專利名稱：：一種輔酶a的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種輔酶A的酶促合成反應(yīng)工藝。(二)
背景技術(shù)：
1954年，Hoagland提出了動物組織內(nèi)輔酶A生物合成的途徑為ATP_C02ATP泛酸+半胱氨酸——泛酰半胱氨酸-一~泛酰巰基乙胺——4，-磷酸泛酰巰基乙胺ATPATP------^去磷酸輔酶A-----^輔酶ALevintow也提出了相同的生物合成途徑。1959年，Brown確定輔酶A生物合成的主要途徑為ATPL-半胱氨酸，ATP泛酸-------M，-磷酸泛酰---------------------4'-磷酸泛酰-L-半胱氨酸-----^泛酸激酶磷酸泛酸半胱氨酸合成酶脫羧酶ATPATP4，-磷酸泛酰巰基乙胺-----------------------^去磷酸輔酶A---------------^輔酶A磷酸輔酶A焦磷酸化酶去磷酸輔酶A激酶第一步是輔酶A生物合成中最重要的一步。最初輔酶A主要從酵母細胞內(nèi)提取分離得到，以后也經(jīng)化學全合成制備，但兩方法都不理想，產(chǎn)率低或制造工藝復雜。而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶A的開發(fā)利用，有望提供大量價廉的輔酶A以滿足需要。輔酶A發(fā)酵始于1950年。Deveries等將弗氏鏈霉菌(Str印tomycesfradiae)于32。C培養(yǎng)88h，發(fā)酵單位很低，僅僅5u/ml。爾后的研究，特別是Ogata和Shimizu等發(fā)現(xiàn)幾乎所有微生物細胞內(nèi)都有輔酶A合成酶系，而以兩株產(chǎn)氨短桿菌(BrevibacteriumammoniagenesIFO12071和IFO12072)的活性最強，發(fā)酵單位可達413u/ml。Shimizu等用產(chǎn)氨短桿菌詳細研究了輔酶A的發(fā)酵工藝。文獻報導的輔酶A制備工藝路線1、以酵母為原料的提法(破壁、提取)(吸附)(洗脫)新壓榨酵母沸水提取液766型活性炭吸附物氨乙醇，洗脫液先84'C，后冷卻pH6_>(吸附)(洗脫)(濃縮)粗制品濃縮KOH，717甲酸型樹脂;吸附物甲酸，甲酸銨)詵fl&液55-60"C(pH值中性即可)pH6(脫鹽)(洗脫)(沉淀、干燥)766型活性炭吸附物氨乙醇)洗脫液(濃縮),HNO,,丙酮，中間品55-60'CpH2-3(溶解、去雜質(zhì))(還原)(共鹽沉淀)(去锏離了)HO，，732、704樹脂，濾液CvsHC1，鋅汞齊還原液Cu,O;沉淀物通入H，S)pH2-335-40°CpH2.5(去半胱氨酸)(濃縮)(沉淀)濾液732樹脂)濾液^i5"^濃縮液il^輔酶A成品pH3我國在采用新壓榨酵母發(fā)酵合成輔酶A也取得了一定成績，但在提取純化工藝上，沒有根本改變，資料介紹活力損失2030%，按新鮮壓榨酵母計算，收率僅為3000單位/kg。另外，此純化工藝中采用鋅汞齊還原，此法不僅操作復雜，勞動強度大，收率低，而且影響生產(chǎn)工人的身體健康和造成環(huán)境污染。2、以豬肝為原料的GMA提取法(絞碎、提取)(除蛋白)(吸附)水5%CCl3COOH"IGMA勿脂新鮮豬肝"^rrn^r提取液~~rr^~~"濾液-^gma—coa煮沸.15分鐘4小時0.01mol/LHCl—O.lmol/LNaCI，0.01mol/LHCI—lmol/LNaCl.、，丄-=-HZoA洗脫液(酸化)(吸附)(脫鹽、洗脫)HCln,仏A^LD—601HNOj,氨乙醇一CoA濃集液-^LD—601—CoA-^氨醇洗脫液pH23(濃縮、酸化)(沉淀)(脫水、干燥)HN03^上HN03,丙酮丙闌-上清液~~u。c，'沉淀物-~~^~k:0a丙酮粉pH2.5pH2.53'P2Os此工藝收率低、純度差，資料介紹每kg肝中僅得輔酶A丙酮粉2X104單位，效價為120單位/mg，純度50%，且成品色澤較黃。GMA-LD-601組合工藝總收率為30%。3、產(chǎn)氨棒桿菌生物合成法^原來用酵母、白地霉等菌體細胞，經(jīng)破壁提取輔酶A，因含量少，使產(chǎn)量受到一定的限制。1974年研究成功加入泛酸作前體，應(yīng)用產(chǎn)氨短桿菌發(fā)酵合成輔酶A，并于1976年正式投入生產(chǎn)，成本比提取工藝下降4倍，質(zhì)量由50單位/毫克提高到100單位/毫克以上。(斜面培養(yǎng))(種子培養(yǎng))(發(fā)酵)(酶合成)，襯粗打稱活化培養(yǎng)基i,茌仆拍汰種子培養(yǎng)基n,瓧7並發(fā)酵培養(yǎng)基m,廿酧彼反應(yīng)液w,入戰(zhàn)誠產(chǎn)氨紐蹄pH7",蟣,M—活化菌體PH7,肌'M'種子液pH7，抓,24h發(fā)酵液PH6,饑,4h合成液(吸附、洗脫)(濃縮、沉淀、溶解)(陽離子交換)(陰離子交換)竭性炭'氣酵液,洗脫液=1,粗品溶液~|^陽離子交換液~^鵬子魏液pH2.5-3pH1.5-2pH2.5(還原)(絡(luò)合)(除銅)(離子交換)':胱氣酸，H2SQ,鋅汞齊V她Cu20Vl化八仏通入H2S仏w^732樹脂，7Q4樹脂她《*(濃縮、干燥).岫坊AAa-^~>還原液~^~*絡(luò)合物u,'^'除銅液-"精制液-^輔酶A成品40CpH4~5，2h
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的一些缺陷，提供一種輔酶A制備方法。通過微生物的三磷酸腺苷二鈉再生體系進行酶促合成輔酶A的制備工藝可分成兩大部分即發(fā)酵和提取純化。發(fā)酵部分包括微生物菌種選育、發(fā)酵條件和酶促反應(yīng)條件。這一部分的關(guān)鍵涉及到使用菌種的選擇和酶促反應(yīng)的條件。能進行酶促合成輔酶A的菌種有很多，如酵母菌、白地霉菌、短桿芽孢桿菌、假單孢菌、產(chǎn)氨棒桿菌等。從國內(nèi)外的文獻報道來看，其中產(chǎn)氨棒桿菌通過發(fā)酵進行酶促合成輔酶A的產(chǎn)量是最高的，我們的工藝中采用的也是產(chǎn)氨棒桿菌。酶促反應(yīng)的條件是指在微生物發(fā)酵到一定程度時加入輔酶A合成所需要的原料，即前體物質(zhì)包括鹽酸半胱氨酸、泛酸鈣、三磷酸腺苷二鈉等。提取純化部分包括吸附、濃縮、分子篩層析、還原、沉淀。這部分工藝中的關(guān)鍵是分離純化柱的選用和還原反應(yīng)，文獻上采用的是活性碳吸附柱吸附及陽柱、陰柱分離。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明依據(jù)了下述的技術(shù)方案。一種輔酶A酶促合成反應(yīng)工藝包括發(fā)酵部分和提取純化部分；(1)發(fā)酵部分所選用的輔酶A生產(chǎn)菌種經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，檢測PH值、OD值、殘?zhí)遣⑶溢R檢應(yīng)無雜菌；向酶反應(yīng)液中分批次投入前體物質(zhì)鹽酸半胱氨酸，泛酸鈣、三磷酸腺苷二鈉。酶反應(yīng)溫度控制在29。C3rC之間進行，總體反應(yīng)時間控制1822小時，空氣流量控制為l:0.5，攪拌，得到反應(yīng)液；反應(yīng)液酸化、壓濾，得到壓濾清液。(2)提取純化部分步驟(1)所得的壓濾清液選用M210-B型非極性大孔樹脂進行吸附分離，洗脫得到分離液，分離液中加入用L-半胱氨酸為絡(luò)合劑、投入亞銅離子反應(yīng)形成巰醇鹽，分別用稀酸和純化水洗滌、脫銅后得濃縮液；采用G-25型葡聚糖凝膠樹脂對脫銅后的濃縮液進行分離純化，利用核酸蛋白檢測儀280nm波長檢測，收集輔酶A和有效成分；濃縮液再用飽和的強堿，如氫氧化鉀、氫氧化鈉或氫氧化鋰溶液調(diào)節(jié)PH值至4.55.0，優(yōu)選氫氧化鋰溶液調(diào)節(jié)PH值。以巰基乙醇為還原劑，溫度控制在3436°C,時間控制在1014小時；濃縮液又用硝酸-丙酮混合液來沉淀輔酶A控制，pH為2.5，混合液溫度應(yīng)控制57t:，過濾，得輔酶A濕品、然后干燥。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比提高了輔酶A的純度，每lmg含輔酶A的效價均不低于300單位，比國家標準高出50單位；本品穩(wěn)定性考察結(jié)果將貯存條件定為遮光，密封，在-2(TC冷凍保存；并將有效期期限確定為18個月，比國家標準超出6個月。具體實施方式輔酶A的制備工藝的發(fā)酵和提取純化兩大部分中，本發(fā)明僅對發(fā)酵部分的酶促合成反應(yīng)階段，取純化部分的分離、濃縮階段、還原階段進行了改進，其它部分仍延用原制備工藝的公知技術(shù)，因此，要實施例中未對公知的制備工藝進行詳細的說明。實施例11、菌種培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的AS1.925產(chǎn)氨棒桿菌菌種移入發(fā)酵罐培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制在283(TC，空氣流量l:1，培養(yǎng)20小時，培養(yǎng)終點控制pH應(yīng)為6.26.3，0D為2.02.2;得發(fā)酵罐菌種。2、酶促合成反應(yīng)。零小時投入公知前體物質(zhì)前，先加入破壁劑苯扎溴銨，然后分別在2小時、3小時、4小時、5小時補加前體物質(zhì)。前體物質(zhì)總投料量重量百分比為0.1%的鹽酸L-半胱氨酸、0.07%的泛酸鈣、0.2%的三磷酸腺苷二鈉，將前體物質(zhì)平分成五份，分次加入；反應(yīng)溫度控制在2931°C，總體反應(yīng)時間控制約為20小時，空氣流量控制為1:0.5，攪拌，控制終點測效價為300350u/ml，得反應(yīng)液。3、預處理。反應(yīng)液用濃硫酸酸化，調(diào)節(jié)pH在1.51.8，板框壓濾得到壓濾清液，濾餅烘干做飼料。4、分離、濃縮。用DA210-B型非極性大孔樹脂吸附濾清液，流速控制在1/3裝柱體積/小時，得飽和樹脂；用0.03%的稀硝酸洗滌，流速控制在1/3裝柱體積/小時，得洗滌后樹脂；用氨乙醇為脫附劑脫附，流速控制在l/3裝柱體積/小時，收集流出液pH在2.07.0部分，得分離液。濃縮液效價控制在25003000u/ml,體積約分離液I體積的1/10，得濃縮液。5、成鹽、脫銅、濃縮、分離。用L-半胱氨酸為絡(luò)合劑，向步驟4所得的濃縮液中投入氧化亞銅，硫酸絡(luò)合，水解后成鹽，成鹽后分別用稀酸和純化水洗滌輔酶A銅鹽。銅鹽沉淀用1.7倍絡(luò)合液體積的純化水制成漿狀，調(diào)節(jié)pH至3.2—3.3，H2S脫銅6-8小時。濃縮液效價控制在25000-35000u/ml，濃縮后體積約為原體積的1/10，得濃縮液。濃縮液選用G25型葡聚糖凝膠樹脂純化分離，流速為V20裝柱體積，分離流出液的收集，根據(jù)控制指示核酸蛋白檢測儀及自動記錄儀顯示收集有效成分。再次濃縮，控制濃縮液效價單位在5800062000u/ml，體積控制在原體積1/8左右。6、還原、濃縮。步驟5最后得到的濃縮液，用飽和的氫氧化鋰溶液調(diào)節(jié)pH至4.55.0，以巰基乙醇為還原劑，按每100單位加15ml巰基乙醇的比例加入，溫度控制在3436°C，時間控制在12小時；濃縮液效價單位控制在5800062000u/ml。7、沉淀、干燥。沉淀輔酶A用硝酸-丙酮混合液，其pH控制為2.5，混合液溫度應(yīng)控制57°C，過濾，得濕品；以變色硅膠為干燥劑，干燥箱溫度控制在25"土rC，真空干燥，時間控制為48小時，得干品。實施例2:酶促合成反應(yīng)階段分步加入前體物質(zhì)對輔酶A效價單位的影響。依據(jù)實施例1輔酶A制備方法，在酶促合成反應(yīng)階段分別按1次全部加入所需前體量，分2次、3次、4次、5次、6次加入所需前體量，制備得輔酶A樣品l、2、3、4、5、6，按輔酶A法定標準檢測每lml含輔酶A的效價單位，具體檢測結(jié)果如下樣品樣品l樣品2樣品3樣品4樣品5樣品6每lml含輔酶A的效價282295310312317280根據(jù)試驗數(shù)據(jù)可知輔酶A酶促合成反應(yīng)階段分步加入前體，可以提高輔酶A的效價單位，明顯優(yōu)于1次性加入前體。實施例3:分離階段選用不同型號大孔樹脂對輔酶A收率及純度的影響樣品1:依據(jù)實施例1的輔酶A制備方法，在提取純化工藝分離階段使用DA201-A型大孔樹脂吸附分離。樣品2:依據(jù)實施例1的輔酶A制備方法，在提取純化工藝分離階段使用DA201-B型大孔樹脂吸附分離。樣品3:依據(jù)實施例1的輔酶A制備方法，在提取純化工藝分離階段使用CAD型大孔樹脂吸附分離。按按輔酶A法定標準檢測發(fā)酵原液及洗脫液每lml中含輔酶A的效價單位，同時計算其吸附率、洗脫率及其分離前后純度，試驗結(jié)果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>試驗結(jié)果表明選用DA201-B型大孔樹脂進行吸附分離其吸附率、洗脫率、洗脫液純度均較高。實施例4:還原工藝使用不同的強堿對輔酶A效價單位的影響。樣品1:依據(jù)實施例1的輔酶A制備方法，在還原工藝使用氫氧化鉀調(diào)節(jié)PH值。樣品2:依據(jù)實施例1的輔酶A制備方法，在還原工藝使用氫氧化鋰調(diào)節(jié)PH值。樣品3:依據(jù)實施例1的輔酶A制備方法，在還原工藝使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值。按輔酶A法定標準檢測每lml含輔酶A的效價單位，樣品1、樣品2、樣3具體檢測結(jié)果如下樣品樣品1樣品2樣品3每lml含輔酶A的效價308317301根據(jù)試驗數(shù)據(jù)可知輔酶A還原工藝使用氫氧化鉀、氫氧化鋰、氫氧化鈉等強堿溶液調(diào)節(jié)PH值，其中氫氧化鋰能明顯提高輔酶A的效價單位。實施例5:本發(fā)明還原工藝與文獻報道3所述還原工藝比較。樣品1:依據(jù)實施例1的輔酶A制備方法制得樣品1，還原工藝用飽和的氫氧化鋰溶液調(diào)節(jié)pH至4.55.0，以巰基乙醇為還原劑，按每100單位加15ml巰基乙醇的比例加入，溫度控制在3436'C，時間控制在12小時；濃縮液效價單位控制在580Q062000u/ml。樣品2:依據(jù)文獻報道3所述的產(chǎn)氨棒桿菌生物合成法制得樣品2。按輔酶A法定標準檢測每lml含輔酶A的效價單位，樣品1、樣品2具體檢測結(jié)果如下樣品樣品l樣品2每lml含輔酶A的效價31825權(quán)利要求1、一種輔酶A的制備工藝，包括發(fā)酵和提取純化兩大部分，發(fā)酵部分分為微生物菌種選育、菌種發(fā)酵和酶促合成反應(yīng)；提取純化部分分為吸附分離、濃縮、分子篩層析、還原、沉淀，其特征在于在發(fā)酵部分的酶促合成反應(yīng)階段，向酶反應(yīng)液中分批次加入公知量的前體物質(zhì)即鹽酸-半胱氨酸，泛酸鈣、三磷酸腺苷二鈉。2、如權(quán)利要求1所述的一種輔酶A的制備工藝，其特征在于在發(fā)酵部分的酶促合成反應(yīng)階段，向酶反應(yīng)液中分3次、4次或5次加入公知量的前體物質(zhì)。3、如權(quán)利要求1所述的一種輔酶A的制備工藝，其特征在于在發(fā)酵部分的酶促合成反應(yīng)階段，向酶反應(yīng)液中分5次加入公知量的前體物質(zhì)。4、如權(quán)利要求1所述的一種輔酶A的制備工藝，其特征在于在提取純化部分的分離、濃縮階段，采用DA210-B型非極性大孔樹脂進行吸附分離。5、如權(quán)利要求1所述的一種輔酶A的制備工藝，其特征在于在提取純化部分的還原階段，用飽和的強堿溶液調(diào)節(jié)PH值，以巰基乙醇為還原劑進行還原。6、如權(quán)利要求2所述的一種輔酶A的制備工藝，其特征在于在提取純化部分的還原階段，用飽和的氫氧化鉀、氫氧化鈉或氫氧化鋰溶液調(diào)節(jié)PH，值以巰基乙醇為還原劑進行還原。7、如權(quán)利要求2所述的一種輔酶A的制備工藝，其特征在于在提取純化部分的還原階段，用飽和的氫氧化鋰溶液調(diào)節(jié)PH值，以巰基乙醇為還原劑進行還原。全文摘要本發(fā)明公開一種輔酶A的制備工藝，包括發(fā)酵和提取純化兩大部分，其特征在于在發(fā)酵部分的酶促合成反應(yīng)階段，向酶反應(yīng)液中分批次加入公知量的前體物質(zhì)即鹽酸-半胱氨酸，泛酸鈣、三磷酸腺苷二鈉。在提取純化部分的還原階段，用飽和的強堿溶液調(diào)節(jié)pH值，以巰基乙醇為還原劑進行還原。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比提高了輔酶A的純度，每1mg含輔酶A的效價均不低于300單位，比國家標準高出50單位；本品穩(wěn)定性考察結(jié)果將貯存條件定為遮光，密封，在-20℃冷凍保存；并將有效期期限確定為18個月，比國家標準超出6個月。文檔編號C12R1/15GK101230374SQ200810049249公開日2008年7月30日申請日期2008年2月20日優(yōu)先權(quán)日2008年2月20日發(fā)明者崔鳳云,李大平,楊小棉,王金成申請人:天津藥業(yè)焦作有限公司