專利名稱:鹵芳香基腈降解基因，其用途以及含該基因的細胞的制作方法
本申請為1986年1月8日提出的編號為817，226的申請的部分繼續(xù)申請，該申請揭示的內(nèi)容在此被采用作參考。
向微生物及高等有機體的細胞提供新穎的遺傳特性的機會，為獲得新的遺傳特性開辟了一條廣闊的途徑。
討論的一個方面是涉及到因其細胞毒作用而被采用的許多制劑，例如，農(nóng)業(yè)上所用許多化合物直接用于殺滅害蟲、雜草等。在很多情況下，這些化合物具有較長的滯留時間或者持久地殘留。
在許多情況下，人們希望將那些欲殺死的物種與欲保留的物種區(qū)分開來。例如，人們常常想要有選擇地殺死雜草而同時又對莊稼產(chǎn)生最少的不利影響。大部分情況下，許多除草劑都對莊稼產(chǎn)生相當大的不利影響，因而這些除草劑的應用基本上僅限于備急情況下使用或者次緊急情況下謹慎地使用。
因而要是能夠?qū)罴毎右愿倪M使之產(chǎn)生對細胞毒制劑之類的威脅的抗性就具有很大的意義。
美國專利4，535，060號描述了將草甘膦(glyphosate)抗性賦于對草甘膦敏感細胞的細菌aro A基因的應用。Hsu和Camper在Can.J.Microbiol.(1976)22卷537至543頁上描述了從富含土壤的培養(yǎng)物分離到苯甲腈(ioxynil)降解物。Hsu和Clemson在Dissert.Abstr.Intrn.B36(1976)第8，3708，號上描述了3，5-二鹵-4-羥基苯基氰一類除草劑的微生物降解作用。Ingram和Pullin在Pesticsci.(1974)第5冊287至291頁上描述了溴苯腈(bronoxynil)在三種類型土壤中持久性。Smith在Abstrp.MeetingWeed Soc.Am.(1971)的第16至17頁上描述了溴苯腈在勒吉那(Regina)重粘土中的降解作用。
Smith和Fletcher在Hort.Res.(1964)上的4冊第60至62頁上對3，5-二囟-4-羥苯基氰和土壤微生物進行了報導。
本發(fā)明提供包含腈水解酶、為這些腈水解酶編碼的核酸順序，含有在一種所需要的宿主(腈水解酶基因?qū)λ鼇碚f是外來物)所識別的調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄的和轉(zhuǎn)譯的調(diào)節(jié)控制下為這類腈水解酶編碼的基因的構(gòu)成物、含有這類構(gòu)成物的宿主細胞以及含有這些構(gòu)成物的有機體、有機體部分或產(chǎn)物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)溴苯腈和/或碘苯腈(ioxynil)特異的腈水解酶可用于含有溴苯腈及有關(guān)的除草劑的產(chǎn)地的去毒性之用，同時可保護宿主細胞免受這些除草劑的細胞毒作用。這些構(gòu)成物發(fā)現(xiàn)可用于區(qū)分那些含有這種構(gòu)成體的宿主細胞與缺乏這種構(gòu)成物的宿主細胞。
根據(jù)本發(fā)明，可以提供與囟代羥基苯并腈，特別是3，5-二溴-或3，5-二碘-4-羥基芐腈的水解有關(guān)的新穎的DNA順序、構(gòu)成物及轉(zhuǎn)化了的細胞、植物以及肽。本發(fā)明涉及到能夠水解腈的一種酶的生產(chǎn)，以便去除具有殺草活性的腈的毒力，并向?qū)Τ輨┟舾械募毎?，或宿主提供保護作用或者對含有該除草劑的環(huán)境進行解毒。
這種有意義的結(jié)構(gòu)基因可以從顯示出能夠?qū)⒈交枳鳛榈?，通常將苯基氰作為唯一氮源的單細胞微生物中獲得，特別是從細菌中獲得。關(guān)于芐腈或腈水解酶，意思是指芐腈是一種鹵代P-羥基芐腈，特別是3，5-二碘或3，5-二溴-4-羥基芐腈，腈水解酶是一種能將鹵代芐腈作為氮源，特別是作為其唯一的氮源的水解酶。
這種酶可以通過不同的途徑獲得，可以方便地從天然存在于含有溴苯腈的或磺苯腈的環(huán)境中的細菌獲得。特別是腸道細菌，再進一步講是克氏桿菌(klebsiella)種，是可獲得這種酶的。肺炎克氏桿菌(klebsiella pneumoniae)，特別是變異體(klebsiella ozaenae)是可以采用的。這些細菌可以在土壤或其它芐腈的濃度越來越高的培養(yǎng)基中生長，而不是從土壤中分離，減少其它的可供選擇的氮源直至獲得可用芐腈作為唯一的氮源而生存的細菌為止。
不管含有腈酶的細菌的來源如何，進行的篩選必須確保腈水解酶對芐腈的去毒作用效力。此外，這種腈水解酶應對芐腈具有特異性而不對缺少鹵素的具有其他取代基的其他類似物具有特異性。因此，本發(fā)明的腈水解酶將是正如定義的那樣是對芐腈具有特異性，對于類似物相對地是沒有活性的或者活性低得多。與在可比較的濃度下以芐腈作氮源比較，在正常氮源如氨存在下，細菌的增殖率最理想的是不應顯著減少，就是不少于大約10%。這一結(jié)果對于非特異性的芐腈酶是得不到的。
一旦鑒定了一種以上宿主品系，那么這些技術(shù)便可用于鑒定這種腈水解酶的編碼順序。該基因可能存在于染色體或者質(zhì)粒中?；蚪M可以被打碎，特別是用限制性內(nèi)切酶將之切碎，對于基因組采用一種或者多種核酸內(nèi)切酶進行內(nèi)切可以提供大小從5Kb至50kb范圍的片段。這些片段可以被克隆至合適的細菌(例如大腸桿菌)中的合適的載體上。對產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體進行篩選以選擇腈水解酶的活性，其中宿主有機體提供的環(huán)境是不利的。一旦一種或多種克隆被確認具有腈水解酶的活性，那么含有所需求的DNA片段的染色體外組成物、質(zhì)?；蛘卟《究梢酝ㄟ^通常的技術(shù)，諸如宿主的溶胞作用、DNA沉降作用，以及通過將載體DNA或質(zhì)粒或者病毒DNA從染色體DNA上分開的方法來進行分離。然后，染色體外組成物可以用限制性核酸內(nèi)切酶來切開，用各種分離及鑒定各種不同大小片段的技術(shù)，例如，電泳、密度梯度離心法等來分離所需要的片段。
根據(jù)片段的大小，通常還經(jīng)進行進一步的處理以使片段大小減小到以使其更接近于該基因及其側(cè)翼的調(diào)節(jié)區(qū)域的大小。目前已有多種技術(shù)用于處理含有為那種酶的編碼順序及其調(diào)節(jié)側(cè)翼順序的片段?？梢圆捎迷诓煌姆磻旌臀镏杏貌煌南拗菩悦高M行部分切開，然后，對這些片段進行克隆以確定哪些片段仍然保留了表達腈水解酶的能力。
另一方面，該酶可以進行分離并進行部分順序分析。根據(jù)氨基酸的順序，可以制備用于確定具有該基因的片段的探針。通過將這種方法與限制性酶切相結(jié)合，可以對片段進行克隆和篩選以了解是否具有所需要的基因。此外，也可以用核酸外切酶，例如Bal31將片段的一端或者兩端的核苷酸切除以進一步減少多余的核苷酸數(shù)目。
另一方面，通過用探針篩選及通過在合適的體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)，如xenopus卵母細胞(Xenopus oocytes)或(reticulolysate)或者諸如此類的轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中進行鑒定，而該基因在合適的宿主中被克隆并使信使RNA得到分離。利用包括逆轉(zhuǎn)錄酶及采用DNA聚合酶形成互補鏈的常用技術(shù)，將分離了的信使RNA用于制備cDNA。在這例子中，所得到的結(jié)構(gòu)基因缺少與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)域。
包含這種表達腈水解酶的結(jié)構(gòu)基因的DNA順序可以被接合入很大一類其它DNA順序中以導入合適的宿主細胞之中?；グ榈捻樞?companion seguence將取決于宿主的性質(zhì)及該DNA順序?qū)胨拗鞯姆绞揭约叭藗兯谕怯坞x基因(episomal)處于維持的狀態(tài)還是處于整合的狀態(tài)。
對于原核生物宿主而言，存在著很大一類載體可以通過轉(zhuǎn)化作用或者接合作用、轉(zhuǎn)導作用或轉(zhuǎn)染作用而將DNA順序?qū)朐松锼拗髦?。DNA順序包括很大一類的質(zhì)粒如，pBR332。pACYC184。pMB9、pRK290等等;及柯斯粒(cosmid)如，pVK100;或者病毒如;p22等等。
對于真核生物宿主而言，有很多的技術(shù)可用于將DNA導入宿主，如用Ca++沉淀的DNA，包括一個非復制DNA順序或一個質(zhì)粒或小染色體，進行轉(zhuǎn)化或者用一個包含農(nóng)業(yè)細菌(Agrobacterium)的順序的T-DNA進行的轉(zhuǎn)化以及利用微量吸移管或electroporation)進行微注射。在該DNA結(jié)構(gòu)中究竟是否存在一個有效的復制系統(tǒng)，決定了DNA是被作為游離基因組成物(episomal element)被復制，還是DNA是被整合到宿主的基因組，決定結(jié)構(gòu)基因在宿主中的表達。游離基因組成物可以被采用，諸如腫瘤引起的質(zhì)粒，例Ti或Ri，或片段;或病毒，例如CaMV，TMV或其片段，這些游離基因組成物對宿主是非致死的，并且結(jié)構(gòu)基因是以允許被表達的方式存在于這類游離基因組成物之中的。特別有意義的是這些片段具有復制的功能而缺少其它功能，如腫形成及毒性等等。
從腈水解酶源所獲得的片段可以采用一個合適的克隆載體而進行克隆?？寺】梢栽谝粋€合適的單細胞微生物，例如大腸桿菌之類的細菌中進行。最理想的是采用一種柯斯粒(cosmid)，在那里，部分或完全消化可提供具有所需要大小的片段。例如，柯斯質(zhì)粒(cosimd)p VK100可以用一種合適的限制酶進行部分消化，并連接到通過部分或完全消化質(zhì)?；蛉旧w或其片段而獲得的片段上。裝配必須確保僅使所需要的大小的片段被裝配并轉(zhuǎn)導入宿主有機體內(nèi)。
宿主有機體要選擇對芐腈具有抗性的。對受體菌株可以進行改良以提供合適的遺傳特性，而這種遺傳特性允許對轉(zhuǎn)導體進行選擇。在微生物中，轉(zhuǎn)導體可以使之與其它的微生物接合，當需要的時候可采用遷移質(zhì)粒。多種技術(shù)可以用于進一步減少含有腈水解酶的結(jié)構(gòu)基因的片段的大小。例如，對柯斯質(zhì)粒(cosmid)載體可以進行分離并用許多限制性核酸內(nèi)切酶例如EcoRⅠ、BglⅡ和SmaⅠ等進行切斷，然后將得到的片段在合適的載體克隆，可方便地利用先前使用過的柯斯質(zhì)粒(cosmid)載體。許多克隆載體例如pACYC177及pACYC184比較小，可用于代替柯斯質(zhì)粒(cosmid)載體。因而，最好是小于5kb，通常小于4kb，最佳為小于2kb左右的片段可以進行克隆并提供對芐腈的抗性。
最理想的片段是大約1kb左右，并小于5Kb左右，最好小于大約4kb，特別是至少為1047bp，尤其是以含有至少有1100bp左右側(cè)翼區(qū)，最好小于1.5kp的為佳。
最好的是從克氏桿菌(klebsiella ozaenae)中得到的BglⅡ-SmaⅠ片段，尤其是大約1210bp的PstⅠ-HincⅡ片段更好。
腈水解酶可以通過原核生物或真核生物包括細菌、酵母、絲狀真菌或植物細胞等等的任何一種方便的來源進行表達。在這里沒有發(fā)現(xiàn)決竅，酶是根據(jù)已知的方式通過將細胞溶破進行分離的。可用的方式包括色譜法、電泳、親合色譜法及其諸如此類的方法。溴苯腈可以方便地通過合適的功能團，例如羧基結(jié)合到不溶的載體上，用于腈水解酶分離的填充物的支持物上。
正如Harper在Biochem.J.(1977)167卷685～692頁上所描述的條件下，腈水解的特異性活性至少為大約0.1微摩爾氨/分·毫克蛋白，一般不低于大約0.5微摩爾氨/分·毫克蛋白或者更高一些。
提純了的酶可以各種方法被應用。它可以直接用于測定溴苯腈、碘苯腈或其他的相關(guān)的芐腈。
該酶還可以通過與被分析物(如半抗原或抗原)或抗體相結(jié)，可用于診斷分析，那些診斷分析是由美國專利第3，654，090及3，817，837及3，850，752號加以描述。這些專利中已極為詳盡地描述了結(jié)合的方法和被分析物濃度的確定，這些專利所揭示的適當部分已合并作為參考為腈水解酶編碼的DNA順序可以以各種方法被應用。這種DNA順序可以用作分離野生型的或者變異型的腈水解酶的探針。另一方面，該DNA順序可以通過將之重組入宿主而進行整合，以向宿主提供芐腈的抗性。
對植物細胞來說，作為構(gòu)造體的結(jié)構(gòu)基因可以通過微量吸移管注射作用導入植物細胞通過重組整位進入宿主的基因組。此外，結(jié)構(gòu)基因因轉(zhuǎn)導而引入植物宿主中的過程可采用electroporation。在從具有不為植物宿主所識別的調(diào)節(jié)信號的來源獲得結(jié)構(gòu)基因時，需要引入合適的基因用于表達在采用病毒或者質(zhì)粒，如腫瘤誘導的質(zhì)粒，并已作過基因圖分析的地方，可以選擇位于啟動下游的一個限制部位結(jié)構(gòu)基因可在與啟動子的合適距離插入該限制部位。在DNA順序不提供合適的限制部位時，可以采用核酸外切酶諸如Bal31進行多次的消化，并插入一個合成的限制性核酸內(nèi)切酶位點(聯(lián)結(jié)子)。特別有趣的是腫瘤誘導質(zhì)粒如Ti或Ri的采用，在這里腈水解酶基因可以整合進入植物細胞的染色體之內(nèi)。對于Ti質(zhì)粒及Ri質(zhì)粒的采用的描述可見于PCT公告第WO84/02913、02919、02920和EPO申請第0116718號和Matzke及Chilton所著的J.Mol App.Genetics(1981)的第一冊的39～49頁。
通過采用TDNA右邊緣或兩個邊緣，在這里，兩個邊緣位于在包括在被植物宿主所識別的起始和終止的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的調(diào)節(jié)信號下腈水解酶結(jié)構(gòu)基因的表達盒expression cassette)的側(cè)面，表達盒可以被整合進入植物基因組以提供在植物分化的各個不同的階段，能在植物細胞中表達。
可以制備各種構(gòu)成物以提供在植物細胞進行表達。這些構(gòu)成物提供一種在植物中可起作用的表達盒用于在植物宿主中表達腈水解酶。
為了提供轉(zhuǎn)錄，可以采用多種轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(啟動子區(qū)域)、構(gòu)成區(qū)或誘導區(qū)。
轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域被結(jié)合到為腈水解酶的編碼結(jié)構(gòu)基因以提供從起始密碼子的上游轉(zhuǎn)錄起始，一般在起始密碼子中占200個堿基，在這里，不轉(zhuǎn)錄的5′區(qū)缺乏ATG。
結(jié)構(gòu)基因的3′-末端有一個或多個終止密碼子，這些終子密碼子將加入植物宿主中起作用的轉(zhuǎn)錄中止區(qū)域，該終止區(qū)域與作為起始區(qū)域的相同的或不同的結(jié)構(gòu)基因聯(lián)結(jié)作為起始區(qū)域。
如果表達盒合適的話，其特征應該為在轉(zhuǎn)錄的方向上具有起始區(qū)域及由起始區(qū)的轉(zhuǎn)錄控制下的結(jié)構(gòu)基因和使轉(zhuǎn)錄終止并對信使RNA進行加工的終止區(qū)域。對于轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域奧派啟動子(Opine promoter)和終止區(qū)可以被采用，這就允許腈水解酶基因的組成表達(Constitutive expression)。其他的啟動子和/或終止區(qū)也可應用，特別是在植物宿主中提供誘導表達或調(diào)節(jié)表達的啟動子?？梢圆捎脕碜杂赥i-質(zhì)粒的啟動子區(qū)包括奧派啟動子如，章魚堿合酶啟動子及籃曙紅合酶啟動子及agropine合酶啟動子及manopine合酶啟動子等。其它的啟動子包括病毒啟動子如CaMV第四區(qū)啟動子或者全長(35S)啟動子，這些啟動子是與核酮糖-1，5-二磷酸羧酸鹽堿基，例如小的亞單位相關(guān)聯(lián)、這些基因是與云扁豆蛋白和蛋白儲藏、纖維素B-Conglycinin及形成等相關(guān)的。
各種順序可以用通常的方法結(jié)合在一起。一啟動子區(qū)可以通過結(jié)構(gòu)基因的5′區(qū)，例如奧派基因(opine)gene和通過限制性基因圖分析來確定和順序分析可以進行選擇和分離。同樣，終止區(qū)可以作為結(jié)構(gòu)基因3′位區(qū)而進行分離。該順序可以在正確取向被克隆和結(jié)合以提供腈水解酶基因能在植物宿主中組成表達。
通過將表達腈水解酶的功能基因?qū)攵鴮ψ魑锛毎M行改造的方法，人們可以將其濃度足夠徹底地去除雜草的溴苯腈和碘苯腈或類似除草劑用于各種農(nóng)作物，同時對農(nóng)作物不產(chǎn)生影響。采用這種方法，可以取得巨大的經(jīng)濟效益，因為肥料和水份可以有效地被利用，可以避免由于存在雜草而引起的不利作用。
表達腈水解酶的表達盒可以導入各種植物;單子葉植物和雙子葉植物，包括玉米、小麥、大豆、煙草、棉花、西紅柿、土豆、(Brassica)、水稻、花生、矮牽牛(Petunia)、向日葵、糖甜菜或者(turfgrass)等等。這種基因可以存在于細胞或者植物體的某部份，包括愈傷組織、組織、根部、塊莖、(Propagules)、(Plantlets)、種子、葉子、籽苗及花粉等等。
通過向植物提供對芐腈的抗性，可以采用各種各樣配方以保護作物免于雜草的危害，以此促進作物生長和減少對營養(yǎng)的竟爭。例如，溴苯腈可以單獨或者與其它產(chǎn)品一起，用于經(jīng)過保險的作物例如向日葵、大豆、棉花或者玉米等等，以對雜草進行次緊急(Posteme-rgence)控制。
通常施用于田野的殺蟲劑配方中的數(shù)量大約為0.1～4磅溴苯腈/英畝，最佳數(shù)量為0.2～2磅溴苯腈/英畝其中其它的雜草劑的數(shù)量大約為0.1～4磅活性成份/英畝。配方中包括其它的添加劑，例如，去垢劑、佐劑、擴散劑、粘著劑、穩(wěn)定劑等等。配方既可以是濕態(tài)的也可以是干態(tài)的，如本領(lǐng)域所知的那樣，包括有可分散的粉末及可乳化的濃縮物或液體的濃縮物。
除草劑溶液可以按照通常的方法施用，例如通過噴霧、灌溉或撤粉等等。
以下實施例只提供作說明用而非用于限制。
實驗限制性酶和用于連接的T連接酶根據(jù)制造廠家推薦被采用。
根據(jù)紐約的Cold Spring Harbor實驗室的Maniatis等人所著的《Molecular Cloning∶A Laboratory Manual》(1982)所介紹的按照克隆標準方法和分子分析法來進行的?？寺》治鍪前凑誌sh-Horowitz等人在《Nucl.Acids Res》(1981)第9卷的2989～2998頁所述的方法來進行的。
大腸桿菌菌株MM294被用于所有的克隆實驗(Hanahan，Mol.Biol(1983)166卷557～80頁)在應用時的抗生素水平為Cm(氯霉素)25ug/ml;Tc(四環(huán)素)10ug/ml;Ap(青毒素)300ug/ml。
在大腸桿菌中質(zhì)粒DNAS的轉(zhuǎn)化作用是根據(jù)Mandel和Higa所著的《J.Mol.Biol.》(1970)中的第53和159～162頁所介紹方法進行的。
對從含有溴苯腈的土壤樣品所獲得的細菌分離物進行分離和篩選。這種微生物之一被確定為肺炎克氏桿菌(Klebsiella Pneumoniae)的Ozaenae亞種。對于來自上述有機體的溴苯腈特異腈水解酶的部分純化和表征鑒定得到了一種活性酶其表觀分子量為34千道爾頓。
經(jīng)過在固態(tài)L瓊脂糖上對克氏桿菌(K.Ozaenae)重復接種獲得一種變異體，當這種變異按照Barmett及Ingraham在《J.Appl.Bacteriol.》(1975)第18卷的131～143頁上的描述而配制的有每升中含有KH2PO4(1.5g)、K2HPO4(3.5g)、MgSO47H2O(0.1g)、酵母抽提物(50mg)、0.1%的檸檬酸、甘油和琥珀酸、以及微量元素的液體培養(yǎng)基上生長時，它們不再能利用溴苯腈作為唯一的氮源。該培養(yǎng)今后將被稱為YETE多碳培養(yǎng)基。該YETE多碳培養(yǎng)基包含0.05%的溴苯腈。盡管該種有機體不能利用溴苯腈作為唯一的氮源，但在含有0.05%溴苯腈L肉湯上可以生長至最大的密度。將克氏桿菌(K.Ozaenae)變異體菌落選出并在10ml L肉湯上生長。將三個獨立的克氏桿菌(K.Ozaenae)菌落從含有苯腈的一個LB板上選出，并在相同條件下生長。這樣四個相同的菌落同時在用0.05%溴苯腈補充的10ml L肉湯上生長。培養(yǎng)物在30℃下生長至最大密度，并用Ish-Horowitz等在《Nucl.Acids Res》(1981)第9卷2989頁上描述的方法從每個培養(yǎng)物上制備mini-prep質(zhì)粒DNA.未經(jīng)消化的質(zhì)粒DNA在0.5%瓊脂糖凝膠上電泳，并通過溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓過濾(Straining)而顯現(xiàn)質(zhì)粒帶。
克氏桿菌(K.Ozaenae)變異體在溴苯腈存在或不存在下生長，產(chǎn)生單一的質(zhì)粒種(68Kb大小)。三個克氏桿菌(K.Ozaenae)菌落在0.05%溴苯腈存在下生長時顯示一個大的質(zhì)粒種(90Kb)。三個克氏桿菌(K.Ozaenae)菌落中的二個，在有溴苯腈存在時，有兩個質(zhì)粒形式存在。這數(shù)據(jù)表明，當溴苯腈選樣物解除時大的質(zhì)粒種轉(zhuǎn)化為小的質(zhì)粒形式，伴隨著大約22Kb的質(zhì)粒DNA的損失。四個菌落都生長在200ml的含0.05%溴苯腈的L肉湯中。細胞用法蘭西壓機(French Press)打碎，高速離心的上清液用含有0.05MKPO4PH7.5和2.5mM二硫蘇糖醇(DTT)的緩沖液滲析，對每個粗提取物進行特異性腈水解酶活性的測定。從克氏桿菌(KOzaenae)變異體制備的粗提取物不含有可檢測的腈水解酶的活性，而另三個其他克氏桿菌(K.Ozaenae)粗提取物所顯示的腈水解酶的特異活性分別為0.124、0.105和0.143umol NH/mm mg蛋白。在30℃下，細胞(200ml)在含有0.1%葡萄糖和0.04%溴苯腈的Mg培養(yǎng)基(Miller(1972)著的《分子遺傳學實驗》(GOld Sping Har bor實驗室)上生長至mid log時期。粗提取物通過將細胞破碎超離心和在含有0.05M KPO(PH7.5)及2.5mM DTT的緩沖液中對上清液進行透析而制成。在所有的測定中基質(zhì)的濃度均為3mM溴苯腈。按照Har Per在Biochem.J.(1977)第167卷685～692頁描述的方法對NH3的釋放進行監(jiān)測。克氏桿菌(K.Ozaenae)變異體在含有溴苯腈的L肉湯上生長的能力可能引起該有機體對該化合物的不滲透性。然而，該有機體不能在將溴苯腈作為唯一的氮源的精制的培養(yǎng)基中生長。
概括地說，克氏桿菌(K.Ozaenae)腈水解酶好象是由質(zhì)粒編碼的。編碼酶的基因好象存在于，在缺少溴苯腈情況下是克氏桿菌(K.Ozaenae)質(zhì)粒自發(fā)喪失的一個22KB質(zhì)粒DNA上。
克氏桿菌(K.Ozaenae)溴苯腈特異腈水解酶在大腸桿菌中的表達從在0.05%溴苯腈選擇作用下生長的克氏桿菌(K.Ozaenae)的質(zhì)粒DNA被制備后，轉(zhuǎn)移到大腸桿菌菌株MM294(thi gyr A96、end I-、hsd R17)。在添加0.05%溴苯腈作唯一氮源的缺氮(N-)固體瓊脂糖最低培養(yǎng)基[每升含KHPO(1.5克)、KH2PO4(3.5克)、Mg SO47H2O(0.1克)和0.1%葡萄糖]上選擇出轉(zhuǎn)化實變型。在保溫5天后，在選擇板上出現(xiàn)了10個菌落。這些菌落在含有0.05%溴苯腈的L瓊脂糖板上再劃線進行培養(yǎng)，并測試在MM294中是否存在硫胺素營養(yǎng)缺乏標記物。這些菌落沒有一個能在缺少硫胺素的最低培養(yǎng)基中生長的，這表明該菌株是大腸桿菌MM294。所有的菌落都可以在添加硫胺素M9培養(yǎng)基上生長并以0.05%溴苯腈為唯一的氮源的。在缺少溴苯腈的這種培養(yǎng)基上沒有看到菌落的生長。這些菌落中選擇兩個以用作進一步的分析。當對含90Kb質(zhì)粒的大腸桿菌MM294粗提取物制劑的溴苯腈特異性腈水解酶活性進行測定時，可以獲得比活性為釋放0.216umolNH3/mm mg。含有較小質(zhì)粒種的大腸桿菌MM294不產(chǎn)生可檢測出的腈水解酶活性。大腸桿菌中的較大的90Kb的質(zhì)粒稱為PBrx1，而較小的稱為PBrx1△。
為了確證含有的質(zhì)粒PBrx1，大腸桿菌菌株MM294產(chǎn)生合適的代謝物確定溴苯腈特異性腈水解酶作用的結(jié)果，而將2毫升在用MM294(PBrx1)培養(yǎng)物在30℃下，在添加0.05%溴苯腈的M9培養(yǎng)基中生長24小時。培養(yǎng)物濾液樣品放在一個C18HPLC柱上進行層析。在培養(yǎng)物濾液中所有加入的溴苯腈被轉(zhuǎn)化成一個新的代謝物峰。用光譜分析對代謝物峰進行測定證實為3′5-二溴-4-羥基苯甲酸(DBHB)。因而，溴苯腈特異質(zhì)粒編碼的腈水解酶在大腸桿菌中表達的產(chǎn)物是與在克氏桿菌(K.Ozaenae)中觀察到一樣的。
溴苯腈特異腈水解酶基因在大腸桿菌中被克隆。
為了測定DNA片段編碼的溴苯腈特異酶是否能夠在大腸桿菌中被克隆，質(zhì)粒p Brx1用BamHⅠ消化分別得到53Kb和37Kb兩個帶。BamHⅠ片段被連接進入大腸桿菌質(zhì)粒載體pACYC184(Chang及Cohen所著《J.Bacteriol》(1978)134冊1141頁)的BamⅠ位點上，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株MM294?？寺∵M入p ACYC184的BamHⅠ位點引起了的四環(huán)素抗性基因的插入抑制。選擇4個氯霉素抗性、四環(huán)素過敏的MM294菌落，制備mini-prep克隆分析DNA，并用BamHⅠ消化該DNA。四個克隆含有37Kb BamHⅠ片段，而有一個克隆含有PBrx1的較大的53Kb BamHⅠDNA片段。五個克隆包含1個同樣也在質(zhì)粒PBrx1△中的克隆的BamHⅠ片段，該片段與PBrx1的自發(fā)性地缺失22Kb的質(zhì)粒DNA后剩下的片段相對應。所有10個克隆在200ml有20μg/ml氯霉素(為該質(zhì)粒而選擇)的L肉湯中生長，獲得粗提取物制劑并對提取物的溴苯睛特異的腈水解酶活性進行測定。四個含有37Kb BamHⅠ片段的克隆顯示了的腈水解酶特異的活性為0.140μmcleNH釋放/分·毫克蛋白的水平，而另六個克隆則檢測不出有腈水解酶的活性。該數(shù)據(jù)表明編碼溴苯腈特異腈水解酶活性的基因是位于克隆自質(zhì)粒PBrx1的37Kb BamHⅠ片段上，并且在不存在溴苯腈選擇情況自發(fā)地丟失的該22Kb的DNA片段是在37Kb BamHⅠ片段之中的。
就載體PAcyc184而言，為了證實BamHⅠ片段的定向，從上述的四個克隆獲得的DNA用EcoRⅠ進行消化，并在0.07%瓊脂糖凝膠上進行電泳。對質(zhì)粒PBrxl和PBrxl△復合的EcoRⅠ消化液也同樣作了分析。
對于載體PAcyc184而言37Kb BamH7片段的兩個定向都被確定，并分別稱為質(zhì)粒PBrx2和PBrx3。同樣也觀察到，三個EcoRⅠ片段位于自發(fā)地自質(zhì)粒PBrx2及PBrx3丟失的22Kb DNA片段的當中。這三個EcoRⅠ片段的大小分別為18Kb、3Kb和1.9Kb。編碼溴苯腈的特異性腈水解酶應該位于三個EcoRⅠ片段中的一個之中，否則腈水解酶的結(jié)構(gòu)基因則被EcoRⅠ限制性位點所分開。
對于大腸桿菌(PBrx3)的溴苯腈特異性腈水解酶的位置作了研究。結(jié)果如下所示表1溴苯腈特異性脂水解酶是大腸桿菌的胞漿周圍酶A 腈水解酶培養(yǎng)條件 專一活性toluenized細胞(L-肉湯) 0.829經(jīng)溶菌酶處理的細胞(L-肉湯) 0.796完整細胞(L-肉湯) 0.770完整細胞(L-肉湯+Br×1) 1.25完整細胞(M9) 0.950完整細胞(M9+Brx1) 1.45完整細胞/PAcyc184(M9) 0a.
含有質(zhì)粒PBrx3的大腸桿菌(3MM294)細胞在37℃下在指定的培養(yǎng)基5ml培養(yǎng)物生長至穩(wěn)定時期。培養(yǎng)物含2oug/ml氯霉素和0.04%溴苯腈(Brx1)。從每一培養(yǎng)物中收獲1ml培養(yǎng)物，用腈水解酶緩沖液(0.1MKPO4，PH7.5)洗一次并使細胞懸浮于0.1ml該緩沖液中。按照Harper在Biochem.J.(1977)第167卷685～692頁上介紹的方法用或不用3mm溴苯腈作為底物對50μml樣品的腈酶活性進行測定。
b.μmoleNH3/分·mg。對質(zhì)白進行測定以O.D.600為1.4＝10細胞/毫升＝150μg。
該數(shù)據(jù)表明腈水解酶在細胞中的位置是胞漿周圍空間中。所作的是第二個觀察是，該酶在缺少溴苯腈的培養(yǎng)物中能表達，這就表明酶3的表達不需要溴苯腈的誘導。
溴苯腈特異的腈水解酶的進一步純化克氏核囟(K.ozaenae)腈水解酶的進一步純化具有下列的結(jié)果。
表2從大腸桿菌中提純溴苯腈特異的腈水解酶(起始材料為6克細胞)組分體積蛋白 μmole NH3/分 S.A.b粗制a100ml 210mg 18.15 0.08635-50% 6ml 83mg 26.77 0.250(NH4)2SODEAE 56ml 19mg 15.52 0.820(Sephadex)交聯(lián)葡聚糖a.
在30℃下，在含有0.04%溴苯腈和葡萄糖和M9培養(yǎng)基上，細胞生長至(midlog)。通過細胞破碎，經(jīng)超離心并在含0.05MKPO4(PH7.5)和2.5mMDTT的緩沖液中進行透析制得粗提取物。在所有的腈水解酶測定中底物濃度均為3mM。
b.μmoleNH3/分ng規(guī)格為2.5cm×10cm的柱放在含0.05M KPO4(PH7.5)、2.5m MDTT和1mMEDTA的緩沖液中平衡。加入樣品，在上述的緩沖液對柱用300ml0.02M至0.40M Nacl的線性梯度對柱進行洗脫。在梯度末端用含1M Nacl的緩沖液。收集5ml組分，并用其0.075m交替組分的等分試樣進行腈酶活性的測定。單一酶活性的高峰在0.22M鹽濃度時被洗脫。大約75%的輸入腈水解酶活性被回收在活性組分中。
由DEAE柱得到的橫跨腈酯活性峰的各組分在0.02MKPO(PH7.5)下透析，每個組分有50μl(6μg蛋白)加入到11.25%變性的膠中。與來自DEAE柱的活性所得到的峰的相對應的富集蛋白帶是分子量為34，000的多肽。由柱分離的活性組分沒有富集到其它的多肽。這些數(shù)據(jù)支持了這樣的觀點溴苯腈特異腈水解酶是一種分子量大約為34，000的多肽，并且可能是一個單一基因的產(chǎn)物。
克隆PBrx2用EcoRⅠ完全消化，并分離出一個大約為19Kb的片段。該片段插入到EcoRⅠ消化的PAcyc184載體(3.9Kb)從而提供如上所述轉(zhuǎn)化進大腸桿菌的質(zhì)粒PBrx5。該質(zhì)粒用通常方法分離，并用于BglⅡ消化而獲得大約6.7Kb的仍然插入在PAcyc184載體中的片段。分離的質(zhì)粒PBrx7再用SmaⅠ及BglⅡ消化提供一個大約3.9Kb的被插入到Smal-BamHⅠ消化的PAcycl77(3.7Hb)中的片段。(Chang及Cohen著J.Bacteriol.(1987)134卷1141-1156)。所產(chǎn)生的能提供青霉素抗性的質(zhì)粒如前所述被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，轉(zhuǎn)化體在青霉素選擇的培養(yǎng)基上進行選擇，以提供將腈水解酶基因帶到一個3.9Kb片段上的質(zhì)粒PBrx8。
PBrx8用PstⅠ部份消化，片段被插入到PstⅠ消化過的PUC18上(yanisch-perron等著《基因》(1985)第33冊103至119頁)。所產(chǎn)生的質(zhì)粒在大腸桿菌中被克隆并對其腈水解酶活性進行篩選。一個克隆具有5.3Kb質(zhì)粒PBrx9被分離，并進一步用PstⅠ及HincⅡ消化，結(jié)果產(chǎn)生一個1210bp的沿自PstⅠ至HincⅡ、ClaⅠ、SalⅠ、ScaⅠ及SphⅠ其限制性位點的方向幾乎均勻地分開的片段。P-stⅠ-HincⅡ片段是按照Sanger等在《Proc.Natl.Acad。Sci.USA》(1977)第74冊5463～5468頁中所述的方法進行順序測定。所得到的順序(以適當編碼的氨基酸)陳列如下
基本上無5′-及用3′-非編碼側(cè)翼的PstⅠ-HincⅡ片段可以與EcoRⅠ聯(lián)結(jié)子聯(lián)結(jié)因EcoRⅠ消化，而后便可準備通過插入到PCGN451的EcoRⅠ位點而導入到植物的表達盒中。
PCGN451包括一個含有大約1，566bp的5-非編碼區(qū)該非編碼通過EcoRⅠ聯(lián)結(jié)Ⅰ與基因的3′端及大約1，349bp的3′-非編碼DNA融合的。根據(jù)Bar Rer等在《Plant Molecular Biology》(1983)2卷335頁的確定，PTi協(xié)調(diào)在3′區(qū)域為11，207～12，823，而在5′區(qū)域為13，643～15，208。5′片段是以下列方法獲得一個含有編碼區(qū)的5′末端的小亞克隆片端稱為一Bam HⅠ-EcoRⅠ片段被當作質(zhì)粒PCGN407在PBR322中被克隆。Bam HⅠ-EcoRⅠ片段在編碼區(qū)有一個XmnⅠ位點，而PBR322有兩個XmnⅠ位點。PCGN40用XmnⅠ進行消化，用Bal31核酸酶切除，并用EcoRⅠ聯(lián)接子加到這些片段中。經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ消化后，這些片段被按大小分段分離，再對分段分離物進行克隆及順序分析。在一種情況下，完整的編碼區(qū)和10bp的5′非轉(zhuǎn)譯順序被取出，留下5′非轉(zhuǎn)錄區(qū)，mRNA Cap位點和16bp的5′非轉(zhuǎn)譯區(qū)保持完整(到BamHⅠ位點)。通過在7%的丙烯酰胺凝膠上按片段大小進行分段分離獲得這樣的小片段，并洗脫出大約130bp長的片段。將這種按大小分段分離的DNA與M13mp9聯(lián)接，并對幾種克隆進行順序分析，并將這些順序與已知的章魚堿一合酶基因的順序相比較。該M13結(jié)構(gòu)被稱為PI4，它的質(zhì)粒用BamHⅠ和EcoRⅠ消化以提供小的片段，以連接到包括p Ti A6上游的5′順序的XhoⅠ到BamHⅠ片段(參見Garfinkel及Nester，J.Bacteriol，》(1980)144卷732頁)及和包含3′順序的EcoRⅠ到XhoⅠ片段上。所得到的XhoⅠ片段被克隆進入一個被稱為PCGN-426 PUC8衍生物的XhoⅠ位點。該質(zhì)粒不同于PUC8是因為具有其中充入DNA聚合酶Ⅰ的唯一的EcoRⅠ位點，并當一個XhoⅠ聯(lián)接子插入到PUC8的獨特HincⅡ位點時，由于HincⅡ限制性核酸內(nèi)切酶的核酸酶污染而失去PstⅠ及和HindⅢ位點。所得到的PCGN451質(zhì)粒具有一個單一的EcoRⅠ位點用于把蛋白質(zhì)編碼順序插入到5′非編碼區(qū)(該區(qū)含有包括T-DNA的右邊界區(qū)和m RNA帽子位點和16bp的5′非轉(zhuǎn)譯順序的1，550bp的5′非轉(zhuǎn)錄順序)和3′區(qū)域(該區(qū)含有267bp的編碼區(qū)、終止密碼子、196bp 3′-非轉(zhuǎn)譯DNA、polyA位點以及1，153bp的3′-非轉(zhuǎn)錄順序)之間。
包含章魚堿合酶(ocs)表達盒的XhoⅠ片段被插入到具有抗四環(huán)素和卡那霉素(Kanamycin)抗性基因的質(zhì)粒PCGN517。PCGN517是從PHC79通過轉(zhuǎn)導進來自PUC4的獨特的PstⅠ位點、Karn基因而制得(參見Vieira著《Gene》(1982)19卷259頁PCGN517用SalⅠ消化，并將XhoⅠ片段插入到獨特的SalⅠ位點上。
該XhoⅠ片段也同樣插入到第二個質(zhì)粒PCGN529中。PCGN529是通過將來自Tn5的Karn基因(參見Rothstein等者(1981)《Movable Genetic Elements》中99頁，Cold Spring Harbor實驗室，Cold Spring Harbor，紐約)和一個來自p RiA4 T-LDNA的2.4Kb的BglⅡ片段(參見White和Nester著《J.Bacteriol》(1980)144卷710頁)插入到在用Tn5的Karn基因取代p Acycl84的HindⅢ-BamHⅠ片段后仍然保留的BamHⅠ位點上而制得的。
包含ocs表達盒(在ocs表達盒的獨特ECORⅠ處EcoRⅠ腈水解酶基因被插入的XhoⅠ片段被分別地插入PCGN517和PCGN529以質(zhì)粒得到兩個，PN1和PN2，這兩個質(zhì)粒PN1和PN2分別用于導入A.Tumefaciens或A.rhizogenes以整合到Ti及和Ri-質(zhì)粒的TDNA中去。對各個質(zhì)粒的整合可以按照Comai等在《plasmid》(1983)10卷21-30頁中所描述的3-路雜交法(3-way mating)來完成。將含有質(zhì)粒p RK2073、PN1或PN2的大腸桿茵宿主及和A.tumefaciens A722(參見Garfin Kel著《J.BacteriOl》(1980)144卷732頁)或A.rhizogenes A4 T(參見white)著《ibid》(1980)144卷710頁)過夜培養(yǎng)，將合適的培養(yǎng)物混合，并涂抹到含有150mg/ml卡那霉素的AB板上。進行再劃線兩次。通過對農(nóng)業(yè)細菌DNA進行各個菌落分析來檢驗是否正確的整合。核酸內(nèi)切酶消化的DNA用切口轉(zhuǎn)譯的p Br X8進行探測。
與A.rhizogenes共同培養(yǎng)的煙草葉片的轉(zhuǎn)化和再生對煙草植物進行無菌培養(yǎng)25℃，白尖小時;Ms(1mg/l ⅠAA，0.15mg/ml激動素)通過主芽移植培養(yǎng)的三周齡的煙草植物被用作組織提供物。選擇(自頂部數(shù)第四片)嫩葉，剪下直徑為2mm葉圓片，置于盛有含1mg/l ⅠAA的1ml MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。經(jīng)避光過夜培養(yǎng)之后，將農(nóng)業(yè)細菌(Agrobacterium)(A772xPN1或PN2)細胞(10-10/ml植物培養(yǎng)基)加入到這些培養(yǎng)物中。然后在避光的情況下進行18～24小時的共培養(yǎng)。用缺少激素的含350mg/cefotaxine的Ms培養(yǎng)基洗滌葉片三次，以去除農(nóng)業(yè)細菌(Boehringer-Mannheim)。葉片被轉(zhuǎn)移到盛有10ml不含激素的Ms培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑為9厘米)中。用石蠟對Phytagar(Gibco，0.6%;cefotaxine，350mg/l)培養(yǎng)皿進行封口，并置于同樣條件下作為組織供體。將2～4周后出現(xiàn)的根割下，并置于在相同條件下加入2mg/l的LAA及2mg/l激動素的相同培養(yǎng)基中。在隨后的2至5周可以看到有再生芽長出。
用溴苯腈溶液對載于盆中的處于6片葉階段的植物進行直接噴霧。每株植物用一個4號花盆栽種，噴上2.5ml溴苯腈溶液。植物在一個溫度為25℃，相對濕度70%的生長室中進行60小時的照光生長。噴霧后，直至新葉片長度超過0.5cm時，共生長了9天。
植物可以通過下列的步驟而獲得對溴苯腈的抗性，并可在有溴苯腈存在下在田野種植而對它們的生長不產(chǎn)生不利的影響。
本發(fā)明通過使植物對除草劑特別是對一性間的芐腈除草劑產(chǎn)生抗性，而使植物得到改良。因此，編碼腈水解酶的基因可以導入植物宿主中，由此，使該基因進行表達，并賦于植物對芐腈的抗性。此外，該酶可以通過將在通常的細菌宿主中克隆基因而進行表達。具有可檢測的活性的酶具有廣泛用途，可用于分析被分析物或芐腈底物。此外，該酶及表達該酶的細菌可以用于去除芐腈殺蟲劑對環(huán)境的污染。
盡管前述的本發(fā)明為了便于理解起見，已經(jīng)通過描述和舉例而作了詳細地說明，而對于在附屬的權(quán)利要求
范圍內(nèi)所作的某些變化改進顯然也是可行的。
權(quán)利要求
1.一種分子量大約為34，000道爾頓足夠純的細菌腈水解酶，以溴苯腈為底物，純度至少具有比活性為0.1μmol NH/分·mg蛋白。
2.一種含有外來的可表達對于3，5-二鹵-P-羥基芐腈具有特異性的腈水解酶的細菌宿主。
3.一種含有分子量大約為34，000道爾頓的腈水解酶的組成物，該組成物以溴苯腈(bromoxynil)為底物，比活性至少具有大約0.1μmol NH3/分.mg蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的組成物，其特征在于，其中的腈水解酶為細菌腈水解酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的組成物，其特征在于，所述的細菌腈水解酶是從豆氏桿菌(Klebsiella)中得到的腈水解酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的組成物，其特征在于，所述的組成物其比活性至少具有大約為0.5NH3/分.mg蛋白。
7.一種具有表達對于3，5-二鹵-P-羥基芐腈具有特異性的腈水解酶的外來基團的細菌宿主。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的細菌宿主，其特征在于，所述的細菌宿主為大腸桿菌。
9.一種包括一個能在植物細胞中起作用的調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)控制下為溴苯腈(bromoxynil)和/或碘苯腈(ioxynil)特異的腈水解酶編碼的結(jié)構(gòu)基因的表達盒(Cassette)。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9所述的表達盒，其特征在于，其中所述的腈水解酶是細菌腈水解酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求
9或10所述的表達盒，其特征在于，所述的盒至少有一個T-DNA邊界區(qū)(border)
12.根據(jù)權(quán)利要求
9至11中任一項中所述的表達盒，其特征在于，其中所述的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域是從編碼奧派因(opine)的基團開始的。
13.一種能夠在含有如權(quán)利要求
9所述的表達盒的大腸桿菌及A.tumefaciens中的至少一個中進行復制的質(zhì)粒。
14.根據(jù)權(quán)利要求
13所述的質(zhì)粒，其特征在于，其中所述的表達盒至少有一個T-DNA邊界區(qū)(border)。
15.一種如說明書所列舉的DNA順序，說DNA順序聯(lián)結(jié)到和處在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下而不是聯(lián)結(jié)到在克氏桿菌(Klebsiella)中發(fā)現(xiàn)的對溴苯腈和/或碘苯腈特異的細菌腈水解酶的野生型轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。
16.根據(jù)權(quán)利要求
15所述的DNA順序，其特征在于，其中所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)是在植物中能起作用。
17.根據(jù)權(quán)利要求
15所述的DNA順序，其特征在于，其中所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)是在細菌中能起作用。
18.一種具有編碼為對3，5-二鹵-P-羥基芐腈特異的腈水解酶編碼的開放讀框架(open reading frame coding的DNA順序，該順序是在其5′未端的而不是野生型的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。
19.根據(jù)權(quán)利要求
18所述的DNA順序，其特征在于，其中所述的腈水解酶是一種細菌腈水解酶。
20.根據(jù)權(quán)利要求
19所述的DNA順序，其特征在于，該DNA順序是與來自克氏桿菌(Klebsiella)的DNA順序是基本上同源的。
21.一種包含如權(quán)利要求
9至12中任何一項所述的表達盒的植物細胞。
22.一種包含如權(quán)利要求
21所述的植物細胞的植物。
專利摘要
本發(fā)明提供對溴苯腈的腈基水解作用特異的腈水解酶、為該酶編碼的核苷酸順序，以及在其細胞中表達外源的腈水解酶的轉(zhuǎn)化細胞。該轉(zhuǎn)化細胞能表達腈水解酶以對環(huán)境進行解毒作用并保護對溴苯腈敏感的細胞免受細胞毒作用的影響。特別要使植物改良為對溴苯腈具有抗性。大腸桿菌菌株MM294(p Brx5)于1986年1月22日存放于A.T.C.C，并給予登記號53435。
文檔編號C12N15/00GK87100135SQ87100135
公開日1987年9月2日 申請日期1987年1月8日
發(fā)明者斯待卡·大衛(wèi) 申請人:羅訥—布郎克農(nóng)業(yè)化學公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan