專(zhuān)利名稱(chēng):用于評(píng)價(jià)和比較免疫組庫(kù)的方法
用于評(píng)價(jià)和比較免疫組庫(kù)的方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求于2008年4月16日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?1/045，586的優(yōu)選 權(quán)權(quán)益。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及鑒定生物標(biāo)志物的方法，和鑒定細(xì)胞群中T細(xì)胞受體、抗體和MHC重排 的方法。
發(fā)明背景
許多年來(lái)，科學(xué)家已經(jīng)知道某些疾病與特定的基因或遺傳突變有關(guān)。然而，遺傳原 因僅能解釋人類(lèi)中診斷的一部分疾病。許多疾病似乎在某種程度上與免疫系統(tǒng)對(duì)傳染原和 環(huán)境因素的應(yīng)答有聯(lián)系，但免疫系統(tǒng)如何在疾病諸如癌癥、阿爾茲海默病、肋軟骨炎、纖維 肌痛、狼瘡和其他疾病中發(fā)揮作用仍然需要確定。
人類(lèi)基因組包含總數(shù)為567-588個(gè)的Ig (免疫球蛋白)和TR(T細(xì)胞受體)基因 (339-354個(gè)Ig基因和2觀-234個(gè)TR基因)/單倍體基因組，它們位于7個(gè)主要基因座中。 它們包括405-418個(gè)V、32個(gè)D、105-109個(gè)J和25-29個(gè)C基因。功能性Ig和TR基因的數(shù) 目為每個(gè)單倍體基因組321-353個(gè)。它們包括187-216個(gè)V、28個(gè)D、86_88個(gè)J和20-21個(gè) C基因(http://imgt.cines.fr)。通過(guò)這些基因的重排，已經(jīng)估計(jì)可以產(chǎn)生大概2. 5 X IO7 種可能的抗體或T細(xì)胞受體。
盡管在種系水平，人類(lèi)能夠產(chǎn)生大量不同的Ig和TR，但對(duì)于特定個(gè)體，由于B細(xì)胞 和τ細(xì)胞發(fā)育期間的陰性選擇，可用的Ig和TR的數(shù)目實(shí)際上少得多。在一些個(gè)體中，此過(guò) 程可能不能去除一些將與機(jī)體的自身組織交叉反應(yīng)的細(xì)胞，并且這可能是一些類(lèi)型的自身 免疫性疾病的原因。
迄今少數(shù)疾病與機(jī)體對(duì)共同抗原的反應(yīng)(I^rinz，J.等，Eur. Τ. Immunol.(歐 洲免疫學(xué)雜志)(1999)29(10) :3360-3368, “ Selection of Conserved TCR VDJ Rearrangements in Chronic Psoriatic Plaques Indicates a Common Antigen in Psoriasis Vulgaris (在慢性銀屑病斑塊中保守的TCR VDJ重排的選擇指示尋常性銀屑病 中的共同抗原)〃)和/或?qū)μ囟ǖ腣DJ重排(Tamaru，J.等,Blood(血液)(1994)84(3) 708-715, “ Hodgkin ‘ s Disease with a B-cell Phenotype Often Shows a VDJ Rearrangement and Somatic Mutations in the Vh Genes (Mc^ B Ifi^M ^β^^^ΙΙ 常顯示VDJ重排和VH基因中的體細(xì)胞突變)“)相關(guān)。所需要的是用于評(píng)價(jià)人免疫應(yīng)答的 變化和將這些變化與特定疾病相關(guān)的更好方法。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生人和/或動(dòng)物的免疫狀態(tài)譜(immune status profile, ISP) 的方法。在本發(fā)明的一個(gè)方面，該方法包括以下的步驟使用靶特異性引物在第一次擴(kuò)增反 應(yīng)中擴(kuò)增來(lái)自至少一個(gè)人或動(dòng)物受試者的白細(xì)胞樣品中的至少一種RNA和/或DNA從而產(chǎn) 生至少一種擴(kuò)增子，所述靶特異性引物的至少一部分包含另外的核苷酸從而將共用引物的結(jié)合位點(diǎn)引入至所得的擴(kuò)增子中；從所述第一次擴(kuò)增反應(yīng)中拯救所述至少一種擴(kuò)增子；通 過(guò)在第二次擴(kuò)增反應(yīng)中加入共用引物，擴(kuò)增具有共用引物的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的所述第一 次擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增子；以及將所述所述第二次擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增子測(cè)序以鑒定和量化表現(xiàn)抗 體和/或受體重排的DNA序列，從而建立免疫狀態(tài)譜。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，從所述第一次擴(kuò)增反應(yīng)中拯救所述至少一種擴(kuò)增子的步 驟可以省略，并且第一次和第二次擴(kuò)增反應(yīng)可以在不將擴(kuò)增子與靶特異性引物分開(kāi)的條件 下進(jìn)行?；蚪MDNA也可以擴(kuò)增，并且擴(kuò)增DNA的步驟可以替代擴(kuò)增RNA的步驟，尤其是在 需要分析免疫系統(tǒng)組分諸如主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的情況下。
在本發(fā)明的多個(gè)方面中，自細(xì)胞亞群可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分離，從而將幼稚B細(xì) 胞、成熟B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、幼稚T細(xì)胞、成熟T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞分開(kāi)。在該方法的多個(gè) 方面中，細(xì)胞亞群的重組是B細(xì)胞免疫球蛋白重鏈(IgH)，κ和/或λ輕鏈(IgK，IgL)，T 細(xì)胞受體β、Y、S和/或主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子I或II的重排。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，該方法還可以包括將正常個(gè)體的群體的免疫細(xì)胞譜與 已經(jīng)診斷有疾病的個(gè)體的群體的免疫細(xì)胞譜進(jìn)行匯編和比較，以確定特定的重排或重排組 和所述疾病之間是否存在相關(guān)性。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，該方法可以包括將對(duì)已經(jīng)施用了疫苗的個(gè)體的群體鑒 定的免疫細(xì)胞譜與沒(méi)有施用疫苗的個(gè)體的群體的免疫細(xì)胞譜進(jìn)行比較以評(píng)價(jià)所述疫苗在 產(chǎn)生免疫應(yīng)答中的功效。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
圖Ia和圖Ib是圖示說(shuō)明通過(guò)本發(fā)明的方法使用本文公開(kāi)的引物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物 的存在的凝膠的照片。
圖2說(shuō)明用于(a)健康對(duì)照樣品中的Ig重鏈，(b)來(lái)自結(jié)腸癌患者的血樣中的 TCR^鏈，(c)來(lái)自慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者(CLL)的血樣中的IgK鏈，和(d)來(lái)自系統(tǒng) 性紅斑狼瘡患者(SLE)的血樣中的IgX鏈的結(jié)構(gòu)域的分布?？盏陌唿c(diǎn)表示缺少與相應(yīng)的 V-J組合相關(guān)的序列，并且柱的高度表示特定序列出現(xiàn)的頻率。
碰
本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種用于評(píng)價(jià)來(lái)自大量細(xì)胞的抗體和受體重排的方法，該方 法用于比較在個(gè)體的群體中鑒定的重排，以確定特定的重排或重排組和疾病，或疾病的某 些癥狀之間是否存在相關(guān)性。該方法還用于建立一個(gè)或多個(gè)個(gè)體響應(yīng)于傳染原和/或環(huán)境 因素的免疫應(yīng)答史，以及用于評(píng)價(jià)疫苗的功效。
本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生人和/或動(dòng)物的免疫狀態(tài)譜(ISP)的方法。在本發(fā)明的 一個(gè)方面中，該方法包括以下的步驟使用靶特異性引物在第一次擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增來(lái)自至 少一個(gè)人或動(dòng)物受試者的白細(xì)胞樣品中的至少一種RNA，從而產(chǎn)生至少一種擴(kuò)增子，所述靶 特異性引物的至少一部分包含另外的核苷酸以將共用引物的結(jié)合位點(diǎn)引入至所得的擴(kuò)增 子中；從所述第一次擴(kuò)增反應(yīng)中拯救所述至少一種擴(kuò)增子；通過(guò)在第二次擴(kuò)增反應(yīng)中加入 共用引物，擴(kuò)增具有共用引物的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的所述第一次擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增子；以及 將所述第二次擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增子測(cè)序以鑒定和量化表現(xiàn)抗體和/或受體重排的DNA序列， 從而建立免疫狀態(tài)譜。
在本文使用術(shù)語(yǔ)“包含”時(shí)，還可以使用“基本上由……組成”和“由……組成”。術(shù)語(yǔ)“免疫狀態(tài)譜”意指?jìng)€(gè)體或個(gè)體的群體的譜，該譜指示存在和/或不存在代表特定的重排 的序列以及它們出現(xiàn)的頻率，所述特定的重排代表人和/或動(dòng)物免疫系統(tǒng)的B細(xì)胞、T細(xì)胞 和/或其他細(xì)胞的多樣性。在本文中提到擴(kuò)增子“被拯救”時(shí)，要理解的是擴(kuò)增子拯救可以 通過(guò)將擴(kuò)增子與用來(lái)形成它們的引物分離而發(fā)生，或可以通過(guò)如下而發(fā)生，即，稀釋擴(kuò)增子 /引物混合物從而，由于來(lái)自第一次擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增子顯著多于引物的事實(shí)，使得那些引物 的作用在使用不同引物的第二次擴(kuò)增反應(yīng)中被最小化?！肮灿靡铩笔强梢杂脕?lái)擴(kuò)增通常具 有非全同序列但因?yàn)樗鼈兒邢嗤锏慕Y(jié)合位點(diǎn)而享有序列相似性的多核苷酸(例如， 通過(guò)靶特異性引物產(chǎn)生的來(lái)自第一次擴(kuò)增的擴(kuò)增子)的那些引物。共用引物通常針對(duì)其在 引導(dǎo)成功的擴(kuò)增時(shí)的效率來(lái)選擇，因此它們的應(yīng)用有效地在本發(fā)明的方法中以非靶特異性 的方式實(shí)現(xiàn)較高水平的擴(kuò)增。共用引物結(jié)合位點(diǎn)可以引入至由第一次擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增子 中，這通過(guò)將它們的序列或它們的互補(bǔ)序列與靶特異性引物的序列相連接而實(shí)現(xiàn)。共用引 物可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)許多弓I物設(shè)計(jì)方法來(lái)選擇。
白細(xì)胞亞群可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分離，從而將幼稚B細(xì)胞、成熟B細(xì)胞、記憶B細(xì) 胞、幼稚T細(xì)胞、成熟T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞分開(kāi)。在這些細(xì)胞亞群中的重組通常是B細(xì)胞免 疫球蛋白重鏈(IgH)，κ和/或λ輕鏈(IgK，IgL)，T細(xì)胞受體β、Y、δ和/或主要組織 相容性復(fù)合物(MHC)分子I或II的重排。
通過(guò)進(jìn)行另外的步驟，S卩，將正常個(gè)體的群體的平均免疫狀態(tài)譜與已經(jīng)診斷有疾 病的個(gè)體的群體的平均免疫狀態(tài)譜進(jìn)行匯編和比較的步驟，可能使用免疫細(xì)胞譜來(lái)確定在 特定的重排或重排組和所述疾病之間是否存在相關(guān)性。
本發(fā)明還提供了一種評(píng)價(jià)關(guān)于形成免疫細(xì)胞譜變化的疫苗功效的方法，該方法通 過(guò)執(zhí)行所述方法的各個(gè)步驟，并將對(duì)已經(jīng)施用了疫苗的個(gè)體的群體鑒定的免疫細(xì)胞譜與沒(méi) 有施用疫苗的個(gè)體的群體的免疫細(xì)胞譜進(jìn)行比較以評(píng)價(jià)所述疫苗在產(chǎn)生免疫應(yīng)答中的功 效。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，外周血樣品取自患者并且可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分離 白細(xì)胞的亞群從而將幼稚B細(xì)胞、成熟B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、幼稚T細(xì)胞、成熟T細(xì)胞和記憶 T細(xì)胞分開(kāi)。在所述方法的不同實(shí)施方案中，細(xì)胞的亞群中的重組可以包括B細(xì)胞免疫球蛋 白重鏈(IgH)，κ和/或λ輕鏈(IgK，IgL)，T細(xì)胞受體β、Y、δ和/或主要組織相容性 復(fù)合物(MHC)分子I或II的重排。
在一些方面，從第一次擴(kuò)增反應(yīng)中拯救擴(kuò)增子的步驟可以省略，并且兩次擴(kuò)增反 應(yīng)可以在同一反應(yīng)管中進(jìn)行而無(wú)需擴(kuò)增子拯救或稀釋由第一次擴(kuò)增反應(yīng)剩余的引物。
本發(fā)明人以前開(kāi)發(fā)了一種已知為t em-PCR的PCR方法，其已經(jīng)描述在公開(kāi)號(hào) W02005/038039中。最近，本發(fā)明已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種稱(chēng)為擴(kuò)增子拯救多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (arm-PCR)的方法，其描述在U. S. PCT/US09/39552和本文中。tem-PCR和arm-PCR兩種方 法在一次反應(yīng)中提供了對(duì)多種多核苷酸的半定量擴(kuò)增。另外，arm-PCR提供了增加的靈敏 度。兩種方法均提供了在一次反應(yīng)中擴(kuò)增多種多核苷酸的能力，這在本發(fā)明的方法中是有 益的，因?yàn)槔缍喾NT細(xì)胞和B細(xì)胞的組庫(kù)(i^pertoire)是如此之大。在擴(kuò)增反應(yīng)中加入 共用引物結(jié)合位點(diǎn)，和隨后使用共用引物對(duì)靶分子的擴(kuò)增，得到了定量或半定量的結(jié)果，這 使得可能確定患者血樣內(nèi)包含各種重排的細(xì)胞的相對(duì)量。由于識(shí)別抗原引起的克隆增殖 產(chǎn)生較大的識(shí)別該抗原的細(xì)胞群，并且通過(guò)其相對(duì)數(shù)目來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的評(píng)價(jià)提供了一種確定抗原暴露是否已經(jīng)影響了產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞和攜帶受體的T細(xì)胞的增殖的方法。例如， 這有助于評(píng)價(jià)是否可能存在特殊的細(xì)胞群，該細(xì)胞群在已經(jīng)診斷有特定疾病的個(gè)體中很普 遍，并且可以特別地有助于評(píng)價(jià)疫苗是否已經(jīng)在已經(jīng)給藥該疫苗的個(gè)體中實(shí)現(xiàn)了所需的免 疫應(yīng)答。
存在有幾種市售的高通量測(cè)序技術(shù)，諸如Roche Life Sciences 454 kquencing 。在此測(cè)序方法中，454A和454B引物在PCR期間連接(link)在PCR產(chǎn)物上 或在PCR反應(yīng)后連接(Iigate)在PCR產(chǎn)物上。當(dāng)結(jié)合tem-PCR或arm-PCR進(jìn)行時(shí)，454A和 454B引物可以用作擴(kuò)增反應(yīng)中的共用引物。將PCR產(chǎn)物，通常是不同序列的混合物，稀釋至 約200拷貝/μ 1。在“乳液PCR”反應(yīng)中，(半固體凝膠狀環(huán)境)稀釋的PCR產(chǎn)物在微珠的 表面上由引物(454Α或454Β)擴(kuò)增。因?yàn)镻CR模板是如此稀的，通常僅一個(gè)微珠靠近一個(gè) 模板，并且被限制在半固體的環(huán)境中，因此擴(kuò)增僅在微珠上和周?chē)l(fā)生。然后微珠被洗脫并 置于帶有專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的孔的板上。每個(gè)孔僅可以容納一個(gè)微珠。然后將試劑加入至孔中以進(jìn) 行焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)?？梢允褂美w維光學(xué)檢測(cè)器從各孔中讀取測(cè)序反應(yīng)并且由 計(jì)算機(jī)平行采集數(shù)據(jù)。一次這樣的高通量反應(yīng)可以生成至多達(dá)6000萬(wàn)個(gè)讀數(shù)(6000萬(wàn)個(gè) 微珠)并且每個(gè)讀數(shù)可以生成約300bp序列。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及免疫狀態(tài)譜，或“個(gè)人免疫組庫(kù)，，(personal immunorepertoires, PIRs)的數(shù)據(jù)庫(kù)的開(kāi)發(fā)，使得每個(gè)個(gè)體可以建立基線并且在幾年的時(shí) 間內(nèi)追蹤對(duì)已知和未知抗原的免疫應(yīng)答的發(fā)展。如果此信息收集自大量的個(gè)體，則該信息 可以提供流行病學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，其將產(chǎn)生有價(jià)值的信息，特別是關(guān)于諸如癌癥和心臟疾病的那 些疾病的發(fā)生，這些疾病被認(rèn)為經(jīng)常是由暴露于病毒或其他傳染原引起，所述病毒或其他 傳染原中的許多仍未被確認(rèn)。本發(fā)明的方法的一種特別重要的應(yīng)用是能夠進(jìn)行對(duì)兒童的研 究以確定感染性疾病、環(huán)境因素或疫苗是否可能是孤獨(dú)癥的病因。例如，許多人已經(jīng)假設(shè)疫 苗施用可以引發(fā)孤獨(dú)癥的發(fā)生。然而，許多人也將該潛在的相關(guān)性歸因于疫苗中諸如硫柳 汞的試劑的使用，并且研究已經(jīng)證明硫柳汞似乎不是該疾病的致病因子。仍存在著這樣的 推測(cè)，即混合疫苗(cocktail vaccine)的開(kāi)發(fā)與孤獨(dú)癥的病例數(shù)增加相關(guān)，然而，但收集數(shù) 據(jù)以評(píng)價(jià)多種抗原的潛在因果關(guān)系是非常困難的。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)化了該過(guò)程并且可以提 供關(guān)鍵性信息以更好地理解孤獨(dú)癥和其他疾病，在這些疾病中不同個(gè)體的免疫應(yīng)答可以對(duì) 暴露于試劑或一組試劑的一些個(gè)體中疾病的差異性發(fā)展，而其他同樣暴露的個(gè)體不發(fā)生該 疾病提供了解釋。
由感染引發(fā)的PIR的不平衡可以導(dǎo)致許多疾病，包括癌癥、白血病、神經(jīng)元疾病 (阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化癥、帕金森病、孤獨(dú)癥等)、自身免疫性疾病和代謝性疾病。這 些疾病可以稱(chēng)為MR疾病?？赡艽嬖谥鴥煞NMR疾病形式。(1)“功能缺失”形式，和O)“功 能獲得”興趣。在“功能缺失”形式中，人對(duì)疾病易感，因?yàn)樗?她的受限制的和/或有限的 PIR缺少產(chǎn)生最有效的和必需的Ig和TR的細(xì)胞。在“功能獲得”形式中，人對(duì)疾病易感，因 為他/她的P^獲得了產(chǎn)生正常情況下不應(yīng)存在的Ig和TR的細(xì)胞。在“功能缺失”(LOF) P^疾病中，個(gè)體不具有合適的功能性B細(xì)胞或T細(xì)胞以對(duì)抗疾病。他/她的HLA分型決定 了那些細(xì)胞在免疫細(xì)胞成熟過(guò)程的早期期間被清除，所述細(xì)胞通常被清除的原因是它們與 他/她的自身蛋白強(qiáng)烈地反應(yīng)。
本發(fā)明的一個(gè)方面還包括將患者免疫細(xì)胞譜結(jié)合識(shí)別信息輸入至數(shù)據(jù)庫(kù)中，所述識(shí)別信息諸如，例如，患者標(biāo)識(shí)號(hào)，包括患者的HLA類(lèi)型的代碼，包括可能已經(jīng)作出的一個(gè) 或多個(gè)臨床診斷的疾病代碼，包括樣品的日期的“分期代碼”，包括從其擴(kuò)增和測(cè)序RNA的 細(xì)胞亞群的類(lèi)型的細(xì)胞類(lèi)型代碼，以及包括對(duì)所述樣品鑒定的序列的一個(gè)或多個(gè)序列代碼。
所述的方法包括新的引物組，該引物組不僅允許擴(kuò)增整個(gè)免疫組庫(kù)，而且還允許 多重?cái)U(kuò)增，所述多重?cái)U(kuò)增是半定量的。多重?cái)U(kuò)增要求僅需要很少的PCR或RT-PCR反應(yīng)。例 如，使用對(duì)IgH、IgL或IgK特異的引物，存在的所有免疫球蛋白(Ig)序列可以在一個(gè)反應(yīng) 中擴(kuò)增，或可以單獨(dú)地進(jìn)行兩個(gè)或三個(gè)反應(yīng)。類(lèi)似地，T細(xì)胞受體(TRs)可以在僅僅一個(gè) 反應(yīng)中擴(kuò)增，或可以在少數(shù)的反應(yīng)中擴(kuò)增，包括命名為T(mén)RA，TRB, TRD和TRG的T細(xì)胞受體。 MHC基因可以在僅僅一個(gè)PCR反應(yīng)中擴(kuò)增。半定量擴(kuò)增允許多重反應(yīng)中的所有靶標(biāo)獨(dú)立地 擴(kuò)增，使得擴(kuò)增產(chǎn)物的終點(diǎn)分析反映靶標(biāo)中的初始內(nèi)比(internal ratio) 0因?yàn)楸３至嗽?比率，因此可能產(chǎn)生指示多種免疫系統(tǒng)細(xì)胞的存在或缺乏，以及相對(duì)數(shù)目的免疫細(xì)胞譜。根 據(jù)本發(fā)明的方法的RNA擴(kuò)增可以使用表1、2和/或3中列舉的任一或所有引物來(lái)進(jìn)行。因 此本發(fā)明提供一種方法，該方法使用選自由下列各項(xiàng)組成的組的至少一個(gè)(其可以當(dāng)然， 更優(yōu)選地包括至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)等)引物以進(jìn)行產(chǎn)生至少一種第一擴(kuò)增子的 第一次擴(kuò)增SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、 SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID N0:31、SEQ ID NO 32, SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、 SEQ ID NO51,SEQ ID NO52,SEQ ID NO 53,SEQ ID NO54,SEQ ID NO55,SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73、 SEQ ID NO74,SEQ ID NO75,SEQ ID NO 76,SEQ ID NO77,SEQ ID NO78,SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO :80、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :84、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :87、SEQ ID NO :88、SEQ ID NO :89、SEQ ID NO :90、SEQ ID NO :101,SEQ ID NO :102、SEQ ID NO 103,SEQ ID NO 104、SEQ ID NO 105,SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO :107、SEQ ID NO :108、SEQ ID NO :109、SEQ ID NO :110、SEQ ID NO 111、 SEQ ID NO :112,SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 114,SEQ ID NO 115、SEQ ID NO 116,SEQ ID NO :117, SEQ ID NO :118、SEQ ID NO :119、SEQ ID NO :120、SEQ ID NO :121、SEQ ID NO 122、SEQ ID NO :123、SEQ ID NO :124、SEQ ID NO :125、SEQ ID NO :126、SEQ ID NO :127、 SEQ ID NO :128,SEQ ID NO 129,SEQ ID NO 130,SEQ ID NO 131,SEQ ID NO 132,SEQ ID NO :133, SEQ ID NO :134、SEQ ID NO :135、SEQ ID NO :136、SEQ ID NO :137、SEQ ID NO 138、SEQ ID NO :139、SEQ ID NO :140、SEQ ID NO :151、SEQ ID NO :152、SEQ ID NO :153、 SEQ ID NO :154,SEQ ID NO 155,SEQ ID NO 156,SEQ ID NO 157,SEQ ID NO 158,SEQ ID NO :159, SEQ ID NO :160、SEQ ID NO :161、SEQ ID NO :162、SEQ ID NO :163、SEQ ID NO 164、SEQ ID NO :165、SEQ ID NO :166、SEQ ID NO :167、SEQ ID NO :168、SEQ ID NO :169、 SEQ ID NO :170,SEQ ID NO :171、SEQ ID NO 172,SEQ ID NO 173、SEQ ID NO 174,SEQ ID NO :175, SEQ ID NO :176、SEQ ID NO :177、SEQ ID NO :178、SEQ ID NO :179、SEQ ID NO 180、SEQ ID NO :181、SEQ ID NO :182、SEQ ID NO :183、SEQ ID NO :184、SEQ ID NO :185、 SEQ ID NO :186,SEQ ID NO 187,SEQ ID NO 188,SEQ ID NO 189,SEQ ID NO 190,SEQ ID NO :191, SEQ ID NO :192、SEQ ID NO :193、SEQ ID NO :194、SEQ ID NO :195、SEQ ID NO 196、SEQ ID NO :197、SEQ ID NO :198、SEQ ID NO :199、SEQ ID NO :200、SEQ ID NO :201、 SEQ ID NO :202,SEQ ID NO 203,SEQ ID NO 204,SEQ ID NO 205,SEQ ID NO 206,SEQ ID NO :207, SEQ ID NO :208、SEQ ID NO :209、SEQ ID NO :210、SEQ ID NO :211、SEQ ID NO 212、SEQ ID NO :213、SEQ ID NO :214、SEQ ID NO :215、SEQ ID NO :216、SEQ ID NO :217、 SEQ ID NO :218,SEQ ID NO :219、SEQ ID NO :220、SEQ ID NO :221、SEQ ID NO :222、SEQ ID NO :223, SEQ ID NO :224、SEQ ID NO :225、SEQ ID NO :226、SEQ ID NO :227、SEQ ID NO 228、SEQ ID NO :229、SEQ ID NO :230、SEQ ID NO :231、SEQ ID NO :232、SEQ ID NO :233、 SEQ ID NO :234,SEQ ID NO 235,SEQ ID NO 236,SEQ ID NO 237,SEQ ID NO 238,SEQ ID NO :239, SEQ ID NO :240、SEQ ID NO :241、SEQ ID NO :242、SEQ ID NO :243、SEQ ID NO 244、SEQ ID NO :245、SEQ ID NO :246、SEQ ID NO :247、SEQ ID NO :248、SEQ ID NO :249、 SEQ ID NO :250,SEQ ID NO :251、SEQ ID NO 252,SEQ ID NO 253,SEQ ID NO 254,SEQ ID NO :255, SEQ ID NO :256、SEQ ID NO :257、SEQ ID NO :258、SEQ ID NO :259、SEQ ID NO 260、SEQ ID NO :261、SEQ ID NO :262、SEQ ID NO :263、SEQ ID NO :264、SEQ ID NO :265、 SEQ ID NO :266,SEQ ID NO 267,SEQ ID NO 268,SEQ ID NO 269,SEQ ID NO 270,SEQ ID N0:271、SEQ ID NO :272、SEQ ID NO :273、SEQ ID NO :274、SEQ ID NO :275、SEQ ID NO :276、 SEQ ID NO :277,SEQ ID NO 278,SEQ ID NO 279,SEQ ID NO 280,SEQ ID NO :281、SEQ ID NO :282, SEQ ID NO :283、SEQ ID NO :284、SEQ ID NO :285、SEQ ID NO :286、SEQ ID NO 287、SEQ ID NO :288、SEQ ID NO :289、SEQ ID NO :290、SEQ ID NO :291、SEQ ID NO :292、 SEQ ID NO :293,SEQ ID NO 294,SEQ ID NO 295,SEQ ID NO 296,SEQ ID NO 297,SEQ ID NO :298,SEQ ID NO :299、SEQ ID NO :300、SEQ ID NO :301、SEQ ID NO :302、SEQ ID NO :303、 SEQ ID NO :304,SEQ ID NO 305,SEQ ID NO 306,SEQ ID NO 307,SEQ ID NO 308,SEQ ID NO :309, SEQ ID NO :310、SEQ ID N0:311、SEQ ID NO :312 和它們的組合，所述靶特異性引 物的至少一種包含另外的堿基對(duì)，使得所述擴(kuò)增導(dǎo)致將關(guān)于至少一種共用引物的結(jié)合序列 加入至所述至少一種第一擴(kuò)增子中；使用至少一種共用引物在第二次擴(kuò)增中擴(kuò)增所述至少 一種第一擴(kuò)增子以產(chǎn)生至少一種第二擴(kuò)增子；以及將所述至少一種第二擴(kuò)增子測(cè)序以鑒定 和量化由所述第一次和第二次擴(kuò)增產(chǎn)生的序列。列舉的引物由發(fā)明人設(shè)計(jì)以提供對(duì)其各自 RNA和/或DNA靶標(biāo)的有效擴(kuò)增。整組引物的使用有效地為個(gè)體產(chǎn)生詳細(xì)的免疫狀態(tài)譜。 然而，當(dāng)例如，特定的T細(xì)胞或B細(xì)胞的群體是特別感興趣的目標(biāo)時(shí)可能需要使用子集。 通過(guò)進(jìn)一步解釋?zhuān)旅娴膶?shí)施例可以說(shuō)明本發(fā)明的方法。在施用任一種疫苗之前 可以從兒童取血樣，每個(gè)兒童的那些血樣在本發(fā)明的方法中用來(lái)建立“基線”免疫狀態(tài)譜或 個(gè)人免疫組庫(kù)(PIR)，由其可以比較由以后幾年期間所取的血樣建立并通過(guò)本發(fā)明的方法 分析的未來(lái)免疫細(xì)胞譜。對(duì)于每名兒童，未來(lái)樣品可以利用來(lái)確定是否已經(jīng)存在對(duì)試劑的 暴露，所述暴露已經(jīng)增殖了已知與疾病相關(guān)的細(xì)胞群，并且這可以用作未來(lái)發(fā)生疾病的風(fēng)險(xiǎn)的“標(biāo)志物”。然后如此鑒定的個(gè)體可以被更密切地監(jiān)測(cè)使得可能進(jìn)行早期檢測(cè)，并且可 以在疾病過(guò)程中的較早期提供任何可利用的治療選擇。
例如，本發(fā)明的方法可以特別用于鑒定個(gè)體與自體免疫性疾病之間的共性，并且 可以提供流行病學(xué)數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)將更好地描述感染性因素和環(huán)境因素與疾病諸如心臟疾 病、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和癌癥之間的相關(guān)性，這提供發(fā)出疾病存在，或發(fā)生疾病的傾向 的信號(hào)的生物標(biāo)志物。
該方法還可以用于開(kāi)發(fā)被動(dòng)免疫治療。例如，在暴露于傳染原后，某些產(chǎn)生抗體的 B細(xì)胞和/或T細(xì)胞增殖。本發(fā)明的方法能夠鑒定例如，保護(hù)性抗體，并且那些抗體可以用 于在需要被動(dòng)免疫治療的情況下提供此種治療。
本發(fā)明的方法還可以提供實(shí)現(xiàn)靶向地去除具有不合乎需要的重排的細(xì)胞的能力， 該方法提供了可以鑒定這樣的細(xì)胞重排的方式。
本發(fā)明人已經(jīng)鑒定和開(kāi)發(fā)了用于本發(fā)明的方法中的靶特異性引物。T細(xì)胞特異性 引物顯示在表1中，抗體特異性引物顯示在表2中，和HLA特異性引物顯示在表3中。因 此，該方法可以包括使用表1、表2和/或表3的引物的任意組合來(lái)擴(kuò)增來(lái)自血樣的RNA和 /或DNA，并且更特別地來(lái)鑒定細(xì)胞群內(nèi)的抗體、T細(xì)胞受體和HLA分子。例如，T細(xì)胞分布 的分析可以利用表1 (SEQ ID NO=I-SEQ ID NO 157)中列舉的所有或部分引物。Ig的分析 可以利用表2(SEQ ID NO :158-SEQ ID NO :225)中列舉的所有或部分引物，和HLA分布的分 析可以利用表3(SEQ ID NO :159-SEQ ID NO :312)中列舉的所有或部分引物。
在tem-PCR反應(yīng)中，重疊基因特異性引物被設(shè)計(jì)成在初始PCR循環(huán)期間富集靶標(biāo)。 此后，使用通用“超級(jí)”引物來(lái)擴(kuò)增所有靶標(biāo)。引物被命名為F。(正向外側(cè))不(正向內(nèi)側(cè))、 Ri(反向內(nèi)側(cè))、R。(反向外側(cè))、FS(正向超級(jí)引物)和RS(反向超級(jí)引物)，超級(jí)引物對(duì)于 多種分子是共用的，這歸因于在靶特異性引物的末端處加入了那些引物的結(jié)合位點(diǎn)。基因 特異性引物(F。、F”氏和R。)以非常低的濃度使用。不同的引物在三個(gè)主要階段之一參與 tem-PCR過(guò)程。首先，在“富集”階段，給予低濃度的基因特異性引物以足夠的時(shí)間來(lái)發(fā)現(xiàn)模 板。對(duì)于每個(gè)目的靶標(biāo)，取決于使用哪種引物，可以生成四種可能的產(chǎn)物F。/R。、Fi/R。、Fi/ 氏和？。/%。富集階段典型地進(jìn)行10個(gè)循環(huán)。在第二個(gè)，或“標(biāo)記”階段，退火溫度升高至 72°C，并且僅長(zhǎng)度為40個(gè)核苷酸內(nèi)側(cè)引物(Fi和Ri)將起作用。在此標(biāo)記階段的10個(gè)循環(huán) 后，所有PCR產(chǎn)物被通用超級(jí)引物序列“標(biāo)記”。然后，在第三個(gè)“擴(kuò)增”階段，高濃度超級(jí)引 物有效地起作用以擴(kuò)增所有靶標(biāo)并在該過(guò)程期間用生物素標(biāo)記PCR產(chǎn)物。特異性探針可以 與Luminex⑧顏色涂覆珠共價(jià)連接。
為了擴(kuò)增編碼免疫球蛋白超家族分子的基因，本發(fā)明人基于公共領(lǐng)域中可獲得的 序列信息設(shè)計(jì)了嵌套引物。為了研究B細(xì)胞和T細(xì)胞VDJ重排，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增 重排的和表達(dá)的RNA的引物。通常，一對(duì)嵌套正向引物由V基因設(shè)計(jì)，且一組反向嵌套引物 由J或C基因設(shè)計(jì)。平均擴(kuò)增子大小為250-350bp。例如，對(duì)于IgHV基因，存在有123個(gè)基 因，它們可以分成7種不同的家族，并且本發(fā)明的引物被設(shè)計(jì)成家族特異性的。然而，如果 對(duì)擴(kuò)增的cDNA序列測(cè)序，則存在著足夠的序列多樣性，從而允許相同家族內(nèi)的基因中的進(jìn) 一步分化。對(duì)于MHC基因座，目的是擴(kuò)增基因組DNA。
本發(fā)明可以進(jìn)一步借助于下面非限制性實(shí)施例來(lái)說(shuō)明。實(shí)施例
T細(xì)胞或B細(xì)胞重排位點(diǎn)的擴(kuò)增
所有寡聚物使用Ix TE重懸。除454A和454B以外的所有寡聚物重懸至IOOpmol/ μ L的濃度。454Α和454Β重懸至IOOOpmol/ μ L的濃度。454Α和454Β在功能上是相同的， 均用作前面所述的共用引物，不同的序列用于追蹤高通量測(cè)序步驟。
制備三種不同的引物混合物。α δ引物混合物包含82種引物(所有均為 TRAV-C+TRDV-C)，β Y引物混合物包含79種引物(所有均為T(mén)RBVC和TRGV-C)，和B細(xì)胞引 物混合物包含總計(jì)70種引物。FpFi和氏引物處于lpmol/ μ L的濃度。R。引物處于5pmol/ μ L的濃度。454Α和454Β處于30pmol/ μ L的濃度。
三種不同的RNA樣品定購(gòu)自ALLCELLS(www. allcells. com)。所有樣品稀釋至^g/ μ L的終濃度。使用的樣品為ALL-PB-MNC (獲自急性淋巴細(xì)胞性白血病患者)>NPB-Pan T 細(xì)胞(正常T細(xì)胞)和NPB-B細(xì)胞(正常B細(xì)胞)。
使用Qiagen —步RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR。每個(gè)樣品含有下列成分
10 μ L Qiagen 緩沖液
2μ L DNTP' s
2 μ 1 酶
23. 5 μ L dH20
10 μ L適當(dāng)?shù)囊锘旌衔?br> 2. 5 μ L適當(dāng)?shù)哪０?總計(jì)IOng RNA)
使用下列的循環(huán)條件運(yùn)行樣品
50 "C 30 分鐘
95 "C 15 分鐘
94 "C 30 秒
15循環(huán)的
55 "C 1 分鐘
72 "C 1 分鐘
94 "C 15 秒
6循環(huán)的
70 "C 1 分 3O 秒
94 "C 15 秒
30循環(huán)的
55"C I5 秒
72 "C 15 秒
72 "C 3 分鐘
40C 保持
置于圖Ia中所示凝膠上的樣品的順序?yàn)?1)梯度標(biāo)志物(ladder) (500bp為最 大，以20bp的梯度降低，圖Ia中的中間明亮條帶為200bp) ； (2)含有IOng Pan T細(xì)胞模板 的α + δ引物混合物；(3)含有IOng Pan T細(xì)胞模板的β + Y引物混合物；(4)含有IOng B細(xì)胞模板的B細(xì)胞引物混合物；( 含有IOng全細(xì)胞(All Cell)模板的B細(xì)胞引物混合物；(6)含有IOng全細(xì)胞模板的α + δ引物混合物；(7)含有IOng全細(xì)胞模板的β + Y 引物混合物；8. α + δ引物混合物空白；(9) β + γ引物混合物空白；(IO)B細(xì)胞引物混合物 空白；(11)電泳緩沖液空白。這些樣品在預(yù)成型的ClearPAGE SDS 10%凝膠上使用IX ClearPAGE DNA非變性電泳緩沖液進(jìn)行電泳。
初步的試驗(yàn)顯示由包含模板的PCR反應(yīng)生成成片條帶。成片條帶表示生成了不同 大小的PCR產(chǎn)物，其代表不同的VDJ重排的混合物。存在一些來(lái)自B細(xì)胞反應(yīng)的背景擴(kuò)增。 對(duì)引物混合物的進(jìn)一步改良使反應(yīng)凈化。
為了確定PCR產(chǎn)物是否真正地包含不同的VDJ重排，需要分離和測(cè)序單個(gè)克隆。代 替使用常規(guī)的克隆方法，本發(fā)明人使用了不同的策略。由α δ混合物和β γ混合物產(chǎn)生 的PCR產(chǎn)物(圖Ia中的2道和3道)稀釋1 1000，并且將2 μ 1等分試樣用作下面反應(yīng) 中的PCR模板。然后，代替使用靶向整個(gè)組庫(kù)的弓I物混合物，使用一對(duì)特異性Fi和氏引物 (每種5pmol)來(lái)僅擴(kuò)增一種特異性PCR產(chǎn)物。使用下面的循環(huán)條件來(lái)擴(kuò)增樣品
95 "C 5 分鐘
30循環(huán)的
94 "C 30 秒
72 "C 1 分鐘
72 "C 3 分鐘
4 0C 保持
使用Qiagen PCR試劑盒來(lái)擴(kuò)增產(chǎn)物。用于PCR的Master Mix包含下列成分5yL IOx PCR 緩沖液，IyL dNTP,0. 25 μ L HotStartTaq Plus，和 39. 75 μ L H2O0 (對(duì)于用于 12 次反應(yīng)的混合物60 μ L IOx PCR 緩沖液，12 μ L dNTP, 3 μ L HotStartTaq Plus，和 477 μ L H2O。)
圖Ib中的凝膠照片顯示下列反應(yīng)的PCR產(chǎn)物⑴梯度標(biāo)志物；(2)含有α δ Pan T PCR 產(chǎn)物的 TRAVlFJTRACIii ； (3)含有 α δ Pan T PCR 產(chǎn)物的 TRAVZFjTRACIii 含有 α δ Pan T PCR 產(chǎn)物的 TRAVSFjTRACIii ； (5)含有 α δ Pan T PCR 產(chǎn)物的 TRAVAFjTRACRi ； (6)含有 α δ Pan T PCR 產(chǎn)物的 TRAVSFjTRACIii ； (7)含有 α δ Pan T PCR 產(chǎn)物的 TRAVlF^TRACRi (8)含有 α δ Pan T PCR產(chǎn)物的 TRAVZFjTRACRi ； (9)含有 α δ Pan T PCR產(chǎn) 物的 TRAVSFJTRACRi ； (10)含有 α δ Pan T PCR產(chǎn)物的 TRAVdFjTRACIii ； (11)含有 α δ Pan T PCR產(chǎn)物的TRAVSFJTRACRi ;(12)PCR空白。作為Fi列舉的引物為“正向內(nèi)側(cè)”引物，作為 F0列舉的引物是“正向外側(cè)”引物，Ri和R0分別表示“反向內(nèi)側(cè)”和“反向外側(cè)”引物。
如圖Ib所示，從每個(gè)反應(yīng)中產(chǎn)生了單個(gè)PCR產(chǎn)物。從不同的反應(yīng)中產(chǎn)生不同尺寸 的條帶。出于兩種主要的原因，此PCR克隆方法是成功的一(1)此反應(yīng)中使用的PCR模板是 稀釋的前次反應(yīng)的PCR產(chǎn)物(1 1000)，所述前次反應(yīng)使用引物混合物來(lái)擴(kuò)增所有可能的 VDJ重排(例如，使用包含總計(jì)82種引物的引物混合物來(lái)擴(kuò)增T細(xì)胞受體α和δ基因) 和(2)在此“克隆”試驗(yàn)期間的每個(gè)反應(yīng)中僅使用一對(duì)靶向特定的V基因的PCR引物。在 每種情況下，獲得單個(gè)克隆，并且鑒定與Fi引物相匹配的特定的T細(xì)胞受體V基因。
使用引物SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :312對(duì)免疫細(xì)胞RNA測(cè)序
使用用對(duì)某些細(xì)胞類(lèi)型特異的單克隆抗體包被的超順磁聚苯乙烯珠 (Dynabeads ，Invitrogen Corp. , Carlskid，加利福尼亞)根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Pan-T, pan-B和嗜中性粒細(xì)胞分離?？耿?珠用來(lái)分離pan-T細(xì)胞，抗⑶19珠用于分離 pan-B細(xì)胞和抗⑶15珠用于分離嗜中性粒細(xì)胞。分離的細(xì)胞重懸在300 μ 1 RNAProtect (Qiagen)試劑中，并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。
T細(xì)胞亞群分離自正常的48歲亞洲男性患者。PMBC獲自通過(guò)密度離心經(jīng)Ficoll Prep Plus試劑在肝素鈉中收集的40ml全血。Pan-T細(xì)胞使用磁珠分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Auburn，加利福尼亞)根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書(shū)分離自單核層?？耿?和抗⑶25珠 用來(lái)分離調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，抗CD56用于分離NKT細(xì)胞，抗CD8用于分離細(xì)胞毒T細(xì)胞，和抗 ⑶4和抗⑶294用于分離Th2細(xì)胞。Thl細(xì)胞經(jīng)陰性選擇分離。單獨(dú)的40ml收集在肝素鈉 中的全血的樣品用來(lái)獲得初始(naive)、活化和記憶T細(xì)胞亞群?？耿?5RA珠用來(lái)分離初 始T細(xì)胞，抗CD69用于分離活化的T細(xì)胞和抗CD45R0珠用于分離記憶T細(xì)胞。分離的細(xì) 胞重懸在300 μ IRNAProtect 試劑^jiagen)中。細(xì)胞使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。
使用QIAmp DNA微型試劑盒^jiagen)使用生產(chǎn)廠商提供的試驗(yàn)方案從分離的 嗜中性粒細(xì)胞進(jìn)行DNA提取。使用RNeasy 試劑盒^jiagen)根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的試驗(yàn) 方案從T細(xì)胞亞群提取RNA。提取的DNA和RNA的濃度使用Nanodrop 技術(shù)(Nanodrop Technologies，Wilmington，特拉華)測(cè)量。樣品保存在 _80°C。
根據(jù)本發(fā)明的方法使用嵌套式PCR進(jìn)行RT-PCR以擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)和靶特異性引物， 從而將共用引物結(jié)合序列引入至第一次擴(kuò)增反應(yīng)中所得的擴(kuò)增子中。然后共用引物在第二 次擴(kuò)增反應(yīng)中使用，以指數(shù)性地?cái)U(kuò)增從第一次擴(kuò)增反應(yīng)中拯救的擴(kuò)增子，同時(shí)保持每種擴(kuò) 增子的相對(duì)比率。使用一步RT-PCR試劑盒^jiagen)進(jìn)行PCR。類(lèi)似地進(jìn)行用于HLA分型 的DNA擴(kuò)增，但使用多重PCR試劑盒Oliagen)。每種擴(kuò)增子混合物使用Roche妨4測(cè)序平 臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。
通過(guò)在不同時(shí)間點(diǎn)采樣外周血中不同的淋巴細(xì)胞亞群，對(duì)一個(gè)單個(gè)體(正常的 48歲亞洲男性)產(chǎn)生了超過(guò)160萬(wàn)個(gè)有效序列。另外，對(duì)于結(jié)腸癌、CLL、SLE和第二名 健康患者(32歲白種男性)產(chǎn)生了 170，734個(gè)有效序列。在此研究中產(chǎn)生的獨(dú)特讀數(shù) 的數(shù)目與表1中的公共數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有的獨(dú)特讀數(shù)的數(shù)目相比較。通過(guò)用'human[orgn] AND(immunoglobulin[titl]OR T—cell receptor[titl])AND mRNA[titl]‘(‘人[orgn]禾口 (免疫球蛋白[titl]或T細(xì)胞受體[titl])和mRNA[titl]’)的詞條搜索Genbank核苷酸 數(shù)據(jù)庫(kù)匯編公共序列數(shù)據(jù)集。另外，使用Python腳本(Python script)收集注解的IMGT/ LIGM-DB (Brezinschek等，1995) cDNA序列。合并兩個(gè)數(shù)據(jù)集，并且對(duì)任何冗余序列保持一 個(gè)拷貝。
分析健康對(duì)照、CLL、結(jié)腸癌和SLE樣品中V、和J基因片段的偏向性使用(Biased usage)。在結(jié)腸癌樣品和SLE樣品中結(jié)構(gòu)域使用的偏向性對(duì)TCRi3鏈非常突出，而在健康 對(duì)照樣品中結(jié)構(gòu)域的使用十分正常，沒(méi)有對(duì)于任何特定結(jié)構(gòu)域的顯著偏向性。顯然結(jié)腸癌 和SLE譜型不僅顯示克隆增殖，而且證明還喪失了整體的多樣性。
在來(lái)自正?；颊叩膒an-T和pan-B群中見(jiàn)到的功能性種系V、J基因片段的分布表 明87. 2%的潛在組合具有觀察到的序列。在此研究中僅沒(méi)有觀察到IGHV3-d，而在其他樣 品中以極低的頻率觀察到TRBV4-3、IGHV3-d、IGHV4-30-4和IGHV4-31和IGHL3-22。以前 的研究沒(méi)有揭示與IGHV3-d相關(guān)的任何cDNA序列，這表明IGHV3_d可能很少被使用。一些 序列以很高的數(shù)目(例如，1000)存在，而另一些以顯著較低的數(shù)目存在。本發(fā)明人認(rèn)為較高的數(shù)目代表淋巴細(xì)胞克隆增殖，反映受試者中的真實(shí)免疫應(yīng)答。正常個(gè)體中VH基因分布 的研究以前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用的頻率通常與種系復(fù)雜性類(lèi)似，而許多免疫應(yīng)答顯示V、D和J基 因片段的使用中的一定水平的偏向性。
表 1
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生人和/或動(dòng)物的免疫狀態(tài)譜的方法，該方法包括(a)使用靶特異性引物，在第一次擴(kuò)增中，擴(kuò)增來(lái)自人或動(dòng)物受試者的白細(xì)胞樣品中的 至少一種DNA和/或RNA從而產(chǎn)生至少一種第一擴(kuò)增子，所述靶特異性引物的至少一部分 包含另外的核苷酸，從而將共用引物的結(jié)合位點(diǎn)引入至所述至少一種第一擴(kuò)增子中；(b)從所述第一次擴(kuò)增中拯救所述至少一種第一擴(kuò)增子；(c)使用至少一個(gè)共用引物，在第二次擴(kuò)增中，擴(kuò)增所述至少一種第一擴(kuò)增子以產(chǎn)生至 少一種第二擴(kuò)增子；以及(d)將所述至少一種第二擴(kuò)增子測(cè)序以鑒定和量化表現(xiàn)重排的一個(gè)或多個(gè)DNA序列， 從而建立免疫狀態(tài)譜。
2.權(quán)利要求
1所述的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟(e)將所述一個(gè)或多個(gè)DNA序列輸 入至數(shù)據(jù)庫(kù)中以提供可以存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)、服務(wù)器或其他電子存儲(chǔ)設(shè)備上的數(shù)據(jù)，(f)將鑒定 與所述序列對(duì)應(yīng)的個(gè)體的信息和特征的數(shù)據(jù)集作為可以存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)、服務(wù)器或其他電子 存儲(chǔ)設(shè)備上的數(shù)據(jù)輸入，以及(g)對(duì)于一個(gè)或多個(gè)個(gè)體評(píng)價(jià)步驟(e)和步驟(f)的數(shù)據(jù)，以 確定在所述一個(gè)或多個(gè)序列和與所述一個(gè)或多個(gè)序列對(duì)應(yīng)的所述個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)特征 之間是否存在相關(guān)性。
3.權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述靶特異性引物選自下列各項(xiàng)組成的組SEQID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO :8, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:.13、SEQ IDNO:14,SEQ IDNO:15,SEQ IDNO:16,SEQ IDNO:17,SEQ IDNO:18,SEQ IDNO 19、SEQIDNO 20,SEQIDNO :31、SEQIDNO 32、SEQIDNO 33, SEQIDNO 34、SEQIDNO :35,SEQIDNO :36,SEQIDNO :37,SEQIDNO :38,SEQIDNO :39,SEQIDNO :40,SEQID NO:41,SEQID NO:42,SEQID NO :43,SEQID NO 44、SEQID NO 45、SEQID NO .46、SEQ IDNO:47,SEQ IDNO:48,SEQ IDNO:49,SEQ IDNO:50,SEQ IDNO:51,SEQ IDNO 52、SEQIDNO 53,SEQIDNO 54, SEQIDNO 55、SEQIDNO :56, SEQIDNO 57、SEQIDNO :58,SEQIDNO :59,SEQIDNO :60,SEQIDNO :61,SEQIDNO :62,SEQIDNO :63,SEQID NO:64,SEQID NO:65,SEQID NO :66,SEQID NO 67、SEQID NO 68、SEQID NO .69、SEQ IDNO:70,SEQ IDNO:71,SEQ IDNO:72,SEQ IDNO:73,SEQ IDNO:74,SEQ IDNO :75,SEQ ID NO :76、SEQ ID NO :77、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :79、SEQID NO :80、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :84、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :87,SEQ ID NO :88、SEQ ID NO :89、SEQ ID NO :90、SEQ ID NO =IOUSEQ ID NO : 102、 SEQ ID NO :103,SEQ ID NO :104,SEQ ID NO :105,SEQ ID NO :106,SEQ ID NO :107,SEQ ID NO :108, SEQ ID NO :109, SEQ ID NO :110、SEQ ID NO : 111、SEQ ID NO :112、SEQ ID NO 113、SEQ I DNO :114, SEQ ID NO :115, SEQ ID NO :116, SEQ ID NO :117, SEQ ID NO :118, SEQ ID NO 119,SEQ ID NO :120,SEQ ID NO :121、SEQ ID NO :122,SEQ ID NO : 123、SEQ ID NO :124, SEQ ID NO :125, SEQ ID NO :126, SEQ ID NO :127, SEQ ID NO :128, SEQ ID NO 129、SEQ ID NO :130, SEQ ID NO :131, SEQ ID NO :132, SEQ ID NO :133, SEQ ID NO :134, SEQ ID NO :135,SEQ ID NO : 136、SEQ ID NO :137,SEQ ID NO : 138、SEQ ID NO :139,SEQ ID NO :140, SEQ ID NO :151, SEQ ID NO :152, SEQ ID NO :153, SEQ ID NO :154, SEQ ID NO 155、SEQ ID NO :156, SEQ ID NO :157, SEQ ID NO :158, SEQ ID NO :159, SEQ ID NO :160,SEQ ID NO :161, SEQ ID NO :162、SEQ ID NO :163、SEQ ID NO :164、SEQ ID NO :165、SEQ ID NO :166,SEQ ID NO 167,SEQ ID NO 168,SEQ ID NO 169,SEQ ID NO 170,SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO :172、SEQ ID NO :173、SEQ ID NO :174、SEQ ID NO :175、SEQ ID NO :176、 SEQ ID NO :177,SEQ ID NO 178,SEQ ID NO 179,SEQ ID NO 180,SEQ ID NO 181,SEQ ID NO :182, SEQ ID NO :183、SEQ ID NO :184、SEQ ID NO :185、SEQ ID NO :186、SEQ ID NO 187、SEQ ID NO :188、SEQ ID NO :189、SEQ ID NO :190、SEQ ID NO :191、SEQ ID NO :192、 SEQ ID NO :193,SEQ ID NO 194、SEQ ID NO 195,SEQ ID NO :196、SEQ ID NO 197,SEQ ID NO :198, SEQ ID NO :199、SEQ ID NO :200、SEQ ID NO :201、SEQ ID NO :202、SEQ ID NO 203、SEQ ID NO :204、SEQ ID NO :205、SEQ ID NO :206、SEQ ID NO :207、SEQ ID NO :208、 SEQ ID NO :209,SEQ ID NO :210、SEQ ID NO :211、SEQ ID NO :212、SEQ ID NO :213,SEQ ID NO :214, SEQ ID NO :215, SEQ ID NO :216, SEQ ID NO :217, SEQ ID NO :218, SEQ ID NO 219、SEQ ID NO :220, SEQ ID NO :221, SEQ ID NO :222, SEQ ID NO :223, SEQ ID NO :224, SEQ ID NO :225,SEQ ID NO :226,SEQ ID NO :227,SEQ ID NO :228,SEQ ID NO :229,SEQ ID NO :230, SEQ ID NO :231、SEQ ID NO :232, SEQ ID NO :233, SEQ ID NO :234, SEQ ID NO 235、SEQ ID NO :236, SEQ ID NO :237, SEQ ID NO :238, SEQ ID NO :239, SEQ ID NO :240, SEQ ID NO :241,SEQ ID NO :242,SEQ ID NO :243,SEQ ID NO :244,SEQ ID NO :245、SEQ ID NO :246, SEQ ID NO :247, SEQ ID NO :248, SEQ ID NO :249, SEQ ID NO :250, SEQ ID NO 251、SEQ ID NO :252, SEQ ID NO :253, SEQ ID NO :254, SEQ ID NO :255, SEQ ID NO :256, SEQ ID NO :257,SEQ ID NO :258,SEQ ID NO :259,SEQ ID NO :260,SEQ ID NO :261,SEQ ID NO :262, SEQ ID NO :263, SEQ ID NO :264, SEQ ID NO :265, SEQ ID NO :266, SEQ ID NO 267、SEQ ID NO :268, SEQ ID NO :269, SEQ ID NO :270, SEQ ID NO :271, SEQ ID NO :272, SEQ ID NO :273,SEQ ID NO :274、SEQ ID NO :275、SEQ ID NO :276、SEQ ID NO :277、SEQ ID NO :278, SEQ ID NO :279, SEQ ID NO :280, SEQ ID NO :281、SEQ ID NO :282, SEQ ID NO 283、SEQ ID NO :284, SEQ ID NO :285, SEQ ID NO :286, SEQ ID NO :287, SEQ ID NO :288, SEQ ID NO :289,SEQ ID NO :290,SEQ ID NO :291,SEQ ID NO :292,SEQ ID NO :293,SEQ ID NO :294, SEQ ID NO :295, SEQ ID NO :296, SEQ ID NO :297, SEQ ID NO :298, SEQ ID NO 299、SEQ ID NO :300, SEQ ID NO :301、SEQ ID NO :302, SEQ ID NO :303, SEQ ID NO :304, SEQ ID NO :305,SEQ ID NO :306,SEQ ID NO :307,SEQ ID NO :308,SEQ ID NO :309,SEQ ID NO :310, SEQ ID NO :311, SEQ ID NO :312 和它們的組合。
4. 一種用于產(chǎn)生免疫應(yīng)答譜的方法，該方法包括使用選自由以下各項(xiàng)組成的組的靶特異性引物擴(kuò)增來(lái)自人或動(dòng)物受試者的RNA和/或 DNA以進(jìn)行第一次擴(kuò)增，產(chǎn)生至少一種第一擴(kuò)增子SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37, SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、 SEQ ID NO :43,SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45,SEQ ID NO :46,SEQ ID NO :47,SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50, SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :53、SEQ IDNO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、 SEQ ID NO66,SEQ ID NO67,SEQ ID NO68,SEQ ID NO 69,SEQ ID NO70,SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :74、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :76、SEQ ID NO :77、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :79、SEQ ID NO :80、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :84、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :87、SEQ ID NO :88、 SEQ ID NO :89、SEQ ID NO :90、SEQ ID NO :101、SEQ ID NO :102、SEQ ID NO :103、SEQ ID NO :104, SEQ ID NO :105、SEQ ID NO :106、SEQ ID NO :107、 109、SEQ ID NO :110、SEQ ID NO :111、SEQ ID NO :112、SEQ SEQ ID NO :115,SEQ ID NO 116,SEQ ID NO 117、SEQ ID NO NO :120, SEQ ID NO :121、SEQ ID NO :122、SEQ ID NO :123、 125、SEQ ID NO :126、SEQ ID NO :127、SEQ ID NO :128、SEQ SEQ ID NO :131,SEQ ID NO 132,SEQ ID NO 133,SEQ ID NO NO :136, SEQ ID NO :137、SEQ ID NO :138、SEQ ID NO :139、 151、SEQ ID NO :152、SEQ ID NO :153、SEQ ID NO :154、SEQ SEQ ID NO :157,SEQ ID NO 158,SEQ ID NO 159,SEQ ID NO NO :162, SEQ ID NO :163、SEQ ID NO :164、SEQ ID NO :165、 167、SEQ ID NO :168、SEQ ID NO :169、SEQ ID NO :170、SEQ SEQ ID NO :173,SEQ ID NO 174,SEQ ID NO 175、SEQ ID NO NO :178, SEQ ID NO :179、SEQ ID NO :180、SEQ ID NO :181、 183,SEQ ID NO 184,SEQ ID NO 185,SEQ ID NO 186,SEQ ID NO 187,SEQ ID NO :188、SEQ ID NO :189,SEQ ID NO :190、SEQ ID NO 191,SEQ ID NO :192、SEQ ID NO 193,SEQ ID NO: 194,SEQ ID NO 195,SEQ ID NO :196、SEQ ID NO :197、SEQ ID NO 198、SEQ ID NO 199,SEQ ID NO :200,SEQ ID NO :201、SEQ ID NO 202,SEQ ID NO 203,SEQ ID NO 204,SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO :206、SEQ ID NO :207、SEQ ID NO :208、SEQ ID NO :209、SEQ ID NO :210、 SEQ ID NO :211,SEQ ID NO :212、SEQ ID NO :213、SEQ ID NO NO :216, SEQ ID NO :217, SEQ ID NO :218, SEQ ID NO :219, 221、SEQ ID NO :222, SEQ ID NO :223, SEQ ID NO :224, SEQ SEQ ID NO :227,SEQ ID NO :228,SEQ ID NO :229,SEQ ID NO NO :232, SEQ ID NO :233, SEQ ID NO :234, SEQ ID NO :235, 237、SEQ ID NO :238, SEQ ID NO :239, SEQ ID NO :240, SEQ SEQ ID NO :243,SEQ ID NO :244、SEQ ID NO :245、SEQ ID NO NO :248, SEQ ID NO :249, SEQ ID NO :250, SEQ ID NO :251、 253、SEQ ID NO :254, SEQ ID NO :255, SEQ ID NO :256, SEQ SEQ ID NO :259,SEQ ID NO :260,SEQ ID NO :261,SEQ ID NO NO :264, SEQ ID NO :265, SEQ ID NO :266, SEQ ID NO :267, 269、SEQ ID NO :270, SEQ ID NO :271、SEQ ID NO :272, SEQ SEQ ID NO :275,SEQ ID NO :276,SEQ ID NO :277,SEQ ID NO NO :280, SEQ ID NO :281, SEQ ID NO :282, SEQ ID NO :283,SEQ ID NO :108, SEQ ID NO ID NO :113, SEQ ID NO :114, :118,SEQ ID NO :119,SEQ ID SEQ ID NO :124, SEQ ID NO ID NO :129, SEQ ID NO :130, :134,SEQ ID NO :135,SEQ ID SEQ ID NO :140, SEQ ID NO ID NO :155, SEQ ID NO :156, :160,SEQ ID NO : 161、SEQ ID SEQ ID NO :166, SEQ ID NO ID NO :171, SEQ ID NO :172, :176, SEQ ID NO :177,SEQ ID SEQ ID NO :182, SEQ ID NO :214,SEQ ID NO :215,SEQ ID SEQ ID NO :220, SEQ ID NO ID NO :225, SEQ ID NO :226, :230,SEQ ID NO :23USEQ ID SEQ ID NO :236, SEQ ID NO ID NO :241, SEQ ID NO :242, :246,SEQ ID NO :247、SEQ ID SEQ ID NO :252, SEQ ID NO ID NO :257, SEQ ID NO :258, :262,SEQ ID NO :263,SEQ ID SEQ ID NO :268, SEQ ID NO ID NO :273, SEQ ID NO :274, :278,SEQ ID NO :279,SEQ ID SEQ ID NO :284, SEQ ID NO 。285、SEQ ID NO :286、SEQ ID NO :287、SEQ ID NO :288、SEQ ID NO :289、SEQ ID NO :290、 SEQ ID NO :291,SEQ ID NO 292,SEQ ID NO 293,SEQ ID NO 294,SEQ ID NO 295,SEQ ID NO :296, SEQ ID NO :297、SEQ ID NO :298、SEQ ID NO :299、SEQ ID NO :300、SEQ ID NO 301、SEQ ID NO :302、SEQ ID NO :303、SEQ ID NO :304、SEQ ID NO :305、SEQ ID NO :306、 SEQ ID NO :307,SEQ ID NO 308,SEQ ID NO 309,SEQ ID NO :310、SEQ ID NO :311、SEQ ID NO 312和它們的組合，所述靶特異性引物的至少一種包含另外的堿基對(duì)，使得所述擴(kuò)增導(dǎo) 致將關(guān)于至少一種共用引物的結(jié)合序列加入至所述至少一種第一擴(kuò)增子中；使用至少一種共用引物在第二次擴(kuò)增中擴(kuò)增所述至少一種第一擴(kuò)增子以產(chǎn)生至少一 種第二擴(kuò)增子；以及將所述至少一種第二擴(kuò)增子測(cè)序以鑒定和量化由所述第一次和第二次 擴(kuò)增產(chǎn)生的序列。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種方法，該方法擴(kuò)增來(lái)自免疫細(xì)胞群的RNA和/或DNA，使用擴(kuò)增的產(chǎn)物以產(chǎn)生免疫應(yīng)答譜和評(píng)價(jià)正?；虍惓Ｃ庖邞?yīng)答與諸如自身免疫性疾病、癌癥、糖尿病或心臟疾病的疾病的發(fā)生之間的可能的相關(guān)性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN102066578SQ200980121854
公開(kāi)日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2009年4月16日
發(fā)明者韓建 申請(qǐng)人:哈森阿爾法生物技術(shù)研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan