一種運(yùn)用花粉管通道轉(zhuǎn)化技術(shù)培育耐鹽水稻的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種培育耐鹽水稻的方法，屬于植物育種技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說是一 種運(yùn)用花粉管通道轉(zhuǎn)化技術(shù)培育耐鹽水稻的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 土壤的鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境的一個(gè)嚴(yán)重問題。我國的耕地總面積19. 5 億畝，其中20%存在著不同程度的鹽漬化和次生鹽漬化，灘涂共計(jì)1.4億多畝。此外還有 5. 2億畝內(nèi)陸鹽堿化土壤，其中鹽堿地1. 5億畝。人們?cè)噲D通過合理的排灌、淡水洗滌、施 用化學(xué)改良劑等方式來改造鹽堿地，但常因耗資巨大，見效少而難以推廣。于是把目光轉(zhuǎn) 向發(fā)掘和培育耐鹽作物方面。國內(nèi)外在培育耐鹽水稻新品種方面，主要集中在兩個(gè)方面：
[0003] -是對(duì)地方農(nóng)家水稻品種進(jìn)行篩選，馴化成具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的耐鹽品種，但由于水 稻品種具有特殊多樣化的生態(tài)條件，適應(yīng)性相對(duì)較窄的特點(diǎn)，因此篩選出來的耐鹽資源大 多沒能在實(shí)踐中得到有效利用，更沒有進(jìn)入鹽堿地區(qū)進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用，目前，我國沿海灘涂和 鹽堿地主要是中低產(chǎn)田，適合我國種植的耐鹽水稻很少，水稻畝產(chǎn)量只有200公斤左右。
[0004] 二是隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，借助生物技術(shù)和雜交育種，改造并提高水稻的 耐鹽性，培育耐鹽新品種日益成為熱點(diǎn)。目前已有一些導(dǎo)入單個(gè)基因提高植物耐鹽性的報(bào) 道，如通過基因工程手段，使植物細(xì)胞產(chǎn)生和積累某些低分子有機(jī)化合物，如甜菜堿、脯胺 酸、糖醇類等以維持滲透勢(shì)平衡和體內(nèi)水分，能在一定程度上提高植物的耐鹽性，但目前 大多還處于實(shí)驗(yàn)室研宄階段。突出的例子是陳受宜等轉(zhuǎn)入甜菜堿脫氫酶（BADH)基因的水 稻，經(jīng)鹽脅迫篩選得到轉(zhuǎn)化植株在0. 5%NaCl的鹽池中多數(shù)生長基本正常，但結(jié)實(shí)率僅為 10%。目前還沒有得到真正意義上的耐鹽水稻作物，其原因主要是植物的耐鹽機(jī)制十分復(fù) 雜，是一種數(shù)量性狀，受多基因控制，因此轉(zhuǎn)移單個(gè)基因往往只能獲得部分耐鹽性，要獲得 具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的耐鹽作物可能需要同時(shí)轉(zhuǎn)移多個(gè)基因，而目前在識(shí)別和分離耐鹽基因以及 同時(shí)操作多個(gè)基因方面尚有很大困難。
[0005] 自從上世紀(jì)50年代聯(lián)合國教科文組織提出耐鹽植物開發(fā)研宄的方向以來，鹽土 農(nóng)業(yè)作為一種新興的農(nóng)業(yè)模式正在逐漸興起。2013年4月，國際水稻研宄所稱，通過野生稻 種雜交已經(jīng)培育出一種新型耐鹽水稻，可以在海水侵蝕的濱海土地種植，但目前仍處于對(duì) 品種性能進(jìn)行改進(jìn)和評(píng)定的階段，若要田間試種至少還需4到5年（參見Salt-tolerant ricebredatPhilippinesinstituteApr16,2013)。日本理化學(xué)研宄所嘗試用重離 子培育耐鹽水稻，但目前也還處于實(shí)驗(yàn)室研宄階段。另有報(bào)道，泰國國家遺傳工程和生 物技術(shù)中心植物細(xì)胞技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的主任ChalermpolKirdmanee2001年在實(shí)驗(yàn)室中發(fā)現(xiàn) 了 4株能耐2%NaCl的泰國香水稻，但是一直沒有關(guān)于最新進(jìn)展的后續(xù)相關(guān)報(bào)道（參見 Transcriptionalregulationsofthegenesofstarchmetabolismandphysiological changesinresponsetosaltstressrice(OryzasativaL)seedlings)，2005 年中國 科學(xué)院上海生科院植物生理生態(tài)所宣布：水稻耐鹽功能基因研究在滬取得重大突破性進(jìn) 展。該所與美國專家合作，成功克隆了與水稻耐鹽相關(guān)的數(shù)量性狀基因，但距離實(shí)際應(yīng)用 尚需時(shí)曰。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種運(yùn)用花粉管通道轉(zhuǎn)化技術(shù)培育耐鹽水稻的方法，該方法 中運(yùn)用花粉管通道技術(shù)將鹽生植物的總DNA轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)超遠(yuǎn)緣遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，能同時(shí)導(dǎo) 入多個(gè)基因，達(dá)到耐鹽植物分子育種的目的。
[0007]本發(fā)明為一種運(yùn)用花粉管通道轉(zhuǎn)化技術(shù)培育耐鹽水稻的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)提取鹽生植物蘆葦葉片DNA作為供體；
[0009] (2)取水稻9311、鹽559、7海76、7海74作為受體，在盛花期選擇正在開花的稻 穗，去除未開過的穎花和已開過的穎花，每穗只留下當(dāng)天剛開的穎花約20朵；1. 5?2. 0小 時(shí)后剪去小穗內(nèi)穎，并將1/3?1/2的花柱連同柱頭一起剪去；立即用微量注射器在剛剪去 柱頭的花柱切面上滴注含外源DNA溶液2?3yL;注射時(shí)間：水稻開花后1?3小時(shí)進(jìn)行， DNA溶液濃度是250?300yg/ml，導(dǎo)入量是10-20y1，套上雜交袋以防止水份蒸發(fā)，25? 30天后收獲％代種子；
[0010] (3)收獲的％代種子全部播種，經(jīng)觀察，各導(dǎo)入系基本無變異或變異不明顯，分別 全收各株的種子為種子；
[0011] (4)將0:代種子分為兩組，第一組在含鹽分濃度為5%。的塑料盆中進(jìn)行種子發(fā)芽 和育苗，對(duì)種子進(jìn)行耐鹽性篩選，選留健壯幼苗移栽到普通無鹽大田，進(jìn)行常規(guī)栽培，觀察 變異情況，選留生長正常的單株收種；第二組種子則種植于普通水田內(nèi)發(fā)芽和育苗以及全 過程生長，選留變異株，進(jìn)行單株收種；鹽篩和非鹽篩所選留的各單株收種稱為％代種子；
[0012] (5)將收獲的D2種子再在鹽池鹽度為4%。?5%。的條件下進(jìn)行耐鹽性篩選，以未導(dǎo) 入外源DNA的受體作為對(duì)照，進(jìn)行水稻生長的耐鹽性和產(chǎn)量品質(zhì)性狀的篩選鑒定，篩選生 長正常的單株，收獲〇 3代種子；
[0013] (6)將收獲的D3代種子在鹽池鹽度為4%。?5%。的條件下進(jìn)行耐鹽性篩選，以未導(dǎo) 入外源DNA的受體作為對(duì)照，進(jìn)行水稻生長的耐鹽性和產(chǎn)量品質(zhì)性狀的篩選鑒定，篩選生 長正常的單株，收獲比代種子；
[0014] (7)在鹽池鹽度為5%。的條件下進(jìn)行多代篩選，直至D6代植株基本穩(wěn)定；
[0015] (8)同時(shí)，培育出與雙8S/海湘4號(hào)C815S雜交獲得F#植株；
[0016] (9)將收獲的D6代株系的種子與獲得的Fi代單株種子分別在鹽分為2%。和4%。、 6%。不同梯度的江蘇鹽城灘涂鹽地中進(jìn)行田間試種，選育出耐鹽性高、生長好、產(chǎn)量高的新 品種或新品系，以未導(dǎo)入外源DNA的受體作為對(duì)照；
[0017] (10)次年，將新品系或新品種在鹽分為3%。-4%。的江蘇鹽城灘涂鹽地中進(jìn)行50畝 "耐鹽水稻高產(chǎn)示范區(qū)"中展示，以未導(dǎo)入外源DNA的受體作為對(duì)照，進(jìn)行水稻生長的耐鹽性 和產(chǎn)量品質(zhì)性狀的篩選鑒定。
[0018]在本發(fā)明中，由該方法得到的耐鹽水稻新品種或新品系的新的DNA片段，其編碼 序列為序列表1中所示。
[0019] 綜上所述，本發(fā)明運(yùn)用花粉管通道技術(shù)將鹽生植物的總DNA轉(zhuǎn)移的方法，操作簡 單，具有無基因型限制和易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模基因轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)，可以在任何開花植物和不同物 種之間實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移，并省略了組織培養(yǎng)過程，避免了植物組織培養(yǎng)過程中可能產(chǎn)生的 各種無法預(yù)測的不利影響，能同時(shí)導(dǎo)入多個(gè)基因，達(dá)到耐鹽植物分子育種的目的。
[0020] 本發(fā)明的的有益效果為：
[0021] (1)供體材料新。從發(fā)掘、搜集的十余種鹽生植物種質(zhì)資源中選出蘆葦，是培育創(chuàng) 制耐鹽水稻的核心種質(zhì)材料；以鹽生植物蘆葦總DNA作為供體材料，區(qū)別于克隆分離單個(gè) 耐鹽相關(guān)基因轉(zhuǎn)化受體植物；
[0022] (2)導(dǎo)入方法新。盡管以前有人通過花粉管通道將外源基因?qū)胫参?，但就其固?的研宄目的和操作細(xì)節(jié)而言都與本發(fā)明所述的大不相同。本發(fā)明建立了關(guān)于水稻的程序化 導(dǎo)入方法。通過花粉管通道導(dǎo)入蘆葦總DNA進(jìn)行耐鹽水稻育種是首次應(yīng)用；
[0023] (3)篩選方法新、效果明顯。該鹽篩方法是先將種子鹽篩；幼苗至全生育期在人工 鹽池篩選；大田選育；鹽灘田間種植成功，可以逐步進(jìn)入鹽灘地大田生產(chǎn)中應(yīng)用；一般轉(zhuǎn)基 因植物在實(shí)驗(yàn)室可能有一定的耐鹽性，而一旦進(jìn)入大田中其耐鹽性狀就不明顯了；
[0024] (4)育種周期短。通過常規(guī)育種獲得穩(wěn)定株系一般需要8-10年，而通過該方法培 育的水稻株系僅僅只用了 3-4年就穩(wěn)定了；
[0025] (5)利用本發(fā)明育成的耐鹽水稻新品系耐鹽性好、產(chǎn)量高
[0026] 在2012年5月將培育出的一批性能穩(wěn)定的耐鹽水稻新品系21個(gè)組合或株系，在 江蘇鹽城沿海灘涂進(jìn)行不同梯度鹽分2%。、4%。、6%。（低、中、高）進(jìn)行田間中試，海湘030、 海湘016、海湘121表現(xiàn)突出，育種時(shí)間較一般的常規(guī)育種縮短了一半。2013年，將海湘030、 海湘016、海湘121三個(gè)耐鹽水稻新品系在鹽城沿海灘涂50畝"耐鹽水稻高產(chǎn)示范區(qū)"中展 示，在3%。_4%。鹽分下對(duì)照品種全部死亡絕收而這三個(gè)耐鹽水稻表現(xiàn)優(yōu)異，其中海湘030最 好，株高100厘米左右、整齊一致，畝產(chǎn)達(dá)817斤。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明培育耐鹽水稻及田間中試示意圖；
[0028] 圖2為海湘030、海湘016、海湘121三個(gè)耐鹽水稻新品系在鹽度為3%。的江蘇鹽城 沿海灘涂種植圖，其中030表示海湘030,016表示海湘016,121表示海湘121，對(duì)照株全死 亡；
[0029] 圖3為海湘030、海湘016、海湘121三個(gè)耐鹽水稻新品系在鹽度為6%。一9%。的江 蘇鹽城沿海灘涂種植圖，其中030表示海湘030,016表示海湘016,121表示海湘121，CK為 水稻9311對(duì)照株；
[0030] 圖4為海湘030、海湘016、海湘121三個(gè)耐鹽水稻新品系在3%。一4%。的江蘇鹽城 沿海灘涂50畝"耐鹽水稻高產(chǎn)示范區(qū)"中展示圖；
[0031] 圖5為水稻海湘030的長勢(shì)圖；
[0032] 圖6為轉(zhuǎn)基因水稻植株P(guān)CR擴(kuò)增檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明：
[0034] 下述實(shí)施例中所用的材料，試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0035] -、耐鹽水稻的培育
[0036] 1 ?材料
[0037] 供體：鹽生植物蘆葦
[0038] 受體：水稻9311、鹽恢559、7海76、7海74
[0039] 2.具體操作步驟如下所述：
[0040]