并呋喃-5-磺酰基。
[0159] 實(shí)施例18-3 (溶劑為DMF/二甲基亞砜，即DMF和二甲基亞砜的混合溶劑）：Fmoc- Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-I le-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu) -Leu-Wang樹脂（膚樹脂 18)的制備
[0160] 實(shí)施例17制得的肽樹脂（17)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25°C攪拌 10分鐘，真空抽干，再加入l〇〇〇mL20%哌啶/DMF溶液，在25°C攪拌20分鐘，真空抽干， 用DMF洗滌一次，甲醇洗滌兩次，DMF洗滌一次，二氯甲烷洗滌一次，真空抽干"WFm〇C-Arg(Pbf)-0H(165. 4mmol) 107. 3g，1-羥基苯并三氮唑（330. 8mmol)44. 7g，800mLDMF/ 二 甲亞砜（即DMF和二甲基亞砜的混合溶劑，體積比為5:3)，加入N，N-二異丙基碳二亞胺 (330. 8mmol)51. 8mL，將混合物在28°C攪拌16. 5小時(shí)，茚三酮和四氯苯醌檢測(cè)均呈微弱陽 性，真空抽干，甲醇洗滌一次，DMF洗滌兩次，真空抽干。加吡啶（165. 4mmol) 13. 3.mL，醋酸 酐（165. 4mmol) 15. 6mL，800mLDMF，將混合物在27°C攪拌1小時(shí)，茚三酮和四氯苯醌檢測(cè)均 呈陰性，真空抽干，用DMF、甲醇、DMF、DMF依次洗滌，真空抽干。Pbf為2, 2, 4, 6, 7-五甲基 二氫苯并呋喃-5-磺酰基。
[0161] 實(shí)施例18-4(溶劑為DMF/二氯甲烷，S卩DMF和二氯甲烷的混合溶劑）=Fmoc-Arg( Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-P r〇-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu) -Leu-Wang樹脂（肽樹脂 18)的制備
[0162] 實(shí)施例17制得的肽樹脂（17)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25°C攪拌10分 鐘，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25°C攪拌20分鐘，真空抽干，用DMF洗 漆一次，甲醇洗漆兩次，DMF洗漆一次，二氯甲燒洗漆一次，真空抽干。加Fmoc-Arg(Pbf)-OH (165.4臟〇1)107.3§，1-羥基苯并三氮唑（330.8臟〇1)44.7 §，80011^01^/二氯甲烷（即01^ 和二氯甲烷的混合溶劑，體積比為5:4)，加入N，N-二異丙基碳二亞胺（330. 8mmol) 51. 8mL， 將混合物在28°C攪拌26小時(shí)，茚三酮和四氯苯醌檢測(cè)均呈弱陽性，真空抽干。加吡啶 (165. 4mmol) 13. 3.mL，醋酸酐（165. 4mmol) 15. 6mL，800mLDMF，將混合物在 27°C攪拌 2 小時(shí)， 茚三酮和四氯苯醌檢測(cè)均呈陰性，真空抽干，用DMF、甲醇、DMF、DMF依次洗滌，真空抽干。 Pbf為2, 2, 4, 6, 7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基。
[0163] 實(shí)施例19:
[0164]Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu( OtBu)-Glu(OtBu) -Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu) -Leu-Wang樹脂（膚樹脂 19) 的制備
[0165] 實(shí)施例18制得的肽樹脂（18)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25 °C攪 拌10分鐘，真空抽干，再加入l〇〇〇mL20%哌啶/DMF溶液，在25 °C攪拌20分鐘，真空抽 干，用DMF洗滌一次，甲醇洗滌兩次，DMF洗滌一次，二氯甲烷洗滌一次，真空抽干。加 Fmoc-Pro-OH(165. 4mmol) 55. 8g，1-羥基苯并三氮唑（330. 8mmol) 44. 7g，800mLDMF，加入 N，N-二異丙基碳二亞胺（330. 8mmol) 51. 8mL，將混合物在28°C攪拌3小時(shí)，茚三酮檢測(cè)呈陰 性，真空抽干，甲醇洗滌一次，DMF洗滌兩次，真空抽干。
[0166] 實(shí)施例20:
[0167]Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe -Glu(OtBu)-Glu(OtBu) -Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu) -Leu-Wang樹脂（膚樹 月旨20)的制備
[0168] 實(shí)施例19制得的肽樹脂（19)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25 °C攪 拌10分鐘，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25°C攪拌20分鐘，真空抽 干，用DMF洗滌一次，甲醇洗滌兩次，DMF洗滌一次，二氯甲烷洗滌一次，真空抽干。加 Boc-D-Phe-OH(165. 4mmol) 43. 9g，1-羥基苯并三氮唑（330. 8mmol) 44. 7g，800mLDMF，加入 N，N-二異丙基碳二亞胺（330. 8mmol) 51. 8mL，將混合物在25°C攪拌3小時(shí)，茚三酮和四氯苯 醌檢測(cè)均呈陰性，真空抽干，DMF洗滌一次，甲醇洗滌一次，DMF洗滌兩次，甲醇洗滌三次，真 空抽干。真空干燥至恒重，得保護(hù)比伐蘆定多肽樹脂344. 7g。Boc為叔丁氧羰基。
[0169] 實(shí)施例21:
[0170] H-D-Phe-Pro-Arg-Pr〇-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pr〇-G Iu-Glu-Tyr-Leu-OH(比伐蘆定）的制備
[0171] 按三氟乙酸：三異丙基硅烷：水=95:2. 5:2. 5 (體積比）配制溶液2. 5L，降溫至 4°C，在攪拌的情況下，將344. 7g的肽樹脂（20)加入到上述溶液中，26°C攪拌3小時(shí)。過濾， 濾液通過減壓蒸餾濃縮，將比伐盧定粗品濃縮液加到〇°C甲基叔丁基醚中沉淀，離心沉降收 集到181. 5比伐蘆定粗品，HPLC純度為79%。將比伐蘆定粗品用5%乙腈/水(體積比）溶 解，配成15g/L，利用制備型高效液相在0. 1%三氟乙酸/水(體積比)和0. 1%三氟乙酸/乙 腈(體積比）梯度洗脫，分部收集需要的組分并檢測(cè)，將合格的組分經(jīng)減壓旋蒸濃縮并除乙 腈，最后經(jīng)冷凍干燥得HLPC純度99. 1%的比伐蘆定三氟乙酸鹽純品。
[0172] 實(shí)施例22:比伐蘆定粗品、純品HPLC檢測(cè)方法，質(zhì)譜鑒定方法及結(jié)果。
[0173] 試驗(yàn)所得的粗品及純品均按以下分析方法：
[0174] 儀器：Waters2695
[0175]色譜柱：Diamonsil_C18, 4. 6*250mm, 5 um;流速：I. OmT,/mi n;檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm
[0176] 流動(dòng)相A:20mM磷酸二氫鉀水溶液（pH3. 0);流動(dòng)相B:90%乙腈水溶液
[0177]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種肽樹脂18的固相合成方法，其特征在于包括以下步驟：步驟1，在非質(zhì)子極性溶 劑中，將有機(jī)堿與肽樹脂17進(jìn)行脫除脯氨酸芴甲氧羰?；被Ｗo(hù)基的反應(yīng)，得到肽樹脂 17' ；所述的膚樹脂 17 為 Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R 5)-Glu (R6) -Ile-Pro-Glu (R7) -Glu (R8) -Tyr (R9) -Leu-Rltl ;所述的肽樹脂 17' SH-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (R3) -Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R5) -Glu (R6) -I le-Pro-Glu (R7) -Glu (R8) -Tyr (R9)-Leu-R10 ； 步驟2,在非質(zhì)子極性溶劑中，縮合劑和催化劑存在的條件下，將步驟1中制得的肽樹 脂17'與Fmoc-Arg (R2)-OH進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到肽樹脂18 ;所述的肽樹脂18為Fmoc-Arg (R2 )-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (R3) -Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R5) -Glu (R6) -Ile-Pro-Glu (R7) -G Iu (R8) -Tyr (R9) -Leu-R10 ； 其中，R2為胍基保護(hù)基；R3為酰胺保護(hù)基；R4、R5、R 6、R7和R8各自獨(dú)立的為羧基保護(hù)基； R9為酚羥基保護(hù)基；Leu-Rltl為Trityl-Cl類型樹脂或羥基類型樹脂與亮氨酸中的羧基縮合 后的基團(tuán)； 步驟1或步驟2中，所述的非質(zhì)子極性溶劑為N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷的混合溶 劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的肽樹脂18的固相合成方法，其特征在于： 所述的R2為2, 2, 4, 6, 7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?-甲氧基-2, 3, 6-三甲基 苯磺?；?, 2, 5, 7, 8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?； 和/或， 所述的R3為三苯甲基、2, 4, 6-三甲氧基芐基或4-甲基三苯甲基； 和/或， 所述的R4、R5、R6、R7和R8各自獨(dú)立的為叔丁基或金剛烷基； 和/或， 所述的R9為叔丁基或2-氯三苯甲基。
3. 如權(quán)利要求1所述的肽樹脂18的固相合成方法，其特征在于： 所述的TrityI-Cl類型樹脂為2-氯三苯甲基樹脂；所述的羥基類型樹脂為wang樹脂。
4. 如權(quán)利要求1所述的肽樹脂18的固相合成方法，其特征在于： 所述的N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷的混合溶劑中，所述的N，N-二甲基甲酰胺與所 述的二氯甲烷的體積比為3:1?3:10。
5. 如權(quán)利要求1所述的肽樹脂18的固相合成方法，其特征在于：在所述的肽樹脂18的 步驟1中，所述的非質(zhì)子極性溶劑與所述的肽樹脂17的摩爾比為100:1?200:1。
6. 如權(quán)利要求1所述的肽樹脂18的固相合成方法，其特征在于：在所述的肽樹脂18的 步驟2中，所述的非質(zhì)子極性溶劑與所述的肽樹脂17'的摩爾為100:1?200:1。
7. 如權(quán)利要求1所述的肽樹脂18的固相合成方法，其特征在于：在所述的肽樹脂18 的步驟1中，所述的有機(jī)堿為哌啶；所述的有機(jī)堿與所述的肽樹脂17的摩爾比為10:1? 50:1 ;所述的脫除脯氨酸芴甲氧羰?；被Ｗo(hù)基的反應(yīng)的溫度為22°C?28°C。
8. 如權(quán)利要求1所述的肽樹脂18的固相合成方法，其特征在于： 在所述的肽樹脂18的步驟2中，所述的縮合劑為N，N-二異丙基碳二亞胺、二環(huán)己基碳 二亞胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲 六氟磷酸鹽；所述的縮合劑與所述的Fmoc-Arg(R2)-OH的摩爾比為1:1?1:3。
9. 如權(quán)利要求1所述的肽樹脂18的固相合成方法，其特征在于： 在所述的肽樹脂18的步驟2中，所述的催化劑為1-羥基苯并三氮唑和/或6-氯-1-羥 基苯并三氮唑；所述的催化劑與所述的Fmoc-Arg (R2)-OH的摩爾比為1:1?1:4 ;所述的肽 樹脂17'與所述的Fmoc-Arg (R2) -OH的摩爾比為1:1?1: 5。
10. 如權(quán)利要求1所述的肽樹脂18的固相合成方法，其特征在于： 在所述的肽樹脂18的步驟2中，所述的縮合反應(yīng)的溫度為22°C?28°C。
【專利摘要】本發(fā)明公開了比伐蘆定中間體的固相合成方法。本發(fā)明提供了肽樹脂18的固相合成方法：步驟1，非質(zhì)子極性溶劑中，將有機(jī)堿與肽樹脂17進(jìn)行脫除脯氨酸芴甲氧羰?；被Ｗo(hù)基的反應(yīng)，得到肽樹脂17’；步驟2，在非質(zhì)子極性溶劑中，縮合劑和催化劑存在的條件下，將步驟1中制得的肽樹脂17’與Fmoc-Arg(R2)-OH進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到肽樹脂18；所述的非質(zhì)子極性溶劑為N,N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷的混合溶劑。本發(fā)明的固相合成方法可促進(jìn)大位阻的氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH順利完成縮合反應(yīng)，工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、縮合率達(dá)到84%～100%、生產(chǎn)成本低、適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類】C07K1-04, C07K14-815, C07K1-06
【公開號(hào)】CN104558162
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310505089
【發(fā)明人】江錫銘, 丁金國(guó), 黃臻輝
【申請(qǐng)人】上海第一生化藥業(yè)有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2013年10月23日