專利名稱:用于預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)新發(fā)作的自身免疫性糖尿病的基于微球的組合物的制作方法
用于預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)新發(fā)作的自身免疫性糖尿病的基于微
球的組合物
關(guān)于政府權(quán)益的陳述
本發(fā)明是在國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health) (NIH)提供的資 助號(hào)為R21 DK49835-01的政府資助下做出的。政府在本發(fā)明中享有一定權(quán)利。
與相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求2008年4月18日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 61/046，034和2008 年4月28日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 61/048，246的優(yōu)先權(quán)。每個(gè)上述申請(qǐng)的全部文 本在此引為參考。
背景技術(shù)：
總的來說，本公開涉及在NOD小鼠中預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)自身免疫性糖尿病病癥的反 義方法。這包括通過注射用微球投送AS-寡核苷酸，以特別是在非肥胖型糖尿病(NOD)小 鼠模型中實(shí)現(xiàn)導(dǎo)致負(fù)調(diào)節(jié)活性的治療效果。微球使用完全水性條件制造，其中微球包含一 種或多種反義(AS)寡核苷酸。
微粒、微球和微囊是直徑小于1毫米并可以小于100微米的固體或半固體粒子，其 可以由各種不同材料形成，包括合成聚合物、蛋白和多糖。微球已經(jīng)使用在許多不同應(yīng)用 中，主要是分離、診斷和藥物投送。
可以使用許多不同技術(shù)從合成聚合物、天然聚合物、蛋白和多糖來制造這些粒 子，這些技術(shù)包括相分離、溶劑蒸發(fā)、乳化作用和噴霧干燥。一般來說，聚合物形成這些微 球的支撐結(jié)構(gòu)，并且目標(biāo)藥物摻入到聚合物結(jié)構(gòu)中。用于形成微球的示例性聚合物包括 在Ruiz的美國(guó)專利No. 5，213，812、Reid等的美國(guó)專利No. 5，417，986、Tice等的美國(guó)專 利 No. 4，530，840、Tice 等的美國(guó)專利 No. 4，897，268、Tice 等的美國(guó)專利 No. 5，075，109、 Singh等的美國(guó)專利No. 5，102，872、Boyes等的美國(guó)專利No. 5，384，133、Tice等的美國(guó)專 利No. 5,360,610以及南方研究所(Southern Research Institute)的歐洲專利申請(qǐng)公開 號(hào)248，531中所描述的乳酸和乙醇酸的同聚物和共聚物(PLGA)；嵌段共聚物例如在Illum 的美國(guó)專利No. 4，904, 479中描述的Tetronic 908和泊洛沙姆(poloxamer) 407 ；以及在 Cohen等的美國(guó)專利No. 5，149，543中描述的聚磷腈。使用例如這些聚合物產(chǎn)生的微球表 現(xiàn)出不良的負(fù)載效能，通常只能將少量百分比的目標(biāo)藥物摻入到聚合物結(jié)構(gòu)中。因此，為 了獲得治療效果，通常必須給藥顯著量的這些類型的微球。此外，這些聚合物典型是疏水 的，對(duì)目標(biāo)藥物的溶解具有負(fù)面影響。在這種情況下典型使用的聚合物包括聚乳酸乙醇酸 (PLGA)。
醫(yī)學(xué)團(tuán)體的目標(biāo)是將核酸投送到動(dòng)物中的細(xì)胞，用于治療各種疾病包括糖尿病。 在許多方法中，可以通過加入轉(zhuǎn)染試劑將核酸相對(duì)高效地投送到培養(yǎng)物中的細(xì)胞(體外)。 此外，在體內(nèi)，內(nèi)源性核酸酶的存在導(dǎo)致當(dāng)核酸被投送到動(dòng)物時(shí)核酸被高速降解。
除了保護(hù)核酸免于核酸酶消化之外，核酸投送載體必須表現(xiàn)出低毒性、必須被細(xì) 胞有效攝取，并具有明確的、容易制造的制劑。正如在臨床試驗(yàn)中顯示的，用于投送的病毒載體可以在體內(nèi)導(dǎo)致嚴(yán)重不利的、甚至是致命的免疫應(yīng)答。此外，這種方法具有在體內(nèi)具有 誘變效應(yīng)的可能性。通過將核酸復(fù)合在不同制劑的脂類復(fù)合物(例如脂質(zhì)體或陽離子脂類 復(fù)合物)中投送，可能具有毒性效應(yīng)。核酸與各種聚合物或與肽的復(fù)合顯示出不一致的結(jié) 果，并且這些制劑的毒性還沒有被解決。核酸也已被囊封在聚合物基質(zhì)中用于投送，但在這 些情況下粒子具有廣泛的尺寸范圍，并且用于治療性應(yīng)用的有效性還沒有被證實(shí)。這些以 前的方法可能產(chǎn)生與本文所需的目標(biāo)相反的效應(yīng)，包括刺激免疫系統(tǒng)。例如，當(dāng)PLGA被摻 入到粒子中時(shí)，免疫系統(tǒng)受到PLGA存在的刺激。
因此，對(duì)于解決核酸投送中的問題存在著需求，并且對(duì)于開發(fā)微球和用于制造 微球的新方法存在著持續(xù)的需求。關(guān)于微球的詳細(xì)情況、特別是關(guān)于它們的制備和性 質(zhì)的詳細(xì)情況，可以在Scott等的美國(guó)專利No. 6，458，387、Woiszwi 1 Io等的美國(guó)專利 No. 6，268，053、No. 6，090，925、No. 5，981，719 和 No. 5，599，719 以及 Woiszwillo 的美國(guó)專 利No. 5，578，709和Brown等的美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)No. 2006/0024240中發(fā)現(xiàn)。這些以及 本文中指明的所有參考文獻(xiàn)在此引為參考。
發(fā)明概述
根據(jù)本公開，寡核苷酸作為微球投送。據(jù)信這樣的投送方法阻止核酸酶接近微球 中的核酸。進(jìn)行反義(AS)寡核苷酸的微球投送是為了誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞耐受性，特別是在 NOD小鼠模型中誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞耐受性。使用能使反義(AS)寡核苷酸摻入的水性條件來制 造微球。這些微球被用于在NOD小鼠體內(nèi)抑制基因表達(dá)和預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)自身免疫性糖尿 病病癥。
在本公開的一個(gè)方面，合成了靶向⑶40、⑶80和⑶86轉(zhuǎn)錄本的三種AS-寡核苷 酸，制備了寡核苷酸混合物的水性溶液并將其與水性聚合物溶液合并。形成了含有寡核苷 酸的微球，并通過注射將它們投送到NOD小鼠。
在本公開的一個(gè)方面，提供了用于在哺乳動(dòng)物中逆轉(zhuǎn)1型糖尿病的方法，所述方 法包括給藥微球組合物，其中組合物中的微球包含與選自CD40、CD80和CD86原始轉(zhuǎn)錄本 及其組合的原始轉(zhuǎn)錄本反義并靶向結(jié)合的寡核苷酸。寡核苷酸可以選自SEQ ID NO=USEQ ID NO 2或SEQID NO 3及其組合，或事實(shí)上是靶向⑶40、⑶80和⑶86的任何其他寡核苷酸。
另一方面，提供了在哺乳動(dòng)物中治療或逆轉(zhuǎn)1型糖尿病的方法，所述方法包括以 有效治療或逆轉(zhuǎn)1型糖尿病的量給藥含微球的組合物，所述微球包含與選自CD40、CD80和 CD86原始轉(zhuǎn)錄本的原始轉(zhuǎn)錄本反義并靶向結(jié)合的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自包含選自 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 以及靶向并結(jié)合 CD40、CD80 和 CD86 原始轉(zhuǎn)錄本的 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 的修飾形式 的多核苷酸序列。
本公開的另一方面涉及保護(hù)哺乳動(dòng)物的胰腺β細(xì)胞免于自身免疫破壞的方法， 所述方法包括將微球組合物注射到哺乳動(dòng)物中，其中組合物中的微球包含與選自⑶40、 CD80和CD86原始轉(zhuǎn)錄本及其組合的原始轉(zhuǎn)錄本反義并靶向結(jié)合的寡核苷酸。
本發(fā)明的另一方面是用于保護(hù)哺乳動(dòng)物的胰腺β細(xì)胞免于自身免疫破壞的方 法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物給藥有效保護(hù)胰腺β細(xì)胞的量的含微球組合物，所述微 球包含與選自CD40、CD80和CD86原始轉(zhuǎn)錄本及其組合的原始轉(zhuǎn)錄本反義并靶向結(jié)合的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自包含選自SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6和SEQID NO 7以及靶向并結(jié)合CD40、CD80和CD86原始轉(zhuǎn)錄本的SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7的修飾形式的多核苷酸序列。
另一方面是在哺乳動(dòng)物中減少胰腺的T-細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥和/或胰腺β細(xì)胞死亡 的方法，所述方法包括向哺乳動(dòng)物給藥微球組合物，其中組合物中的微球包含與選自CD40、 CD80和CD86原始轉(zhuǎn)錄本及其組合的原始轉(zhuǎn)錄本反義并靶向結(jié)合的寡核苷酸，其中組合物 的給藥量在哺乳動(dòng)物中有效緩解1型糖尿病的癥狀。在更明確情況下，組合物在1型糖尿 病臨床發(fā)作后給藥。在可替選情況下，組合物在1型糖尿病臨床發(fā)作前給藥。在這些治療 性情況下，組合物的給藥使哺乳動(dòng)物中的血糖水平與給藥前哺乳動(dòng)物的血糖水平相比恢復(fù) 正常。
另一方面是在哺乳動(dòng)物中減少T-細(xì)胞介導(dǎo)的胰腺炎癥和/或胰腺β細(xì)胞死亡 的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物給藥有效減少T-細(xì)胞介導(dǎo)的胰腺炎癥或胰腺β細(xì) 胞死亡的量的含微球組合物，所述組合物中的所述微球包含與選自CD40、CD80和CD86原 始轉(zhuǎn)錄本及其組合的原始轉(zhuǎn)錄本反義并靶向結(jié)合的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自包含選自 SEQID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 以及靴向并結(jié)合 CD40、CD80 和 CD86 原始轉(zhuǎn)錄本的 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 的修飾形式 的多核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了在患有新發(fā)作或臨床前自身免疫性糖尿病的哺乳動(dòng) 物中保護(hù)殘留β細(xì)胞量的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物給藥能夠有效保護(hù)殘留β 細(xì)胞量的量的含微球組合物，其中組合物的給藥將哺乳動(dòng)物的β細(xì)胞量維持在糖尿病發(fā) 作前存在的量的至少約15%，所述組合物中的所述微球包含與選自CD40、CD80和CD86原 始轉(zhuǎn)錄本及其組合的原始轉(zhuǎn)錄本反義并靶向結(jié)合的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自包含選自 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQID NO 7 以及靶向并結(jié)合 CD40、CD80 和 CD86 原始轉(zhuǎn)錄本的 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 的修飾形式 的多核苷酸序列。
組合物的給藥可以使哺乳動(dòng)物的β細(xì)胞群體再生或停止β細(xì)胞群體的進(jìn)一步惡 化，或同時(shí)二者。
組合物可以任何形式給藥，在某些示例性方面作為可注射形式給藥。在特定方面， 組合物與胰島素組合給藥。當(dāng)使用組合療法時(shí)，胰島素可以在微球組合物給藥之前、同時(shí)或 之后給藥。
在各種不同實(shí)施方案中，組合物中的微球包含反義寡核苷酸，其各自包含多核苷 酸序列 SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 和 SEQ ID NO :7。在其他實(shí)施方案中，組 合物中的微球包含反義寡核苷酸，其各自由多核苷酸序列SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7構(gòu)成。在其他實(shí)施方案中，組合物中的微球包含與SEQID NO :4、 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO 6 禾口 SEQ ID NO :7 具有至少 80%、85%、90%、95%或更高的多核 苷酸序列同源性、并靶向和結(jié)合CD40、CD80和CD86原始轉(zhuǎn)錄本的反義寡核苷酸。
其他方面涉及在患有新發(fā)作或臨床前自身免疫性糖尿病的對(duì)象中保護(hù)殘留β細(xì) 胞量的方法，所述方法包括向?qū)ο蠼o藥含微球組合物，所述微球包含與⑶40、⑶80和⑶86 原始轉(zhuǎn)錄本反義并靶向結(jié)合的寡核苷酸，其中組合物的給藥將哺乳動(dòng)物的β細(xì)胞量維持在糖尿病發(fā)作前存在的量的至少約15%。對(duì)象可以是人類對(duì)象。對(duì)象可以是人類兒童。治 療方法可以包括組合物的重復(fù)給藥，并且重復(fù)給藥增加了哺乳動(dòng)物的β細(xì)胞量。
在具體的確定方法中，30%并且多至70% w/w的微球是寡核苷酸。這樣的組合物 典型地可以在微球組合物中包含1 1 1比例的反義⑶40 反義⑶80 反義⑶86。
在其他實(shí)施方案中，提供了包含微球的藥物組合物，所述微球包含反義寡核苷酸， 其各自具有SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO 6禾口 SEQ ID NO :7中提出的多核苷酸 序列，與 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 具有至少 75% 的多核 苷酸序列同源性、并靶向和結(jié)合CD40、CD80和CD86原始轉(zhuǎn)錄本的多核苷酸序列，或靶向并 結(jié)合 CD40、CD80 和 CD86 原始轉(zhuǎn)錄本的 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO :7的修飾形式。在這些實(shí)施方案的某些方面，微球包含各自與SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7具有至少80%、85%、90%、95%或更高的多核苷酸序 列同源性、并靶向和結(jié)合CD40、CD80和CD86原始轉(zhuǎn)錄本的反義寡核苷酸。
本公開的這些以及其他方面、目的、特征和優(yōu)點(diǎn)、包括各種不同組合，通過考察下 面的詳細(xì)描述將變得明顯并被清楚地理解。


在本說明的過程中，將參考隨附的圖，其中
圖Ia和Ib是AS-寡核苷酸和聚L-賴氨酸聚陽離子的微球的掃描電子顯微照片。
圖2a和2b是顯示了本公開的微球制備物的性質(zhì)的圖。圖2a是顯示了微球制備 物的粒徑分布的圖。圖2b顯示了微球制備物的表面電荷的圖。
圖3是微球的解聚(deformulation)后寡核苷酸的RP-HPLC層析圖。
圖4是圖，顯示了在用本公開的反義寡核苷酸微球(AS-MSP)多次治療的NOD小鼠 中與用亂序的(scrambled)寡核苷酸微球或單獨(dú)用PBS介質(zhì)治療的動(dòng)物相比對(duì)糖尿病的預(yù) 防。
圖5是圖，顯示了在用本公開的AS-MSP治療一次的NOD小鼠中與用亂序的寡核苷 酸微球或單獨(dú)用PBS介質(zhì)治療的動(dòng)物相比對(duì)糖尿病的預(yù)防。
圖6a_6d是來自對(duì)照NOD小鼠的用蘇木精和曙紅染色(圖6和c ；H+E)染色或針 對(duì)胰島素染色(圖6b和6d)的胰腺組織切片的光學(xué)顯微照片。
圖7a_7d是來自AS-MSP處理的NOD小鼠的用蘇木精和曙紅染色(圖7a和c ；H+E) 染色或針對(duì)胰島素染色(圖7b和7d)的胰腺組織切片的光學(xué)顯微照片。
圖8顯示了從用本公開的AS-MSP處理的小鼠或?qū)φ談?dòng)物獲得的T細(xì)胞的FACS分 析。
圖9顯示了相對(duì)熒光強(qiáng)度(RFI)的圖，證實(shí)了本公開的來自用AS-MSP治療的動(dòng)物 并與脾細(xì)胞培養(yǎng)的T細(xì)胞的增殖。
圖10顯示了 RFI的圖，證實(shí)了在體外在同系的輻射過的脾細(xì)胞和卵清蛋白存在 下，來自AS-MSP治療過的無糖尿病NOD小鼠的T-細(xì)胞的增殖。
圖11顯示了 RFI的圖，證實(shí)了在體外在同系的胰島裂解物存在下，來自AS-MSP治 療過的無糖尿病NOD小鼠的T-細(xì)胞增殖的抑制。
圖12是來自用含反義或亂序寡核苷酸的微球治療過的新發(fā)作糖尿病小鼠的血糖水平的圖。
圖13A顯示了使用具有新發(fā)作糖尿病的小鼠進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的時(shí)間線，圖13B和13C 是來自用AS-MSP或?qū)φ罩委熯^的新發(fā)作糖尿病小鼠的平均血糖水平的圖。
圖14A-C顯示了 NOD小鼠中1型糖尿病表型的逆轉(zhuǎn)。這些圖顯示了在AS-MSP給 藥后，哺乳動(dòng)物的血糖水平在15天內(nèi)返回到正常(正常水平用虛線顯示，約為200mg/dL)， 并甚至在AS-MSP給藥停止后(第30天)也保持在正常。
圖15 顯示了自身免疫性糖尿病的治療性逆轉(zhuǎn)的模型。
圖16顯示了人類樹突狀細(xì)胞(DC)對(duì)寡脫氧核苷酸(ODN)的攝取。圖16A顯示了 被hDC攝取FITC標(biāo)記的CD86 AS-寡核苷酸；圖16B顯示了 AS-ODN治療的hDC對(duì)DQ-卵清 蛋白的攝取/加工；圖16C通過LPS處理后DC實(shí)施方案的FACS顯示了表型。
圖17顯示了來自最近給藥破傷風(fēng)加強(qiáng)疫苗的健康人類志愿者的T-細(xì)胞，在破傷 風(fēng)類毒素的存在下與自體AS-ODN處理過的源自外周血的DC共培養(yǎng)時(shí)的增殖。誤差線表示 來自同樣個(gè)體細(xì)胞的三次獨(dú)立共培養(yǎng)物的反應(yīng)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖18顯示了來自健康人類志愿者的T-細(xì)胞，在存在或不存在完整卵清蛋白作為 標(biāo)稱抗原的情況下與自體AS-ODN處理過的源自外周血的DC共培養(yǎng)時(shí)的增殖。誤差線表示 來自三個(gè)獨(dú)立志愿者的反應(yīng)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖19顯示了來自健康人類志愿者的T-細(xì)胞與同種異體AS-ODN處理過的源自外 周血的DC或未處理的同種異體DC共培養(yǎng)時(shí)的增殖。誤差線表示來自三個(gè)獨(dú)立志愿者的反 應(yīng)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，其中DC供體保持相同。
圖20顯示了源自人類單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞與ASO-MS溫育后的蛋白表達(dá)。
圖21顯示了與人類ASO-MS培養(yǎng)后蛋白表達(dá)的降低百分率。
說明性實(shí)施方案的描述
根據(jù)需要，在本文中公開了本公開的詳細(xì)實(shí)施方案；但是，應(yīng)該理解，所公開的實(shí) 施方案僅僅是本公開內(nèi)容的示例，本公開內(nèi)容可以以各種不同形式體現(xiàn)。因此，本文公開的 具體詳細(xì)描述不應(yīng)被解釋為限制性的，而是僅僅作為權(quán)利要求
的基礎(chǔ)，以及作為教導(dǎo)本領(lǐng) 域技術(shù)人員以事實(shí)上任何適合方式多種多樣地使用本公開內(nèi)容的代表性基礎(chǔ)。
I型糖尿病是自身免疫病癥，其中胰腺、特別是產(chǎn)胰島素的內(nèi)分泌β細(xì)胞存在漸 進(jìn)性炎癥。在發(fā)作前，炎癥首先造成內(nèi)分泌β細(xì)胞功能障礙。在人類自身免疫性(1型) 糖尿病的非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型中單次注射微球制劑，顯著延遲了疾病發(fā)作。盡 管不希望束縛于任何具體理論，但據(jù)信在疾病發(fā)作前，微球通過注射位點(diǎn)處的駐留性和遷 移性樹突狀細(xì)胞攝取，然后移動(dòng)到最近的淋巴結(jié)中。也相信，在治療過的受體中發(fā)生了在體 外靶向推測(cè)的β細(xì)胞抗原的T-細(xì)胞增殖的降低。在用同系T-細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞重建然 后給藥微球的免疫缺陷NOD-scid小鼠中，可能發(fā)生CD4+CD25+推測(cè)的調(diào)控性T細(xì)胞流行性 的增加。因此，基于微球的治療組合物可以調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞活性并動(dòng)員調(diào)控網(wǎng)絡(luò)用于預(yù)防。
將阻止糖尿病發(fā)作的治療方法是理想的。在臨床發(fā)作后當(dāng)顯著數(shù)量的β細(xì)胞已 被破壞時(shí)將阻止或逆轉(zhuǎn)疾病的治療組合物也將是理想的。在新發(fā)作糖尿病小鼠中重復(fù)給藥 使高血糖恢復(fù)正常并逆轉(zhuǎn)了疾病。逆轉(zhuǎn)典型是指使個(gè)體例如人類或其他哺乳動(dòng)物表現(xiàn)出接 近正?；难撬健２幌Ｍ`于任何特定理論，據(jù)信在“逆轉(zhuǎn)”期間，抵御了誘導(dǎo)疾病 的T-細(xì)胞炎癥和細(xì)胞死亡。[0054]一個(gè)實(shí)施方案通過配制和注射本文中描述的靶向⑶40、⑶80和⑶86轉(zhuǎn)錄本的反 義(AS)-寡核苷酸微球，逆轉(zhuǎn)了自身免疫性胰島素依賴型糖尿病。針對(duì)轉(zhuǎn)錄本的反義寡核 苷酸的具體實(shí)例公開在本文的實(shí)施例中。應(yīng)該理解，可以設(shè)計(jì)有效結(jié)合CD40、CD80和CD86 轉(zhuǎn)錄本以獲得本文所述效應(yīng)的其他反義寡核苷酸。還應(yīng)該理解，這樣的寡核苷酸可以包含 本技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的修飾，包括但不限于巰基化(thioation)、甲基化和甲氧基乙基化，并 且這種修飾的位置和數(shù)量可以變化，以獲得最適效果。這些寡核苷酸被設(shè)計(jì)用于誘導(dǎo)免疫 耐受，導(dǎo)致在NOD小鼠模型中逆轉(zhuǎn)產(chǎn)胰島素β細(xì)胞的破壞。
也考慮到了寡核苷酸的修飾形式，包括具有至少一個(gè)修飾的核苷酸間鍵合的寡核 苷酸。寡核苷酸的“修飾形式”包括但不限于修飾的核苷間鍵合和/或修飾的堿基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸全部或部分是肽核酸。其他修飾的核苷間鍵合包括 至少一個(gè)硫代磷酸酯鍵合。其他修飾的寡核苷酸包括含有一個(gè)或多個(gè)通用堿基的寡核苷 酸。“通用堿基”是指能夠通過形成氫鍵代替用于與核酸中任一個(gè)Α、C、G、T和U結(jié)合并且 不使結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著去穩(wěn)定化的分子。
寡核苷酸的具體實(shí)例包括含有修飾骨架或非天然核苷間鍵合的寡核苷酸。具有修 飾骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子和在骨架中不具有磷原子的寡核苷酸。在其核 苷間骨架中不具有磷原子的修飾的寡核苷酸被認(rèn)為包含在“寡核苷酸”的含義之內(nèi)。
含有磷原子的修飾的寡核苷酸骨架包括例如具有正常的3' -5'鍵合的硫代磷 酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸 酯包括3'-亞烷基膦酸酯、5' _亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯包 括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰 烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，它們的2' -5'連接類似物，以及具有顛倒的極 性、其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸間鍵合是3'到3'、5'到5'或2'到2'鍵合的類似物。還 考慮到了具有顛倒的極性、在最3'核苷酸間鍵合處包含單個(gè)3'到3'鍵合、即可能是無 堿基的(核苷酸失去堿基或用羥基代替它)單個(gè)顛倒的核苷殘基的寡核苷酸。也考慮到 了鹽、混合的鹽和游離酸形式。教導(dǎo)了上述含磷鍵合的制備的代表性美國(guó)專利包括美國(guó)專 利 No. 3，687，808,4, 469，863,4, 476，301,5, 023，243,5, 177，196,5, 188，897,5, 264，423、
5，276，019、5，278，302、5，286，717、5，321，131、5，399，676、5，405，939、5，453，496、5，455，233、5，466，677、5，476，925、5，519，126、5，536，821、5，541，306、5，550，111、5，563，253、5，571，799、5，587，361、5，194，599、5，565，555、5，527，899、5，721，218、
5，672，697和5，625，050，其公開內(nèi)容在此引為參考。
其中不包含磷原子的修飾寡核苷酸骨架，具有由低級(jí)烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合、 混合的雜原子和烷基或雜烷基核苷間鍵合或一個(gè)或多個(gè)低級(jí)雜原子或雜環(huán)核苷間鍵合形 成的骨架。這些包括具有嗎啉代鍵合；硅氧烷鍵合、硫化物、亞砜和砜骨架；甲酰乙?；?(formacetyl)和硫代甲酰乙?；羌?；亞甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙?；羌?；核糖乙 ?；羌埽缓溝┕羌?；氨基磺酸酯骨架，亞甲基亞胺基和亞甲基胼基骨架；磺酸酯和磺酰 胺骨架；酰胺骨架；以及其他具有混合的N、0、S和CH2組成部分的骨架。參見例如美國(guó)專 利 No. 5，034，506,5, 166，315,5, 185，444,5, 214，134,5, 216，141,5, 235，033,5, 264，562、 5，264，564,5，405，938,5，434，257,5，466，677,5，470，967,5，489，677,5，541，307, 5，561，225,5，596，086,5，602，240,5，610，289,5，602，240,5，608，046,5，610，289,5，618，704,5, 623，070,5, 663，312,5, 633，360,5, 677，437,5, 792，608,5, 646，269 和 5，677，439，其公開內(nèi)容在此以其全文引為參考。
在其他實(shí)施方案中，提供了寡核苷酸模擬物，其中核苷酸單元的一個(gè)或多個(gè)糖和 /或一個(gè)或多個(gè)核苷酸間鍵合被“非天然存在”的基團(tuán)取代。維持了寡核苷酸的堿基用于 與靶多核苷酸雜交。在一個(gè)方面，本實(shí)施方案考慮到了肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡 核苷酸的糖骨架被含有酰胺的骨架代替。參見例如美國(guó)專利No. 5，539，082,5, 714，331和 5，719，262 以及 Nielsen 等，Science, 1991,254,1497-1500，其公開內(nèi)容在此引為參考。
在其他實(shí)施方案中，提供了具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸，和具有雜原子骨架 并包括在美國(guó)專利Nos. 5，489，677和 5，602, 240 中描述的-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3) -O-C H2-、-CH2-O-N(CH3) -CH2-、-CH2-N(CH3) -N(CH3) -CH2-^P -O-N(CH3) -CH2-CH2-的寡核苷。還考慮 到了具有美國(guó)專利5，034，506中描述的具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。
在各種不同形式中，在寡聚物中兩個(gè)連續(xù)單體之間的鍵合由2到4個(gè)、理想為3個(gè) 選自-CH2-、-0-、-S-、-NRh-、> C = 0、> C = NRH、> C = S、_Si(R〃)2-、_S0-、-S(0)2-、_P( 0) 2_、-PO (BH3) -、-P (0，S) -、-P (S) 2_、-PO (R" ) -、-PO (OCH3)-和-PO (NHRh)-的基團(tuán) / 原子 構(gòu)成，其中RH選自氫和CV4-烷基，R"選自Cu-烷基和苯基。這種鍵合的說明性實(shí)例是-C H2-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CHOH-CH2-、-O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH =(當(dāng)用作 與隨后單體的鍵合時(shí)包括 R5)、-CH2-CH2-O-、-NRh-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NRh-、-CH2-NRh-CH2-、-0 -CH2-CH2-NRh-, -NRh-CO-O-, -NRh-CO-NRh, -NRh-CS-NRh-, -NRh-C ( = NRh) -NRh、-NRh-CO-CH2-NR
h-o-co-o-、-o-co-ch2-o-、-o-ch2-co-o-、-ch2-co-nrh-、-o-co-nrh-、-nrh-co-ch2-、-o-ch2-co-
NRh-, -O-CH2-CH2-NRh-、-CH = N-O-, -CH2-NRh-O-, -CH2-O-N =(當(dāng)用作與隨后單體的鍵合 時(shí)包括 R5)、-CH2-O-NRh-, -CO-NRh-CH2-, -CH2-NRh-O-, -CH2-NRh-CO-, -O-NRh-CH2-, -O-NRh, -0 -CH2-S-, -S-CH2-O-, -CH2-CH2-S-, -O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH =(當(dāng)用作與隨后單體的鍵合 時(shí)包括 R5)、-S-CH2-CH2-, -S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S-CH2-, -CH2-SO-CH2-, -CH2-S 02-CH2-、-0-S0-0-、-O-S (0) 2-0-、-0-S (0) 2-CH2-、-0-S (0) 2-NRh-、-NRh-S (0) 2-CH2-、-0_S (0) 2-CH2-、-O-P (0) 2-0", -O-P (0，S) -o-、-O-P (S) 2-0", -S-P (0) 2-0", -S-P (0，S) -o-、-S-P (S) 2-o-、-O-P (O) 2-s-、-O-P (0，S) -s-、-O-P (S) 2-s-、-S-P (O) 2-s-、-S-P (0，S) -s-、-S-P (S) 2-s-、"ΟΡΟ (R" ) -ο-,-0-P0(OCH3) -ο-,-0-P0(OCH2CH3) -0-,-O-PO (OCH2CH2S-R) -0-,-O-PO(BH3) -0-、_0-PO (NHRn) -0-、-O-P (0) 2-NRHh-、-NRh-P (0) 2_0_、-O-P (0，NRh) -0-、-CH2-P (0) 2_0_、-O-P (0) 2_C H2-以及-O-Si (R〃)2-0-，在其中考慮到了 -CH2-CO-NRh-、-CH2-NRh-O-、-S-CH2-O-、-O-P (O)2 -O-O-P (-0，S) -ο-、-O-P (S) 2-0-、-NRh-P (0) 2_0_、-O-P (0，NRh) -0-、-O-PO (R “ ) -0-、-0-P0 (C H3)-0-以及-0-P0 (NHRn)-O-,其中RH選自氫和C^4-烷基，R"選自CV6-烷基和苯基。其他 說明性實(shí)例在 Mesmaeker 等，Current Opinion in Structural Biology 1995，5，343—355 以及 Susan Μ. Freier 禾口 Karl-HeinzAltmann, Nucleic Acids Research, 1997, vol 25, pp 4429-4443 中給出。
寡核苷酸的其他修飾形式詳細(xì)描述在美國(guó)專利申請(qǐng)No. 20040219565中，其公開 內(nèi)容在此以其全文引為參考。
修飾的寡核苷酸也可以包含一個(gè)或多個(gè)取代的糖組成部分。在某些情況下，寡核 苷酸在2'位置處包含下列基團(tuán)之一 0H ；F ；0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-烯基；0_、S_或 N-炔基；或0-烷基-0-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1到Cltl烷基或 C2 到 Cltl 烯基和炔基。其他實(shí)施方案包括 0[ (CH2) n0]mCH3、O(CH2) n0CH3、O(CH2) nNH2、O(CH2) nCH3、0 (CH2) n0NH2 和 0 (CH2) n0N[ (CH2) nCH3] 2，其中 η 和 m 為 1 到約 10。其他寡核苷酸在 2 ‘ 位置處包含下列基團(tuán)之一 =C1到Cltl低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷 基、0-烷芳基或 0-芳烷基、SH、SCH3、0CN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3> SOCH3> SO2CH3、ONO2, NO2, N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂開基團(tuán)、 報(bào)告基團(tuán)、嵌入劑、用于改進(jìn)寡核苷酸的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)、或用于改進(jìn)寡核苷酸的藥 效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)，以及具有類似性質(zhì)的其他取代基。在個(gè)方面修飾包括2'-甲氧基乙氧 基(2' -O-CH2CH2OCH3,也被稱為 2' _0-(2_ 甲氧基乙基)或 2' -Μ0Ε) (Martin 等，Helv. Chim. Acta，1995，78，486-504)，即烷氧基烷氧基。其他修飾包括在下文的實(shí)施例中描述的 2'其他修飾包括2‘-甲氧基(2’ -O-CH3)、2'-氨基丙氧基(2’ -OCH2CH2CH2NH2)、 2 ‘ _ 烯丙基(2 ‘ -CH2-CH = CH2)、2' -0-烯丙基(2 ‘ -O-CH2-CH = CH2)和 2 ‘-氟 (2' -F)。2' _修飾可以在阿拉伯糖(上)位或核糖(下)位。在一個(gè)方面，2'-阿拉 伯糖位修飾是2' -F。類似的修飾也可以在寡核苷酸的其他位置上做出，例如在3'末端 核苷酸上或2' -5'連接的寡核苷酸中的糖的3'位置，和5'末端核苷酸的5'位置。 寡核苷酸也可以具有糖模擬物，例如環(huán)丁基部分代替呋喃戊糖基的糖。參見例如美國(guó)專 利 No. 4，981，957,5, 118，800,5, 319，080,5, 359，044,5, 393，878,5, 446，137,5, 466，786、 5，514，785、5，519，134、5，567，811、5，576，427、5，591，722、5，597，909、5，610，300、 5，627，053,5, 639，873,5, 646，265,5, 658，873,5, 670，633,5, 792，747 和 5，700，920，其公 開內(nèi)容在此以其全文引為參考。
在一個(gè)方面，糖的修飾包括鎖核酸(LNA)，其中2'-羥基連接到糖環(huán)的3'或4' 碳原子，從而形成了雙環(huán)糖部分。在某些方面，鍵合是橋接2'氧原子與4'碳原子的亞甲 基(_CH2_)n基團(tuán)，其中η是1或2。LNA及其制備描述在WO 98/39352和WO 99/14226中。
寡核苷酸也可以包括堿基修飾或取代。在本文中使用時(shí)，“未修飾的”或“天然” 堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶 (U)0修飾堿基包括其他合成和天然堿基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、 黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和 鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、 5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶堿基的其他烷炔基衍生物、6-偶 氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫代尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、 8_巰基、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代特別是5-溴、5-三 氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、 2-氨基-腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤和7-脫氮雜腺嘌呤和 3_脫氮雜鳥嘌呤和3-脫氮雜腺嘌呤。其他修飾堿基包括三環(huán)嘧啶例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧 啶并[5，4-b][l，4]苯并噁嗪_2 (3H)_酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4_b][l，4]苯并噻 嗪-2 (3H)-酮)、G-夾例如取代的吩噁嗪胞苷(例如9- (2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4_b] [1,4]苯并噁嗪-2(3H)_酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4，5-b]叼丨哚_2_酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3' ,2' :4，5]吡咯[2，3-d]嘧啶-2-酮)。修飾堿基也可以包括其中嘌呤 或嘧啶堿基被其他雜環(huán)取代的堿基，例如7-脫氮雜-腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、2-氨基吡 啶和2-吡啶酮。其他堿基包括在美國(guó)專利No. 3，687，808中公開的堿基，在Kroschwitz， J. I主編的《聚合物科學(xué)和工程簡(jiǎn)明百科全書》858-859頁(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages858_859, John Wiley & Sons, 1990)中公開的 堿基，由Englisch等在Angewandte Chemie國(guó)際版，1991，30，613中公開的堿基，以及由 Sanghvi, Y. S.在《反義石if究與應(yīng)用》(第 15 章，Antisense Research and Applications, 289-302 頁，Crooke，S. Τ.和 Lebleu，B.主編，CRC Press, 1993)中公開的堿基。某些這些 堿基可用于增加結(jié)合親和性，并包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的 嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代 已被顯示將核酸雙鏈體的穩(wěn)定性增加了 0. 6-1. 2°C，并在某些方面與2' -0-甲氧基乙基糖 修飾組合。參見美國(guó)專利 No. 3，687，808、美國(guó)專利 No. 4，845，205,5, 130，302,5, 134，066、 5，175，273,5, 367，066,5, 432，272,5, 457，187,5, 459，255,5, 484，908,5, 502，177、 5，525，711,5，552，540,5，587，469,5，594，121，5，596，091,5，614，617,5，645，985, 5，830，653,5, 763，588,6, 005，096,5, 750，692 and 5，681，941，其公開內(nèi)容在此引為參考。
“修飾堿基”或其他類似術(shù)語是指能夠與天然堿基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、 尿嘧啶和/或胸腺嘧啶)配對(duì)和/或與非天然存在的堿基配對(duì)的成分。在某些方面，修飾 堿基提供了 15、12、10、8、6、4或2°C或更低的1差異。示例性的修飾堿基描述在EP 1 072 679 和 W097/12896 中。
“核堿基”是指天然存在的核堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶 (T)和尿嘧啶(U)，以及非天然存在的核堿基例如黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧-N6-甲基腺嘌 呤、7-脫氮雜黃嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N4, N4-橋亞乙基胞嘧啶、N' , N'-橋亞乙基-2， 6_二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mC)、5-(C3-C6)-烷炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、 假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷，以及在Bermer 等的美國(guó)專利 No. 5，432，272 和 Susan M. Freier 與 Karl-Heinz Altmann, Nucleic Acids Research, 1997, vol. 25，pp4429_4443中描述的“非天然存在的”核堿基。因此，術(shù)語“核堿 基”不僅包括已知的嘌呤和嘧啶雜環(huán)化合物，而且包括雜環(huán)類似物及其互變異構(gòu)體。其他天 然和非天然存在的核堿基包括在美國(guó)專利No. 3，687，808 (Merigan等)、Sanghvi的《反義 石if究與應(yīng)用》第 15 章(Antisense Research and Applications, S. Τ· Crooke 禾口 B. Lebleu 主編，CRC Press，1993)、Englisch 等，Angewandte Chemie 國(guó)際版，1991，30，613-722 (參見 特別是622和623頁)，以及在《聚合物科學(xué)和工程簡(jiǎn)明百科全書》(Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz 主編，John Wiley & Sons, 1990, 858-859 頁)、Cook, Anti-Cancer Drug Design 1991，6，585-607 中公開的核堿基，每個(gè)上 述文獻(xiàn)在此以其全文引為參考。術(shù)語“核苷堿基”或“堿基單元”還打算包括能夠起到類似 核堿基作用的化合物例如雜環(huán)化合物，包括在最經(jīng)典的意義上不是核苷堿基但起到核苷堿 基作用的某些“通用堿基”。作為通用堿基可以特別提到的是3-硝基吡咯、任選取代的吲哚 (例如5-硝基吲哚)和任選取代的次黃嘌呤。其他理想的通用堿基包括吡咯、二唑和三唑 衍生物，包括本技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的通用堿基。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸在一個(gè)堿基位置上被修飾。在其他方面，寡核苷酸在2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)或更多堿基位置處被修飾。本發(fā)明考慮了任何修飾，只要 得到的寡核苷酸保持與其靶轉(zhuǎn)錄本結(jié)合的能力即可。
本發(fā)明考慮到的其他序列包括但不限于表1中提出的序列。
表1
權(quán)利要求
1.一種用于在哺乳動(dòng)物中治療或逆轉(zhuǎn)1型糖尿病的方法，所述方法包括以有效治療或 逆轉(zhuǎn)1型糖尿病的量給藥含微球的組合物，所述微球包含與選自CD40、CD80和CD86原始轉(zhuǎn) 錄本的原始轉(zhuǎn)錄本反義并靶向結(jié)合的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自包含選自SEQ ID NO :4、 SEQ IDN0:5、SEQ ID NO 6禾Π SEQ ID NO :7以及靴向并結(jié)合CD40、CD80和CD86原始轉(zhuǎn)錄本 的SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6和SEQID NO 7的修飾形式的多核苷酸序列。
2.一種用于保護(hù)哺乳動(dòng)物的胰腺β細(xì)胞免于自身免疫破壞的方法，所述方法包括 向所述哺乳動(dòng)物給藥有效保護(hù)胰腺β細(xì)胞的量的含微球的組合物，所述微球包含與選自 CD40、CD80和CD86原始轉(zhuǎn)錄本及其組合的原始轉(zhuǎn)錄本反義并靶向結(jié)合的寡核苷酸，所述寡 核苷酸各自包含選自SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO 6禾口 SEQ ID NO :7以及靶向 并結(jié)合 CD40、CD80 和 CD86 原始轉(zhuǎn)錄本的 SEQ ID NO :4、SEQID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7的修飾形式的多核苷酸序列。
3.一種在哺乳動(dòng)物中減少T-細(xì)胞介導(dǎo)的胰腺炎癥和/或胰腺β細(xì)胞死亡的方法，所 述方法包括向所述哺乳動(dòng)物給藥有效減少T-細(xì)胞介導(dǎo)的胰腺炎癥或胰腺β細(xì)胞死亡的量 的含微球的組合物，所述組合物中的所述微球包含與選自CD40、CD80和CD86原始轉(zhuǎn)錄本及 其組合的原始轉(zhuǎn)錄本反義并靶向結(jié)合的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自包含選自SEQ IDNO 4,SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 以及靶向并結(jié)合 CD40、CD80 和 CD86 原始轉(zhuǎn) 錄本的SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5、SEQID NO :6和SEQ ID NO :7的修飾形式的多核苷酸序 列。
4.一種在患有新發(fā)作或臨床前自身免疫性糖尿病的哺乳動(dòng)物中保護(hù)殘留β細(xì)胞量的 方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物給藥有效保護(hù)殘留β細(xì)胞量的量的含微球的組合物， 其中組合物的給藥將哺乳動(dòng)物的β細(xì)胞量維持在糖尿病發(fā)作前存在的量的至少約15%， 所述組合物中的所述微球包含與選自CD40、CD80和CD86原始轉(zhuǎn)錄本及其組合的原始轉(zhuǎn)錄 本反義并靶向結(jié)合的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自包含選自SEQID N0:4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7以及靴向并結(jié)合CD40、CD80和CD86原始轉(zhuǎn)錄本的SEQ ID NO :4、 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7的修飾形式的多核苷酸序列。
5.權(quán)利要求
1、2、3或4的方法，其中所述組合物中的所述微球包含反義寡核苷酸，所述 反義寡核苷酸各自包含多核苷酸序列SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7。
6.權(quán)利要求
1、2、3或4的方法，其中所述組合物中的所述微球包含反義寡核苷酸，所述 反義寡核苷酸其各自由多核苷酸序列SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO 7組成。
7.權(quán)利要求
1、2、3或4的方法，其中所述組合物中的所述微球包含與SEQID NO :4、 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7具有至少80%的多核苷酸序列同源性、并靶向 和結(jié)合⑶40、⑶80和⑶86原始轉(zhuǎn)錄本的反義寡核苷酸。
8.權(quán)利要求
1、2、3或4的方法，其中所述組合物中的所述微球包含與SEQID NO :4、 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7具有至少85%的多核苷酸序列同源性、并靶向 和結(jié)合⑶40、⑶80和⑶86原始轉(zhuǎn)錄本的反義寡核苷酸。
9.權(quán)利要求
1、2、3或4的方法，其中所述組合物中的所述微球包含與SEQID NO :4、 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7具有至少90%的多核苷酸序列同源性、并靶向和結(jié)合⑶40、⑶80和⑶86原始轉(zhuǎn)錄本的反義寡核苷酸。
10.權(quán)利要求
1、2、3或4的方法，其中所述組合物中的所述微球包含與SEQID NO :4、 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7具有至少95%的多核苷酸序列同源性、并靶向 和結(jié)合⑶40、⑶80和⑶86原始轉(zhuǎn)錄本的反義寡核苷酸。
11.權(quán)利要求
1、2、3或4的方法，其中所述組合物在1型糖尿病臨床發(fā)作后給藥。
12.權(quán)利要求
1、2、3或4的方法，其中所述組合物在1型糖尿病臨床發(fā)作前給藥。
13.權(quán)利要求
1、2、3或4的方法，其中所述組合物的給藥使所述哺乳動(dòng)物中的血糖水平 與給藥前所述哺乳動(dòng)物的血糖水平相比恢復(fù)正常。
14.權(quán)利要求
1、2、3或4的方法，其中所述組合物的給藥使所述哺乳動(dòng)物的β細(xì)胞群 體再生。
15.權(quán)利要求
1、2、3或4的方法，其中所述組合物作為可注射形式給藥。
16.權(quán)利要求
1、2、3或4的方法，其中所述組合物與胰島素組合給藥。
17.權(quán)利要求
16的方法，其中胰島素在所述組合物給藥之前、同時(shí)或之后給藥。
18.權(quán)利要求
1、2、3或4的方法，其中所述方法包含所述組合物的重復(fù)給藥。
19.權(quán)利要求
1、2、3或4的方法，其中至少70%w/w的所述微球是寡核苷酸。
20.權(quán)利要求
19的方法，其中所述組合物中每種反義寡核苷酸的比是1 1 1的 ⑶40反義⑶80反義⑶86反義。
21.一種含微球的藥物組合物，所述微球包含反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸各自具 有SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7中列出的多核苷酸序列，與 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 具有至少 75% 的多核苷酸序列 同源性、并靶向和結(jié)合CD40、CD80和CD86原始轉(zhuǎn)錄本的多核苷酸序列，或靶向并結(jié)合CD40、 CD80 和 CD86 原始轉(zhuǎn)錄本的 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 的 修飾形式。
22.權(quán)利要求
21的含微球的藥物組合物，所述微球包含各自與SEQIDNO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7具有至少80%的多核苷酸序列同源性、并靶向和結(jié)合 ⑶40、⑶80和⑶86原始轉(zhuǎn)錄本的反義寡核苷酸。
23.權(quán)利要求
21的含微球的藥物組合物，所述微球包含各自與SEQIDNO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7具有至少85%的多核苷酸序列同源性、并靶向和結(jié)合 ⑶40、⑶80和⑶86原始轉(zhuǎn)錄本的反義寡核苷酸。
24.權(quán)利要求
21的含微球的藥物組合物，所述微球包含各自與SEQIDNO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7具有至少90%的多核苷酸序列同源性、并靶向和結(jié)合 ⑶40、⑶80和⑶86原始轉(zhuǎn)錄本的反義寡核苷酸。
25.權(quán)利要求
21的含微球的藥物組合物，所述微球包含各自與SEQID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7具有至少95%的多核苷酸序列同源性、并靶向和結(jié)合 ⑶40、⑶80和⑶86原始轉(zhuǎn)錄本的反義寡核苷酸。
專利摘要
本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N方法，所述方法包括使用反義手段在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)和/或延遲自身免疫性糖尿病病癥。將寡核苷酸靶向結(jié)合于原始轉(zhuǎn)錄本CD40、CD80、CD86及其組合。
文檔編號(hào)C12N15/113GKCN102007213SQ200980113547
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2009年4月20日
發(fā)明者尼克·吉安努卡基斯, 拉里·R·布朗, 馬西莫·特魯克 申請(qǐng)人:巴克斯特醫(yī)療保健股份有限公司, 巴克斯特國(guó)際公司, 高等教育聯(lián)邦體系所屬匹茲堡大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan