比伐蘆定中間體的固相合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及比伐蘆定中間體的固相合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝血酶是胰蛋白酶樣高度特異的絲氨酸蛋白酶，催化活性位點為作用于精氨酸殘 基的特異性袋狀結(jié)構(gòu)。除活性位點外，凝血酶上還有陰離子結(jié)合位點識別纖維蛋白原或肝 素。凝血酶在生理止血過程中起核心作用。水蛭素是天然存在的活性最強的凝血酶抑制蛋 白，由65個氨基酸組成，含硫酸化酪氨酸，和凝血酶通過二價結(jié)合形成特異緊密的1:1復(fù)合 物。水蛭素由N-端含緊密核心結(jié)構(gòu)域與C-端延展帶負電結(jié)構(gòu)域組成，C-端結(jié)構(gòu)域識別陰 離子結(jié)合位點后導(dǎo)致凝血酶發(fā)生微小的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，隨后N-端結(jié)構(gòu)域與催化位點及鄰近的 非極性區(qū)域結(jié)合，將十肽環(huán)狀結(jié)構(gòu)擠出活性位點。
[0003] 凝血酶活性位點抑制劑與陰離子結(jié)合位點抑制劑有協(xié)同效應(yīng)，1990年 Maraganore,Feton和Kline在美國專利US5196404中，據(jù)此設(shè)計了凝血酶二價抑制劑比 伐蘆定=H-D-Phel-Pro2-Arg3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn9-Glyic1-Asp11-Phe12-Glu13-G lu14-Ile15-Pro16-Glu17-Glu18-Tyr19_Leu2°-〇H。C-端 12 肽為水蛭素片段，能夠結(jié)合陰離子 結(jié)合位點；N-端四肽D-Phe1-Pro2-Arg3-Pro4與活性位點結(jié)合；中間用四個連續(xù)的甘氨酸 Gly5-Gly6-Gly7-Gly8連接。因其Arg3-Pro4會被凝血酶緩慢水解而游離出活性位點，故為可 逆性二價凝血酶直接抑制劑。比伐蘆定自2000年上市以來臨床應(yīng)用成長迅速，在美國的冠 脈介入手術(shù)中已取代肝素成為主導(dǎo)用藥（Nat.Rev.DrugDisc. 2009;V0I8:353-354)。
[0004] 比伐蘆定是含20個氨基酸殘基的多肽，固相、液相合成技術(shù)都被嘗試用于比伐蘆 定的合成。液相合成的優(yōu)點是每步中間產(chǎn)物的合成可以直接進行過程控制，并有機會得以 純化；缺點是工藝復(fù)雜，占用較多工時與人力，需要較多設(shè)備與場地。固相合成工藝簡單，占 用工時與人力較少，物料轉(zhuǎn)移較少而節(jié)省設(shè)備與場地；其缺點是每步中間產(chǎn)物不可以純化， 必須優(yōu)化各步反應(yīng)條件使得轉(zhuǎn)化率接近100%、而且盡可能避免副反應(yīng)的發(fā)生。比伐蘆定的 合成中需要將體積龐大的保護精氨酸與Pro的亞氨基縮合，導(dǎo)致比伐蘆定中Arg3-Pro4縮合 不完全。這不利于工藝過程中反應(yīng)終點的控制，也在合成產(chǎn)物中引入了雜質(zhì)、增加了純化難 度。使用Fmoc-Arg(Pbf)-Opfp,Fmoc為9-莉甲氧羰基，Pbf為2, 2, 4,6, 7-五甲基二氫苯 并呋喃-5-磺?；琌pfp為五氟苯酯，通過12小時以上的長時間反應(yīng)能夠改善縮合不完全 問題。先合成二肽中間體為Fmoc-Arg(Pbf) -Pro-OH，再用中間體進行縮合反應(yīng)，來避開該縮 合難點。也有人發(fā)現(xiàn)使用5. 5-6. 5倍過量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH有助于該縮合反應(yīng)的進行。 我們的實驗表明增加投料量、延長反應(yīng)時間、重復(fù)縮合并不能達到縮合完全。
[0005] 針對固相合成工藝中Arg3-Pro4位點的縮合困難問題，有專利使用五氟苯酯 Fmoc-Arg(Pbf)-Opfp來改善縮合不完全問題，但需要長達12小時的縮合反應(yīng)。有專利使用 二肽中間體Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-OH來回避縮合困難，但需要復(fù)雜工藝制備二肽中間體。有 專利通過提高Fmoc-Arg(Pbf)-OH的投料量來推動反應(yīng)，這樣會增加物料成本，更重要的是 該方法對Wang樹脂效果不佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有比伐蘆定固相合成工藝中，Arg3-Pro4 位點的縮合困難、反應(yīng)時間長、轉(zhuǎn)化率低、收率低、反應(yīng)工藝復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻、生產(chǎn)成本 高、不利于工業(yè)化生產(chǎn)等缺陷，而提供了比伐蘆定中間體的固相合成方法。本發(fā)明的固相合 成方法可促進大位阻的氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH進行縮合反應(yīng)，實現(xiàn)了比伐蘆定的高載 樣量合成，縮合收率可達到84%?100%，反應(yīng)工藝簡單、反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、收率高、 生產(chǎn)成本低、適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007] 本發(fā)明提供了一種肽樹脂18的固相合成方法，其包括以下步驟：
[0008] 步驟1，在非質(zhì)子極性溶劑中，將有機堿與肽樹脂17進行脫除脯氨酸芴甲氧羰酰 基氨基保護基的反應(yīng)，得到肽樹脂17' ；所述的肽樹脂17為Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-A sn(R3) -Gly-Asp(R4) -Phe-Glu(R5)-Glu(R6) -Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9) -Leu-R10 ;所 述的肽樹脂17,為H-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3) -Gly-Asp(R4) -Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-I Ie-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9) -Leu-R10 ；
[0009] 步驟2,在非質(zhì)子極性溶劑中，縮合劑和催化劑存在的條件下，將步驟1中制得的 肽樹脂17'與Fmoc-Arg(R2)-OH進行縮合反應(yīng)，得到肽樹脂18 ;所述的肽樹脂18為Fmoc-A rS(R2) -Pr〇-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3) -Gly-Asp(R4) -Phe-Glu(R5)-Glu(R6) -Ile-Pro-Glu( R7)-Glu(R8)-Tyr(R9) -Leu-R10 ；
[0010] 其中，R2為胍基保護基，所述的胍基保護基可以為本領(lǐng)域中對胍基進行保護的常 規(guī)保護基，優(yōu)選2, 2, 4, 6, 7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?-甲氧基-2, 3, 6-三甲基苯 磺?；?, 2, 5, 7, 8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；籖3為酰胺保護基，所述的酰胺基保 護基可以為本領(lǐng)域中對酰胺基進行保護的常規(guī)保護基，優(yōu)選三苯甲基、2, 4, 6-三甲氧基芐 基或4-甲基三苯甲基；&、1?5、1?6、1?7和R8各自獨立的為羧基保護基，所述的羧基保護基可以 為本領(lǐng)域中對羧基進行保護的常規(guī)保護基，優(yōu)選叔丁基或金剛烷基；R9為酚羥基保護基，所 述的酚羥基保護基可以為本領(lǐng)域中對酚羥基進行保護的常規(guī)保護基，優(yōu)選叔丁基或2-氯 三苯甲基；Leu-Rltl為Trityl-Cl類型樹脂或羥基類型樹脂與亮氨酸中的羧基縮合后的基 團；優(yōu)選羥基類型樹脂，更優(yōu)選wang樹脂。
[0011] 在制備所述的肽樹脂18的步驟1中，假設(shè)肽樹脂17由具有具體摩爾量的起始原 料完全轉(zhuǎn)化得到，因此，制備過程中使用的各個試劑的用量均依據(jù)該具有具體摩爾量的起 始原料計算得到。
[0012] 在制備所述的肽樹脂18的步驟1或步驟2中，所述的非質(zhì)子極性溶劑優(yōu)選酰胺 類溶劑、酮類溶劑、亞砜類溶劑和齒代烴類溶劑中的一種或多種；所述的酰胺類溶劑優(yōu)選 N，N'_二甲基甲酰胺（DMF);所述的酮類溶劑優(yōu)選N-甲基吡咯烷酮（NMP);所述的亞砜類溶 劑優(yōu)選二甲基亞砜（DMSO);所述的鹵代烴類溶劑優(yōu)選氯代烴類溶劑；所述的氯代烴類溶劑 優(yōu)選二氯甲烷；所述的非質(zhì)子極性溶劑進一步優(yōu)選酰胺類溶劑和/或酮類溶劑，酰胺類溶 劑和/或亞砜類溶劑，酰胺類溶劑和/或齒代烴類溶劑，酮類溶劑和/或亞砜類溶劑，酰胺 類溶劑、酮類溶劑和亞砜類溶劑的混合溶劑，酰胺類溶劑、酮類溶劑和齒代烴類溶劑的混合 溶劑，或者，酰胺類溶劑、亞砜類溶劑和齒代烴類溶劑的混合溶劑。所述的酰胺類溶劑和酮 類溶劑的混合溶劑優(yōu)選N，N'_二甲基甲酰胺（DMF)和N-甲基吡咯烷酮的混合溶劑；所述的 酰胺類溶劑和亞砜類溶劑的混合溶劑優(yōu)選N，N'_二甲基甲酰胺（DMF)和二甲基亞砜（DMSO)的混合溶劑；所述的酰胺類溶劑和鹵代烴類溶劑的混合溶劑優(yōu)選N，N-二甲基甲酰胺（DMF) 和二氯甲烷（DCM)的混合溶劑；所述的酮類溶劑和亞砜類溶劑的混合溶劑優(yōu)選N-甲基吡咯 烷酮（NMP)和二甲基亞砜（DMSO)的混合溶劑；所述的酰胺類溶劑、酮類溶劑和亞砜類溶劑 的混合溶劑優(yōu)選N，N' -二甲基甲酰胺（DMF)、N-甲基吡咯烷酮（NMP)和二甲基亞砜（DMSO) 的混合溶劑；所述的酰胺類溶劑、酮類溶劑和鹵代烴類溶劑的混合溶劑優(yōu)選N，N' -二甲基 甲酰胺（DMF)、N-甲基吡咯烷酮（NMP)和二氯甲烷（DCM)的混合溶劑；所述的酰胺類溶劑、亞 砜類溶劑和鹵代烴類溶劑的混合溶劑優(yōu)選N，N' -二甲基甲酰胺（DMF)、二甲基亞砜（DMSO) 和二氯甲烷（DCM)的混合溶劑。
[0013] 當采用酰胺類溶劑和酮類溶劑的混合溶劑時，所述的酰胺類溶劑與所述的酮類溶 劑的體積比優(yōu)選3:1?3:10 ;當采用酰胺類溶劑和亞砜類溶劑的混合溶劑時，所述的酰胺 類溶劑與所述的亞砜類溶劑的體積比優(yōu)選3:1?3:10 ;當采用酰胺類溶劑和鹵代烴類溶劑 的混合溶劑時，所述的酰胺類溶劑與所述的鹵代烴類溶劑的體積比優(yōu)選3:1?3:10 ;當采 用酮類溶劑和亞砜類溶劑的混合溶劑時，所述的酮類溶劑與所述的亞砜類溶劑的體積比優(yōu) 選 1:10 ?10:1 ;
[0014] 當采用所述的酰胺類溶劑、酮類溶劑和亞砜類溶劑的混合溶劑時，所述的酰胺類 溶劑、所述酮類溶劑和所述的亞砜類溶劑的體積比優(yōu)選3 :(1?10) :(1?10)，進一步優(yōu) 選3:(1?5):(1?5)，再進一步優(yōu)選3:1:1或3:1:2 ;當采用所述的酰胺類溶劑、酮類溶 劑和鹵代烴類溶劑的混合溶劑時，所述的酰胺類溶劑、所述的酮類溶劑和所述的鹵代烴類 溶劑的體積比優(yōu)選3 :(1?10) :(1?10);當采用所述的酰胺類溶劑、亞砜類溶劑和鹵代 烴類溶劑的混合溶劑時，所述的酰胺類溶劑、所述的亞砜類溶劑和所述的齒代烴類溶劑的 體積比優(yōu)選3 :(1?10) :(1?10)。
[0015] 在制備所述的肽樹脂18的步驟1中，所述的溶劑與所述的肽樹脂17的摩爾比優(yōu) 選 100:1 ?200:1，進一步優(yōu)選 120:1 ?160:1。
[0016] 在制備所述的肽樹脂18的方法步驟1中，所述的有機堿可以為本領(lǐng)域中該類脫除 脯氨酸芴甲氧羰?；被Ｗo基的反應(yīng)的常規(guī)有機堿，優(yōu)選哌啶。
[0017] 在制備所述的肽樹脂18的方法步驟1中，所述的有機堿與所述的肽樹脂17的摩 爾比優(yōu)選10:1?50:1，進一步優(yōu)選20:1?30:1。
[0018] 在制備所述的肽樹脂18的方法步驟1中，所述的脫除脯氨酸芴甲氧羰?；被?護基的反應(yīng)的溫度，可以為本領(lǐng)域中該類脫除脯氨酸芴甲氧羰?；被Ｗo基的反應(yīng)的常 規(guī)溫度，優(yōu)選22°C?28°C。
[0019] 在制備所述的肽樹脂18的步驟2中，所述的非質(zhì)子極性溶劑與所述的肽樹脂17' 的摩爾比優(yōu)選100:1?200:1，進一步優(yōu)選120:1?140:1。
[0020] 在制備所述的肽樹脂18的方法步驟2中，所述的縮合劑可以采用本領(lǐng)域中該類縮 合反應(yīng)中的常規(guī)縮合劑，優(yōu)選N，N-二異丙基碳二亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、六氟磷酸苯并 三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷和苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脲六氟磷酸鹽中的一種 或多種。
[0021] 在制備所述的肽樹脂18的方法步驟2中，所述的縮合劑與所述的 Fmoc-Arg (R2)-OH的摩爾比優(yōu)選1:1?1:3,進一步優(yōu)選1:1?1: 2。
[0022] 在制備所述的肽樹脂18的方法步驟2中，所述的催化劑可以采用本領(lǐng)域中該類縮 合反應(yīng)中的常規(guī)催化劑，優(yōu)選1-羥基苯并三氮唑和/或6-氯-1-羥基苯并三氮唑。
[0023] 在制備所述的肽樹脂18的方法步驟2中，所述的催化劑與所述的 Fmoc-Arg(R2) -OH的摩爾比優(yōu)選1:1?1:4,進一步優(yōu)選1:2?1: 3。
[0024] 在制備所述的肽樹脂18的方法步驟2中，所述的肽樹脂17'與所述的 Fmoc-Arg(R2)-OH的摩爾比優(yōu)選1:1?1:5,進一步優(yōu)選1:1?1:2。
[0025] 在制備所述的肽樹脂18的方法步驟2中，所述的縮合反應(yīng)的溫度可以采用本領(lǐng)域 中該類縮合反應(yīng)的常規(guī)溫度，優(yōu)選22°C?28°C。
[0026] 在制備所述的肽樹脂18的方法步驟2中，所述的縮合反應(yīng)的進程可以采用本領(lǐng)域 中的常規(guī)測試方法(如茚三酮檢測顯弱陽性和/或四氯苯醌檢測顯弱陽性）進行監(jiān)控，反應(yīng) 時間優(yōu)選Ih?30h，進一步優(yōu)選3h?26h。
[0027] 在制備所述的肽樹脂18的方法步驟2反應(yīng)結(jié)束后，得到的產(chǎn)物還可以通過后處理 步驟進行純化。所述的后處理步驟采用的方法和條件可按本領(lǐng)域常規(guī)的此類反應(yīng)的后處 理步驟的方法和條件進行，一般包括如下步驟：將反應(yīng)體系真空抽干，與吡啶、醋酸酐以及 N，N-二甲基甲酰胺（DMF)混合，于27°C攪拌，當茚三