gè)F2代群體，通過(guò) MQM遺傳定位方法檢測(cè)到在LJ-SSR標(biāo)記附近存在一個(gè)大豆生育期的QTL。把LJ-SSR標(biāo)記 附近的基因與擬南芥生育期基因進(jìn)行比對(duì)，成功的找到了唯一的與擬南芥生育期有關(guān)的基 因，即J基因，并對(duì)此基因進(jìn)行了克隆。本發(fā)明獲得的J基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列（Seq ID No: 1)與 phytozome (http://www. phytozome.net)中公布的 Glyma. 04G〇5〇2〇0. 1(大豆基因組 GlymaLO版本的基因詮釋）相對(duì)應(yīng)，但是其序列并不完全一致，本發(fā)明獲得的J基因翻譯的 蛋白質(zhì)具有714氨基酸（Seq ID No :2)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因，驗(yàn)證了 J基因具有強(qiáng)烈抑制大豆生 育期的生理功能。
[0010] 同時(shí)，通過(guò)同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)J基因與擬南芥ELF3家族具有很高的同源性。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為PTFlOI-J質(zhì)粒過(guò)表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖；
[0012] 圖2為Williams 82轉(zhuǎn)入J基因和未轉(zhuǎn)入J基因大豆的成熟期時(shí)間圖；其中，W82 為Williams82未轉(zhuǎn)入J基因的大豆，35S :J為Williams 82轉(zhuǎn)入J基因后的大豆。
【具體實(shí)施方式】
【具體實(shí)施方式】 [0013] 一：本實(shí)施方式的大豆生育期基因 J基因序列如序列表Seq ID No : 1所示。
[0014] 本實(shí)施方式對(duì)Harosory和BR121雜交產(chǎn)生的F2代群體進(jìn)行研宄，并確定了 J基 因，其與大豆生育期關(guān)系密切。
[0015] 本實(shí)施方式通過(guò)大豆遺傳轉(zhuǎn)化手段，將J基因在大豆中表達(dá)，驗(yàn)證了本發(fā)明的J基 因與能夠顯著的延長(zhǎng)大豆的成熟期。
【具體實(shí)施方式】 [0016] 二：本實(shí)施方式的大豆生育期基因 J的編碼蛋白的氨基酸序列如序 列表Seq ID No :2所示。
[0017] 通過(guò)以下試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的效果：
[0018] (1)大豆生育期J基因的獲得
[0019] 一、在2014年，將BR121和Harosory雜交后代產(chǎn)生的127個(gè)F2代個(gè)體在中國(guó)科 學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研宄所人工氣候室內(nèi)種植，并檢測(cè)生育期。
[0020] 二、利用已經(jīng)構(gòu)建的4號(hào)染色體遺傳圖譜，結(jié)合檢測(cè)的成熟期數(shù)據(jù)，進(jìn)行遺傳數(shù)量 性狀定位。初步遺傳定位只發(fā)現(xiàn)一個(gè)主效QTL，即LJ_SSR，與大豆生育期密切相關(guān)。
[0021] 三、通過(guò)與擬南芥生育期基因聚類分析比較，發(fā)現(xiàn)唯一一個(gè)與擬南芥生育期有關(guān) 的基因，即J基因。
[0022] 四、以大豆品種Harosory的葉片為材料，用購(gòu)買自Invitrogen公司的TRIzol試 劑盒的操作手冊(cè)提取葉片總RNA。
[0023] 五、采用DNase I處理步驟四提取的總RNA。
[0024] 六、取1 μ g步驟五處理后的總RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照購(gòu)買 自 BD Biosciences Clontech 公司的 BD SMART? RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒的 使用手冊(cè)進(jìn)行，獲得cDNA。
[0025] 七、以獲得的cDNA為模板通過(guò)Fl與Rl引物擴(kuò)增J基因，PCR反應(yīng)條件如下：94°C 預(yù)變性51^11，94°0變性3〇8,56°0退火3〇8,72°0延伸21^113〇8，共35循環(huán)，再72°0延伸 5min，將PCR產(chǎn)物在ABI3130測(cè)序儀（ABI公司）上進(jìn)行測(cè)序；
[0026] 其中，引物Fl的序列為5' CTTCCGTAAC TCGTCACTCA 3' ；引物Rl的序列為 5, ACTCTTTCGG GTAAAGCAAT 3,。
[0027] 測(cè)序結(jié)果表明大豆生育期基因 J具有序列表中Seq ID No :1的核苷酸序列，序列 表中的Seq ID No :1由2145個(gè)核苷酸組成，并編碼具有序列表中Seq ID No :2的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)。
[0028] (2)大豆生育期基因 J的功能驗(yàn)證
[0029] -、以大豆品種Harosory的葉片為材料，用購(gòu)買自Invitrogen公司的TRIzol試 劑盒的操作手冊(cè)提取葉片總RNA ;
[0030] 二、采用DNase I處理步驟一提取的總RNA ;
[0031] 三、取1 μ g步驟二處理后的總RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照購(gòu)買 自 BD Biosciences Clontech 公司的 BD SMART? RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒的 使用手冊(cè)進(jìn)行，獲得cDNA;
[0032] 四、分別以J基因 F2與R2為引物，對(duì)步驟三獲得的cDNA通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反 應(yīng)條件：94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸3min，共35循環(huán)，再72°C 延伸5min，獲得含有XbaI-SacI雙酶酶切位點(diǎn)的大豆生育期基因 J ;
[0033] 五、將獲得的含有酶切位點(diǎn)的大豆生育期基因 J克隆到pTFlOl質(zhì)粒中，獲得 PTFlOl-J質(zhì)粒，以Willimas 82為材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)J基因大 豆，將轉(zhuǎn)J基因大豆和Willimas 82在12小時(shí)光照和12小時(shí)黑暗條件下種植，觀察它們的 生育期；
[0034] 其中，引物 F2 的序列為 5'GCTCTAGAGA TGAAGAGAGG GAAGGATGA 3' ；引物 R2 的序 列為 5'CGAGCTCGCT ACACTGAGTC ATTCTGTT 3'。
[0035] 步驟五獲得的pTFlOl-J質(zhì)粒過(guò)表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示；
[0036] Williams 82轉(zhuǎn)入J基因和未轉(zhuǎn)入J基因大豆的成熟期時(shí)間圖如圖2所示；其中， W82為Williams 82未轉(zhuǎn)入J基因的大豆，35S:J為Williams 82轉(zhuǎn)入J基因后的大豆；從 圖2可以看出，W82的生育期為92天，35S J的生育期為105天，表明轉(zhuǎn)入J基因后的大豆 成熟期比Willimas 82的成熟期晚13天，從而說(shuō)明J基因具有延長(zhǎng)大豆成熟期的功能。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 大豆生育期基因 J，其特征在于大豆生育期基因 J的基因序列如序列表Seq ID No : 1所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的大豆生育期基因 J的編碼蛋白，其特征在于大豆生育期基因 J 的編碼蛋白的氣基酸序列如序列表Seq ID No :2所不。
【專利摘要】大豆生育期基因J及其編碼蛋白，它涉及大豆生育期基因J及其編碼蛋白。本發(fā)明的目的是提供大豆生育期基因J及其編碼蛋白。本發(fā)明大豆生育期基因J的基因序列如序列表Seq？ID？No：1所示。本發(fā)明大豆生育期基因J的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq？ID？No：2所示。本發(fā)明通過(guò)大豆遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，表明J基因抑制大豆生育期的生理功能。本發(fā)明應(yīng)用于大豆基因工程領(lǐng)域。
【IPC分類】C12N15-29, C07K14-415
【公開(kāi)號(hào)】CN104561041
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510001533
【發(fā)明人】孔凡江, 劉寶輝, 蘆思佳, 曹東, 王家麟
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月4日