一種粳稻花藥分化培養(yǎng)基配方的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種粳稻花藥分化培養(yǎng)基，具體涉及一種高效率地提高粳稻花藥愈傷 組織綠苗分化率、降低白化率的分化培養(yǎng)基配方，屬于農(nóng)業(yè)科學技術領域。
【背景技術】
[0002] 花藥培養(yǎng)是利用植物組織培養(yǎng)技術，把發(fā)育到一定階段的花藥，通過無菌操作技 術，接種在人工培養(yǎng)基上以改變花藥內(nèi)花粉粒的發(fā)育程序，誘導其分化，并連續(xù)進行有絲分 裂，形成細胞團，進而形成一團無分化的薄壁組織-愈傷組織，或分化成胚狀體，隨后使愈 傷組織分化成完整的植株的過程，因此花藥培養(yǎng)育種也叫單倍體育種。
[0003] 水稻是世界上最重要的糧食作物之一。1968年，日本新關和大野通過花藥離體培 養(yǎng)獲得水稻花粉植株，揭開了人類利用花藥創(chuàng)造水稻新種質(zhì)的序幕，為作物育種開辟了一 條新的有效途徑。隨后，利用該技術選育水稻品種受到各國育種家的普遍重視。水稻花藥 培養(yǎng)育種主要特點表現(xiàn)為縮短育種周期，提高選擇效率，加速有效性狀轉移等。水稻花藥培 養(yǎng)育種已與常規(guī)雜交育種、遠緣雜交育種、誘變育種以及轉基因技術育種相結合，發(fā)展形成 了一套育種技術體系，在傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)向高技術農(nóng)業(yè)的轉化中發(fā)揮著紐帶作用。
[0004] 我國自1970年開始水稻花培技術研宄，1975年天津市農(nóng)科所(現(xiàn)天津市作物所前 身)與中國科學院遺傳所合作，用單倍體育種法育出了兩個花培品種-花育1號和2號，1977 年在日本召開的國際作物育種方法研討會上，大野清春指出花育1號和2號為花藥培養(yǎng)最 早育成的品種。我國實現(xiàn)了花培育種從理論到應用的突破，也促進了國內(nèi)外的花培育種技 術的發(fā)展。隨著花藥培養(yǎng)的遺傳特性、生理生化等不斷深入研宄，現(xiàn)在水稻花藥培養(yǎng)已經(jīng)成 為當今生物技術育種中較為實用、有效的育種新技術，我國水稻花藥培養(yǎng)育種的應用研宄 在國際上一直保持領先地位。
[0005] 花培再生植株的數(shù)量是品種選育的重中之重。由于受培養(yǎng)基組分、材料的差異性 以及培養(yǎng)環(huán)境等的影響，目前花培效率還不夠理想，獲得的再生植株群體小，花培后代的表 現(xiàn)型不充足，這使選擇、利用受到較大的限制?；ㄅ嘀仓甑纳L發(fā)育受很多因素的影響，包 括培養(yǎng)基的改良、附加成分的增減、單倍體的加倍技術、培養(yǎng)條件的改善等等，其目的都在 于提高愈傷組織的誘導率和綠苗的分化率。其中培養(yǎng)基是花藥培養(yǎng)的物質(zhì)基礎，直接關系 到培養(yǎng)物的生長與分化，培養(yǎng)基組分是影響花培效率的一個很重要的因素。培養(yǎng)基各組分 的合適用量，以及它們之間一定的組合關系，可導致花培效率的大幅度提高。繼續(xù)篩選和優(yōu) 化基本培養(yǎng)基，提高培養(yǎng)基選用的針對性，是提高花藥培養(yǎng)力的有效措施；大量的研宄發(fā)現(xiàn) 一些有機附加物可以顯著提高花藥培養(yǎng)力，發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化組合花藥培養(yǎng)有機附加物質(zhì)，可進 一步提高花藥培養(yǎng)力。因此，組合和優(yōu)化培養(yǎng)基組分，摸索出高效的水稻花藥培養(yǎng)基配方是 提高花藥培養(yǎng)效率的關鍵。
[0006] 在多年的粳稻花藥培養(yǎng)的摸索和實踐中，我們不斷優(yōu)化培養(yǎng)基配方，并且不斷嘗 試加入一些提高粳稻綠苗分化率的添加物并組合其種類搭配及濃度，最終摸索出了一種能 夠顯著提高粳稻綠苗分化率、降低白化率的粳稻花藥愈傷組織分化培養(yǎng)基配方。我們的研 宄結果對于進一步推廣和應用水稻單倍體育種和理論研宄無疑有較大的現(xiàn)實意義和實用 價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了種粳稻花藥分化培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配方如下： KNO3 2820 ~3080mg/L，C8H7O2K 1800 ~2000mg/L，（NH4)2SO4 400 ~460mg/L，KH2PO4 320 ~380mg/L，CaCl2 100 ~120mg/L，MgSO4 80 ~90mg/L，Na2-EDTA 30 ~35mg/L， FeSO4* 7H 20 22 ~26mg/L，MnSO4* H 20 2. 8 ~3. 2mg/L，ZnSO4* H 20 1. 2 ~I. 4mg/L，H3BO3 1. 3 ~I. 5mg/L，KI 0? 6 ~0? 7mg/L，CuSO4* 5H 20 0? 04 ~0? 06mg/L，Na2MoO4* 2H 20 0? 14 ~ 0? 18mg/L，CoCl2* 6H 20 0? 14 ~0? 18mg/L，丙三醇 0? 8 ~1.0 mg/L，甘氛酸 L 8 ~2. 2mg/ L，葉酸0.35~0.45mg/L，甲基亞硝基脲LI~1.3mg/L，丙氨酸LI~1.3mg/L，賴氨酸 1.3~1.511^/]^，維生素1314.5~5.511^/]^，維生素136 0.9~1.111^/]^，3-吡啶甲酸0.9~ I. lmg/L，鹿糖23~27g/L，植物凝膠5~6g/L ; NAA 0.045 ~0.055mg/L，6-BA 1.8 ~2.2mg/L，調(diào)環(huán)酸鈣 0.6 ~0.8mg/L，山梨醇 23 ~ 27g/L，L-脯氨酸100~140mg/L，水解蛋白0? 9~I. lg/L，秋水仙堿0? 18~0? 22mg/L， 生物素 〇? 07 ~〇? 09mg/L，PH 5. 8-6. 0。
[0008] 本發(fā)明所述的培養(yǎng)基具有高效率地提高粳稻花藥愈傷組織綠苗分化率、降低白化 率的優(yōu)點，可以顯著提高粳稻花藥培養(yǎng)效率。下面的實施例以及對比實驗可以清楚地反映 本發(fā)明所述培養(yǎng)基的特點。
【具體實施方式】 [0009] 實施例1 配制如下配方的培養(yǎng)基： KNO3 2950mg/L, C8H7O2K 1900mg/L, (NH4)2SO4 430mg/L, KH2PO4 350mg/L, CaCl2 IlOmg/ L，MgS04 85mg/L，Na2-EDTA 32. 5mg/L，F(xiàn)eSO4* 7H20 24mg/L，MnSO4* H2O 3. Omg/L，ZnSO4* H2O I. 3mg/L，H3BO3 I. 4mg/L，KI 0. 65mg/L，CuSO4* 5H20 0. 05mg/L，Na2MoO4* 2H20 0. 16mg/L， C〇C12?6H20 0.16mg/L，丙三醇 0.9mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，葉酸 0.4mg/L，甲基亞硝基脲 I. 2mg/L，丙氨酸 I. 2mg/L，賴氨酸 I. 4mg/L，維生素 BI 5. Omg/L，維生素 B6 1.0 mg/L，3- [!比 啶甲酸l.0mg/L，蔗糖25g/L，植物凝膠5.5g/L; NAA 0.05mg/L，6-BA 2.0mg/L，調(diào)環(huán)酸鈣 0.7mg/L，山梨醇 25g/L，L-脯氨酸 120mg/L， 水解蛋白L0g/L，秋水仙堿0.2mg/L，生物素0.08mg/L，PH 5.9。
[0010] 選取粳稻品種通科粳和黑殼紫粳的花藥愈傷組織作為供體，當誘導培養(yǎng)后的花藥 愈傷組織長到2毫米大小時，轉到分化培養(yǎng)基上誘導綠苗，培養(yǎng)條件控制為：溫度26°C、濕 度75%、光照30001x 14h/暗10h。愈傷組織形成后(長到2 mm左右)，計算愈傷組織分化率。
[0011] 綠苗分化率（％) =分化綠苗數(shù)/轉移的愈傷塊數(shù)X 100%。
[0012] 實施例2 配制如下配方的培養(yǎng)基（C8H7O2K添加濃度的優(yōu)選）： KNO3 2950mg/L, (NH4)2SO4 430mg/L, KH2PO4 350mg/L, CaCl2 110mg/L, MgSO4 85mg/ L，Na2-EDTA 32. 5mg/L，F(xiàn)eSO4. 7H 20 24mg/L，MnSO4. H 20 3. Omg/L，ZnSO4. H 20 I. 3mg/L， H3BO3 I. 4mg/L, KI 0. 65mg/L, CuSO4* 5H20 0. 05mg/L, Na2MoO4* 2H20 0. 16mg/L, CoCl2* 6H 20 0. 16mg/L，丙三醇0.9mg/L，甘氨酸2.0mg/L，葉酸0.4mg/L，甲基亞硝基脲1.2mg/L，丙 氨酸1.2mg/L，賴氨酸1.4mg/L，維生素BI 5.0mg/L，維生素B6 1.0mg/L，3-吡啶甲酸 l.Omg/L，鹿糖 25g/L，植物凝膠 5.5g/L; NAA 0.05mg/L，6-BA 2.0mg/L，調(diào)環(huán)酸鈣 0.7mg/L，山梨醇 25g/L，L-脯氨酸 120mg/L， 水解蛋白L〇g/L，秋水仙堿0.2mg/L，生物素0.08mg/L，PH 5.9。
[0013] C8H7O2K 的添加濃度設置以下 8 種：900mg/L ; 1100mg/L ; 1300mg/L ; 1500mg/L ; 1700mg/L ；2100mg/L ；2300mg/L ；2500mg/L〇
[0014] 同樣選取該兩個粳稻品種花藥愈傷作為供體，操作方法、培養(yǎng)方法同實施例1，計 算綠苗分化率。
[0015] 實施例3 配制如下配方的培養(yǎng)基(丙三醇添加濃度的優(yōu)選）： KNO3 2950mg/L, C8H7O2K 1900mg/L, (NH4)2SO4 430mg/L, KH2PO4 350mg/L, CaCl2 IlOmg/ L，MgS04 85mg/L，Na2-EDTA 32. 5mg/L，F(xiàn)eSO4* 7H20 24mg/L，MnSO4* H2O 3. Omg/L，ZnSO4* H2O 1. 3mg/L，H3BO3 I. 4mg/L，KI 0. 65mg/L，CuSO4* 5H20 0. 05mg/L，Na2MoO4* 2H20 0. 16mg/L， C〇C12?6H20 0.16mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，葉酸 0.4mg/L，甲基亞硝基脲 1.2mg/L，丙氨酸 1.2mg/L，賴氨酸 1.4mg/L，維生素 BI 5.0mg/L，維生素 B6 1.0mg/L，3-吡啶甲酸 l.Omg/L， 蔗糖25g/L，植物凝膠5. 5g/L; NAA 0.05mg/L，6-BA 2.0mg/L，調(diào)環(huán)酸鈣 0.7mg/L，山梨醇 25g/L，L-脯氨酸 120