專利名稱:一種從石蒜屬植物中提取活性生物堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然有機化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種從石蒜屬植物中提取活性生物堿的方法。
背景技術(shù)：
石蒜屬(Lycoris Herb.)植物是石蒜科(Amaryllidaceae)中的一個重要屬，為多 年生草本植物。據(jù)不完全統(tǒng)計，其在全世界約有20多種，主要分布于東亞的暖溫帶 至亞熱帶。石蒜中含有大量生物堿。國外科學(xué)家在20世紀(jì)初就提取分離出大量生物 堿。如Lycorine (石蒜堿)，tazettine (多花水仙堿)，homolycorine (高石蒜堿)，力口可 拉敏(lycoramine)，石蒜倫堿(lycorenine)，偽石蒜堿(pseudlycorine)，去甲普魯維因 (norpluviine),表力口蘭力口敏(epigalanthamine)，維他廷(vittatine)，普魯維因(pluviine)， 小星蒜堿(hippeastrine)等生物堿。
我國科技相對落后，到了 20世紀(jì)50年代才開展石蒜生物堿的研究，也取得了一 定成果。如洪山海、馬廣恩等對我國石蒜也進行了植物化學(xué)及藥理方面的研究，并從中 分離出新的化合物紫花石蒜堿(squamigerine)。
現(xiàn)代藥理研究和臨床表明，石蒜生物堿具有多種生物活性和療效加蘭他敏是 治療老年期癡呆癥、小兒麻痹后遺癥及重癥肌無力的特效藥，對癡呆患者和腦器質(zhì)性病 變引起的記憶障礙亦有改善作用；石蒜堿具有抗阿米巴原蟲、抗癌、降壓、催吐、祛 痰、解痙，比嗎啡強5倍的鎮(zhèn)痛作用、比阿司匹林也有更強的鎮(zhèn)痛作用。其衍生物石 蒜堿內(nèi)銨鹽用于治療消化道癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、頭頸部癌、惡性淋巴瘤等，其中 對胃癌、卵巢癌療效較好；力可拉敏用于脊髓灰質(zhì)炎后遺癥性癱瘓，腦血管意外所致的 偏癱，坐骨神經(jīng)炎；多花水仙堿具有擬膽堿樣作用，對吉田肉瘤的生長具有很好抑制作 用。
目前，現(xiàn)有技術(shù)中以石蒜為原料，經(jīng)過煩瑣的提取分離純化步驟，只生產(chǎn)一種 石蒜生物堿單體產(chǎn)品而廢棄富含其它寶貴活性成分的生物堿，沒有充分利用石蒜資源， 并且生產(chǎn)周期長、產(chǎn)率收率不高、產(chǎn)品遠(yuǎn)沒有達(dá)到藥用級的高純度要求。中國專利文獻
“一種石蒜氫溴酸加蘭他敏酸水浸提生物堿提取方法及工藝”(公開號CN1569856，公開 日為2005.01.26)中大量使用酸提取，生產(chǎn)過程中使用大量酸堿，排放大量廢酸廢堿，嚴(yán) 重污染環(huán)境，不利于產(chǎn)業(yè)化；“從石蒜粗提物中分離高純度加蘭他敏的方法”(公開號 CN1490319,
公開日為2004.04.21)中的工藝中大量使用有機溶劑，生產(chǎn)安全系數(shù)低，成 本高，工業(yè)化生產(chǎn)受到限制；中國專利文獻“從石蒜或雪花蓮屬原料中提取加蘭他敏的 方法”(公開號CN1696131，
公開日為2005.11.16)中所用儀器價格昂貴、處理量小、需 要高級技術(shù)人員才能操作，不適宜放大生產(chǎn)，產(chǎn)業(yè)化受到限制；并且大多數(shù)工藝都只得 到單一產(chǎn)品，造成資源浪費。如“從石蒜粗提物中分離高純度加蘭他敏的方法”、“從 石蒜粗提物中分離高純度加蘭他敏的方法”、“一種石蒜氫溴酸加蘭他敏樹脂吸附除雜 方法及工藝”和“從石蒜屬植物中提取力可拉敏的工藝方法”等專利文獻。[0006]總之，現(xiàn)有以石蒜為原料生產(chǎn)生物堿的方法存在以下不足產(chǎn)品單一、步驟煩 瑣、周期長、產(chǎn)品收得率不高、安全系數(shù)低、成本高、石蒜資源利用率不高和環(huán)境污染 嚴(yán)重，以及不易產(chǎn)業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從石蒜屬植物中提取活性生物堿的方法，該方法產(chǎn) 品收得率高，可以同時得到多種產(chǎn)品，并且環(huán)境污染低。
本發(fā)明提供的從石蒜屬植物中提取活性生物堿的方法，其步驟包括
(1)在切碎后的石蒜屬植物中加入體積為2 10倍量的水，再加入復(fù)合纖維素 酶，復(fù)合纖維素酶與石蒜屬植物的質(zhì)量百分比為0.1 0.5%，調(diào)節(jié)pH值至5 8，在溫 度20 60°C下酶解2 24小時，再將酶解后石蒜屬植物細(xì)胞破碎，過濾，得到提取液；
(2)濃縮上述提取液，得到提取物濃縮液，該濃縮液的比重在20°C測量時為 1.05 1.15 ；
(3)按pH值分步對上述提取物濃縮液進行萃?。?br>(4)將萃取各步得到的產(chǎn)物以粗產(chǎn)品比填料為1 60 1 5的量分別進行柱層 析，再進行洗脫；
(5)將柱層析分離得到的相同組分合并，反復(fù)重結(jié)晶，得到多種高純度單體。
本發(fā)明方法對上述技術(shù)方案進行了下述優(yōu)化，
步驟(1)中復(fù)合纖維素酶的組分及質(zhì)量比為纖維素酶40-50 %，果膠酶 30-40%,半纖維素酶20-30%。
步驟(3)按下述過程進行萃取
第一步萃取將提取物濃縮液的pH調(diào)至5 7，加入0.5 3倍體積有機溶劑 進行萃取1 4次，合并有機溶劑相，減壓回收有機溶劑得第一步萃取產(chǎn)物；
第二步萃取將第一步萃取得到的水相調(diào)pH值至7 10，加入0.5 3倍體積 有機溶劑進行萃取1 4次，合并有機溶劑相，減壓回收有機溶劑得第二步萃取產(chǎn)物；
第三步萃取將第二步萃取得到的水相調(diào)pH值至10 11，加入0.5 3倍體積 有機溶劑進行萃取1 4次，合并有機溶劑相，減壓回收有機溶劑得第三步萃取產(chǎn)物；
萃取用的有機溶劑為氯仿、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、乙醚和異戊醇中的一 種。
步驟(4)中，柱層析分離用的載體為大孔樹脂、硅藻土、碳18填料、硅膠或氧 化鋁中的一種；層析柱分離用的洗脫液為水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯和乙 醚中的一種或幾種混合。
步驟(5)中重結(jié)晶用的溶劑為水、甲醇、乙醇、氯仿、乙醚、正丙醇和異丙醇 中的一種或幾種混合。
本發(fā)明方法具有以下技術(shù)效果
(1)提取率高，生產(chǎn)步驟簡單采用生物酶解技術(shù)將植物細(xì)胞壁部分分解，再 利用高速機械剪切力和攪拌力，迅速破壞植物細(xì)胞組織，使組織細(xì)胞內(nèi)部的化學(xué)成分與 溶劑充分接觸，使有效成分快速溶解轉(zhuǎn)移，在極短時間內(nèi)達(dá)到內(nèi)外溶解平衡，既大幅度 提高植物中生物堿的溶出，又避免高溫提取時的雜質(zhì)溶出，提高生產(chǎn)過程中的濾過速度和純化效果，簡化后續(xù)分離純化步驟。本發(fā)明與傳統(tǒng)提取方法比較，使用酸堿和有機溶 劑的量大大減少，因而對環(huán)境無污染、成本低。
(2)本發(fā)明采用的分段萃取技術(shù)，與以往工藝產(chǎn)品單一不同，根據(jù)pH的不同將 提取物分成3段，至少得到3種主要產(chǎn)品，綜合利用石蒜，大大提高了經(jīng)濟作物石蒜的價值。
(3)本發(fā)明產(chǎn)品純度高加蘭他敏純度達(dá)到99.5%、力可拉敏純度達(dá)到99%以 上，多花水仙堿純度可達(dá)99%，達(dá)到藥用要求，或可制備藥用其衍生物。
具體實施方式
下面舉例加以說明，這些實施例只是對本發(fā)明方法的進一步詳細(xì)描述，并不意 味著對本發(fā)明的任何限制。
實施例1
(1)提取
取10kg干石蒜片，30kg水溶液，于多功能提取罐中，調(diào)pH在6-7之間，溫度為 室溫，加入纖維素酶13.5g、果膠酶9.6g、半纖維素酶6.9g，酶解8小時，酶解結(jié)束后， 采用機械破碎技術(shù)將植物組織搗碎，過濾，濾液在真空度為0.08-0.09MPa、70°C濃縮， 得到1.3L比重為1.10(20°C時)的提取物濃縮液。
機械破碎技術(shù)可以是組織搗碎勻漿技術(shù)、固體樣品粉碎技術(shù)、高壓細(xì)胞破碎技 術(shù)或閃式提取技術(shù)。
(2)萃取
第一步萃取調(diào)提取物濃縮液的pH至6.5，加入乙醚進行2次萃取，用量分別 為1.3L、0.65L,合并乙醚相減壓回收乙醚，得第一步萃取產(chǎn)物；
第二步萃取第一步萃取的水相調(diào)pH值至8.5-9.5，乙酸乙酯萃取5次，每次用 量為0.5L，合并乙酸乙酯相減壓回收乙酸乙酯，得第二步萃取產(chǎn)物；
第三步萃取第二步萃取分出的水相調(diào)pH值至10.5-11，乙醚萃取兩次，用量 分別為0.6L、0.4L,合并乙醚相減壓回收乙醚得第三步萃取產(chǎn)物；
(3)分離精制
第一步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，碳酸氫鈉堿化至pH 8.0，乙酸乙酯按1 1比 例第三步萃取次，合并乙酸乙酯相減壓回收乙酸乙酯，以產(chǎn)品比硅膠1 20上柱，石油 醚乙酸乙酯(10 1-1 10)梯度洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，甲醇-氯仿重 結(jié)晶，烘干得1.8g多花水仙堿。
第二步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，以產(chǎn)品比碳18為1 10上柱，分別以水，30% 甲醇、60%甲醇、純甲醇、乙醇洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，乙醇重結(jié)晶，烘 干得11.2g加蘭他敏。
第三步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，以產(chǎn)品比硅藻土為1 50上柱，以石油醚、乙 酸乙酯、丙酮、甲醇分別洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，正丙醇重結(jié)晶，烘干得 13.7g力可拉敏。
實施例2
(1)提取[0042]取10kg干石蒜片，40kg水溶液，于多功能提取罐中，調(diào)pH在5-6之間，溫度為 40加入纖維素酶8.4g、果膠酶6.6g、半纖維素酶5g，酶解2小時后使用組織搗碎勻漿 破碎樣品，過濾，濾液在真空度為0.08-0.09MPa、77°C濃縮，得到1.2L比重為1.07 (20°C 時)的提取物濃縮液。
(2)萃取
第一步萃取調(diào)提取物濃縮液的pH至5.0，加入正丁醇進行3次萃取，用量分 別為0.6L、0.4L、0.4L,合并正丁醇相，減壓回收正丁醇，得第一步萃取產(chǎn)物；
第二步萃取第一步萃取的水層調(diào)pH值至9.0-9.5，氯仿第三步萃取次，用量分 別為0.6L、0.4L、0.4L,合并氯仿相減壓回收氯仿，得第二步萃取產(chǎn)物；
第三步萃取第二步萃取的水層調(diào)pH值至10.0-10.5，異戊醇萃取6次，用量分 都為0.4L，合并異戊醇相減壓回收異戊醇，得第三步萃取產(chǎn)物；
(3)分離精制
第一步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，氫氧化鈉堿化至pH 8.5，乙酸乙酯按1 1第 三步萃取次，合并乙酸乙酯相減壓回收，以產(chǎn)品比大孔樹脂1 60上柱，水，25%、 50%, 75%乙醇洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，乙醚重結(jié)晶，烘干得1.6g多花水 仙堿。
第二步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，以產(chǎn)品比硅膠為1 10上柱，分別以石油醚， 氯仿、無水乙醇洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，乙醇重結(jié)晶，烘干得7.8g加蘭他敏。
第三步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，以產(chǎn)品比氧化鋁為1 40上柱，以石油醚、丙 酮、甲醇分別洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，正丙醇重結(jié)晶，烘干得15.6g力可拉 敏。
實施例3
(1)提取
取10kg干忽地笑片，100kg水溶液，調(diào)pH在7-8之間，溫度為55度，加入纖 維素酶21.15g、果膠酶13.95g、半纖維素酶9.9g，酶解24小時，使高剪切閃式提取器 破碎樣品10分鐘，過濾，濾液在真空度為0.08-0.09MPa，77°C濃縮，得到2.1L比重為 1.05(20°C時)的提取物濃縮液。
(2)萃取
第一步萃取調(diào)提取物濃縮液的pH至6.0，加入乙酸乙酯進行4次萃取，每次 用量為0.6L，合并乙酸乙酯相，減壓回收乙酸乙酯得第一步萃取產(chǎn)物；
第二步萃取第一步萃取的水相調(diào)pH值至9.3-9.8，氯仿萃取二次，用量為0.8L 和0.6L，合并氯仿相，減壓回收氯仿，得第二步萃取產(chǎn)物；
第三步萃取第二步萃取的水相調(diào)pH值至10.7-10.9，乙醚萃取三次，用量均為 0.6L，合并乙醚相，減壓回收乙醚，得第三步萃取產(chǎn)物；
(3)分離精制
第一步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，碳酸氫鈉堿化至pH9.0，乙酸乙酯3次萃取， 合并乙酸乙酯相減壓回收乙酸乙酯，以產(chǎn)品比氧化鋁1 45上柱，石油醚、乙酸乙酯、 甲醇分別洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，乙醇-水重結(jié)晶，烘干得4.5g多花水仙堿。
第二步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，以產(chǎn)品比硅膠為1 35上柱，分別以石油醚， 氯仿、無水乙醇洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，乙醇重結(jié)晶，烘干得13.7g加蘭他敏。
第三步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，以產(chǎn)品比氧化鋁為1 30上柱，以石油醚、丙 酮、甲醇分別洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，正丙醇重結(jié)晶，烘干得11.6g力可拉 敏。
權(quán)利要求
1. 一種從石蒜屬植物中提取活性生物堿的方法，所述活性生物堿為多花水仙堿、加 蘭他敏和力可拉敏，該方法的步驟包括(1)在切碎后的石蒜屬植物中加入體積為2 10倍量的水，再加入復(fù)合纖維素酶，復(fù) 合纖維素酶與石蒜屬植物的質(zhì)量百分比為0.1 0.5%，調(diào)節(jié)pH值至5 8，在溫度20 60°C下酶解2 24小時，再將酶解后石蒜屬植物細(xì)胞破碎，過濾，得到提取液；復(fù)合纖 維素酶的組分及質(zhì)量比為纖維素酶40-50%、果膠酶30-40%、半纖維素酶20-30%;(2)濃縮上述提取液，得到提取物濃縮液，該濃縮液的比重在20°C測量時為1.05 1.15 ；(3)按pH值分步對上述提取物濃縮液進行萃取，萃取過程為第一步萃取將提取物濃縮液的pH調(diào)至5 7，加入0.5 3倍體積有機溶劑進行 萃取1 4次，合并有機溶劑相，減壓回收有機溶劑得第一步萃取產(chǎn)物；第一步萃取采用 的有機溶劑為乙醚、正丁醇或乙酸乙酯；第二步萃取將第一步萃取得到的水相調(diào)pH值至7 10，加入0.5 3倍體積有機 溶劑進行萃取1 4次，合并有機溶劑相，減壓回收有機溶劑得第二步萃取產(chǎn)物；第二步 萃取采用的有機溶劑為乙酸乙酯或氯仿第三步萃取將第二步萃取得到的水相調(diào)pH值至10 11，加入0.5 3倍體積有 機溶劑進行萃取1 4次，合并有機溶劑相，減壓回收有機溶劑得第三步萃取產(chǎn)物；第三 步萃取采用的有機溶劑為乙醚或異戊醇(4)多花水仙堿按照下述方式A1-A3中的一種進行分離(A1)第一步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，碳酸氫鈉堿化至pH 8.0，乙酸乙酯按1 1比例 萃取3次，合并乙酸乙酯相減壓回收乙酸乙酯，以產(chǎn)品比硅膠1 20上柱，石油醚乙 酸乙酯按10 1-1 10梯度洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，甲醇-氯仿重結(jié)晶， 烘干得到多花水仙堿；(A2)第一步萃取產(chǎn)物加水溶解，氫氧化鈉堿化至pH 8.5，乙酸乙酯按1 1萃取3 次，合并乙酸乙酯相減壓回收，以產(chǎn)品比大孔樹脂1 60上柱，水、25%、50%, 75% 乙醇洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，乙醚重結(jié)晶，烘干得到多花水仙堿；(A3)第一步萃取產(chǎn)物加水溶解，碳酸氫鈉堿化至pH9.0，乙酸乙酯3次萃取，合并乙 酸乙酯相減壓回收乙酸乙酯，以產(chǎn)品比氧化鋁1 45上柱，石油醚、乙酸乙酯、甲醇分 別洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，乙醇-水重結(jié)晶，烘干得到多花水仙堿； 加蘭他敏按照下述方式B1-B3中的一種進行分離(B1)第二步萃取產(chǎn)物加水溶解，以產(chǎn)品比碳18為1 10上柱，分別以水、30%甲 醇、60%甲醇、純甲醇、乙醇洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，乙醇重結(jié)晶，烘干 得到加蘭他敏；(B2)第二步萃取產(chǎn)物加水溶解，以產(chǎn)品比硅膠為1 10上柱，分別以石油醚、氯 仿、無水乙醇洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，乙醇重結(jié)晶，烘干得到加蘭他敏；(B3)第二步萃取產(chǎn)物加水溶解，以產(chǎn)品比硅膠為1 35上柱，分別以石油醚、氯 仿、無水乙醇洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，乙醇重結(jié)晶，烘干得到加蘭他敏； 力可拉敏按照下述方式C1-C3中的一種進行分離(C1)第三步萃取產(chǎn)物加水溶解，以產(chǎn)品比硅藻土為1 50上柱，以石油醚、乙酸乙 酯、丙酮、甲醇分別洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，正丙醇重結(jié)晶，烘干得到力 可拉敏；(C2)第三步萃取產(chǎn)物加水溶解，以產(chǎn)品比氧化鋁為1 40上柱，以石油醚、丙酮、 甲醇分別洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，正丙醇重結(jié)晶，烘干得到力可拉敏；(C3)第三步萃取產(chǎn)物加水溶解，以產(chǎn)品比氧化鋁為1 30上柱，以石油醚、丙酮、 甲醇分別洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同組分，正丙醇重結(jié)晶，烘干得到力可拉敏； (5)將柱層析分離得到的相同組分合并，反復(fù)重結(jié)晶，得到多種高純度單體。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于重結(jié)晶用的溶劑為水、甲醇、乙醇、 氯仿、乙醚、正丙醇和異丙醇中的一種或幾種混合。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種從石蒜屬植物中提取活性生物堿的方法，采用酶法與現(xiàn)代機械破壁技術(shù)結(jié)合提取石蒜生物堿，達(dá)到在溫和條件下高效高產(chǎn)率提取石蒜中的生物堿，減小其它雜質(zhì)的溶出，減小提取液粘度利于后續(xù)分離純化的處理；并根據(jù)石蒜生物堿堿性強弱不同，使用分段萃取技術(shù)同步得到多種石蒜生物堿粗產(chǎn)品，再經(jīng)過柱層析和反復(fù)重結(jié)晶得到高純度的石蒜生物堿單體(加蘭他敏、石蒜堿、力可拉敏、多花水仙堿)。本發(fā)明路線簡單、無污染、周期短、產(chǎn)品收得率高、安全系數(shù)高、成本低、產(chǎn)品多樣，提高了石蒜綜合利用度，同時降低了石蒜深加工的生產(chǎn)成本，工業(yè)化大生產(chǎn)可行性強。
文檔編號C12P17/18GKCN101157947 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200710053207
公開日2011年4月20日 申請日期2007年9月13日
發(fā)明者余龍江, 崔永明, 廖娜, 張明, 敖明章, 江喜敏 申請人:華中科技大學(xué), 恩施市錦華生物工程有限責(zé)任公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (1),