專利名稱:用寇氏隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法，具體地說是一種用海洋微藻中的寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii(Selgo)Javornicky]發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法。
背景技術(shù)：
近年來，多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)對(duì)人類健康的重要作用已愈來愈受到人們的重視。其中，二十二碳六烯酸因其在人體和動(dòng)物體內(nèi)的重要生理功能而倍受人們的青睞。研究表明，DHA是人體某些組織中細(xì)胞膜的基本組分；對(duì)嬰幼兒視覺系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起著重要作用；還具有降低膽固醇作用，抗凝血功效以及抑制癌功效，防止老年性癡呆癥等，并且它是幼魚生長(zhǎng)所必需的一種脂肪酸?，F(xiàn)在公開報(bào)道用海洋微藻生產(chǎn)二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法有兩種。一種是授權(quán)公告日為2006年7月19日、授權(quán)公告號(hào)為CN1264967C的發(fā)明專利公開的利用海洋真菌裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法。另一種是
公開日為1995年4月5日、公開號(hào)為CN1101034A的專利申請(qǐng)公開的利用海洋微藻生產(chǎn)二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法。上述兩種方法存在的缺陷在于二十二碳六烯酸(DHA)的產(chǎn)量不高。前一種方法海藻細(xì)胞的干重生物量為14-25g/L，菌體中DHA的百分含量為18-35％，后一種方法得到的海藻細(xì)胞的干重生物量更低，只有4-8g/L。其原因主要是與所選菌種有關(guān)外，還與培養(yǎng)工藝有直接的關(guān)系，如采用合適的培養(yǎng)基等。多年來，國內(nèi)外許多研究者進(jìn)行了大量的研究篩選不同的菌種，研究采用各種培養(yǎng)工藝均沒有得到理想的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種用海洋微藻中的寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法，它大大地提高了二十二碳六烯酸(簡(jiǎn)稱DHA)的產(chǎn)量。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的它是以寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]為出發(fā)菌株，在液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)寇氏隱甲藻得到海藻細(xì)胞，然后從海藻細(xì)胞中提取二十二碳六烯酸油脂。本發(fā)明所用的寇氏隱甲藻菌種名稱是Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky?？梢詮陌ˋTCC(美國典型培養(yǎng)物收集中心)的保藏培養(yǎng)機(jī)構(gòu)獲得。
其中所用的培養(yǎng)基為每100ml液體培養(yǎng)基中含有氯化鈉0.5-2.0g 硫酸鎂0.2-0.8g氯化鈣0.01-0.05g 葡萄糖1.0-10g氯化鉀0.01-0.08g 磷酸二氫鉀0.1-0.5g谷氨酸鈉0.5-5.0g 酵母膏0.5-5.0g維生素B10.001-0.01g 維生素B60.001-0.01g。
優(yōu)選的培養(yǎng)基配方如下氯化鈉1.8g 硫酸鎂0.55g氯化鈣0.035g 葡萄糖7g氯化鉀0.05g 磷酸二氫鉀0.32g谷氨酸鈉3.8g 酵母膏3.5g維生素B10.006g 維生素B60.008g。
本發(fā)明采用斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)和三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)，得到海藻細(xì)胞。其中海藻細(xì)胞的生產(chǎn)方法具體步驟如下(1)取出斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶種，25-35℃培養(yǎng)，培養(yǎng)24-72小時(shí)。
(2)將步驟1中的搖瓶菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，25-35℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120-180rpm/min，培養(yǎng)30-60小時(shí)。
(3)將步驟2中的搖瓶菌種轉(zhuǎn)接入一個(gè)裝有一級(jí)種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為0.1-1％，保持罐溫25-35℃，罐壓0.05-0.09kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量1∶0.3-0.5v/v.m，發(fā)酵24-48小時(shí)。
(4)將一級(jí)種子罐中的菌種轉(zhuǎn)接入一個(gè)裝有二級(jí)種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為1-10％，保持罐溫25-35℃，罐壓0.05-0.09kPa，攪拌速度80-150rpm/min，通氣量1∶0.3-0.5v/v.m，發(fā)酵24-48小時(shí)。
(5)將二級(jí)種子罐種的菌種轉(zhuǎn)接入一個(gè)裝有三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為1-10％，保持罐溫25-35℃，罐壓0.05-0.09kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量1∶0.3-0.5v/v.m，發(fā)酵60-120小時(shí)。在還原糖含量降低到0.5％以下，氮含量降低至0.02％以下時(shí)放罐。放罐后液體使用膜過濾方法，回收海藻細(xì)胞。
本發(fā)明的提取方法有兩種，一種是將海藻細(xì)胞經(jīng)低溫干燥，然后將干燥菌絲體用有機(jī)溶劑浸提18h-28h后，得到二十二碳六烯酸毛油，將二十二碳六烯酸毛油經(jīng)堿煉、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。另一種是在濃縮發(fā)酵液中加入表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉作為破壁劑，其用量為濃縮發(fā)酵液重量的0.1-0.6％，然后用有機(jī)溶劑浸提18h-28h后，得到二十二碳六烯酸毛油，將二十二碳六烯酸毛油經(jīng)脫膠、脫酸、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。其中所述的有機(jī)溶劑為正己烷或氯仿等。優(yōu)選的提取方法是在α-生育酚存在或在惰性氣體如氮?dú)庵?，進(jìn)行從海藻細(xì)胞中提取DHA。采用后一種提取方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要經(jīng)過干燥，可以防止二十二碳六烯酸毛油的氧化，使萃取油脂過氧化值極低，POV值在0.5以下。
本發(fā)明所用培養(yǎng)基可含有適當(dāng)?shù)奶荚?、氮源、無機(jī)鹽。所述的培養(yǎng)基是以葡萄糖或甘油或果糖為碳源，以酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、谷氨酸、玉米漿、大豆蛋白中一種或混合物為氮源。
培養(yǎng)基中用于連續(xù)培養(yǎng)的碳源濃度一般優(yōu)選在1.0到10.0％重量范圍內(nèi)。
培養(yǎng)基中用于連續(xù)培養(yǎng)的氮源濃度可以優(yōu)選在0.5到5.0％重量范圍內(nèi)。
對(duì)于連續(xù)添加的培養(yǎng)基，可以用相對(duì)于培養(yǎng)基(I)，用10％(V/V)葡萄糖和2.4％(V/V)酵母浸膏補(bǔ)充到培養(yǎng)基(I)中形成的改良培養(yǎng)基。
本發(fā)明選用合適的海洋微藻作為菌種，在培養(yǎng)基中加入了維生素，通過篩選合適的工藝方法，大大提高了二十二碳六烯酸油脂的產(chǎn)量，海藻細(xì)胞中二十二碳六烯酸含量在30％-50％，獲得的海藻細(xì)胞為20-40g/L，海藻細(xì)胞含油量為20-50％。以上各項(xiàng)指標(biāo)明顯高于現(xiàn)有技術(shù)。
具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例1培養(yǎng)基配方(g/100ml)(I)氯化鈉1.25g 氯化鉀0.07g 氯化鈣0.035g硫酸鎂0.8g 磷酸二氫鉀0.2g 谷氨酸鈉4.0g酵母浸膏2.0g 葡萄糖7.5g 維生素B10.003g維生素B60.005g。
加水至所需體積，PH控制在6.5-7.0。
培養(yǎng)基(II)相對(duì)于培養(yǎng)基(I)，用10％(V/V)葡萄糖和2.4％(V/V)酵母浸膏補(bǔ)充到培養(yǎng)基(I)中形成的改良培養(yǎng)基。
本發(fā)明采用斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)和三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)，得到海藻細(xì)胞。其生產(chǎn)方法具體步驟如下將名稱為Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky的寇氏隱甲藻細(xì)胞接種在無菌斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間48h。
將新鮮的斜面菌種接入裝有100ml培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28℃搖床培養(yǎng)48-72小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。然后將所得搖瓶菌種100ml接種到5個(gè)三角搖瓶(1000ml)中，每個(gè)含200ml培養(yǎng)基(PH6.8)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，28℃搖床培養(yǎng)48小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。對(duì)以上每個(gè)搖瓶做無菌檢測(cè)，將反應(yīng)良好的搖瓶種子接入一級(jí)種子罐。
將三角搖瓶擴(kuò)大的菌種1000ml轉(zhuǎn)接入裝有60L種子培養(yǎng)基的100L一級(jí)種子罐中，保持罐溫28℃，罐壓0.07KPa，攪拌速率100rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)。將一級(jí)種子罐菌種轉(zhuǎn)接入裝有700L種子培養(yǎng)基(PH7.0)的1000L容積的二級(jí)種子培養(yǎng)罐中，保持罐溫28℃、罐壓0.07KPa，攪拌速率100rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發(fā)酵時(shí)間36小時(shí)。將二級(jí)種子罐菌種轉(zhuǎn)接入裝有30000L三級(jí)發(fā)酵罐中，保持罐溫28℃、罐壓0.07KPa，攪拌速率100rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發(fā)酵時(shí)間80小時(shí)。
本實(shí)施例中斜面培養(yǎng)基組成是(g/100ml)葡萄糖5g，酵母浸膏1.2g，瓊脂1.5g，加水定容至100ml。
本實(shí)施例中搖瓶培養(yǎng)、搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)、三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基均為為培養(yǎng)基(I)。
在發(fā)酵開始后，收集樣品，在105℃干燥5h以測(cè)量藻細(xì)胞密度。當(dāng)藻細(xì)胞的密度達(dá)到5g/L時(shí)，在與上述罐發(fā)酵相同的培養(yǎng)條件下，通過以0.1h/r的稀釋速率連續(xù)補(bǔ)充培養(yǎng)基(II)，從而開始連續(xù)培養(yǎng)3天。連續(xù)培養(yǎng)開始后，在培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)一個(gè)有復(fù)鞭毛的藻細(xì)胞。(下文將由此得到的藻細(xì)胞稱為“連續(xù)培養(yǎng)藻細(xì)胞”)本實(shí)施例中發(fā)酵結(jié)束標(biāo)準(zhǔn)是發(fā)酵液開始變濃，還原糖含量降低到0.5％以下，氮含量降低至0.02％以下，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體開始衰老。
將從發(fā)酵器中流出的發(fā)酵液在105℃干燥5h以找出產(chǎn)率為30.0g/L的干燥細(xì)胞和一個(gè)油脂生產(chǎn)量為10g/L的干燥藻細(xì)胞。
將從發(fā)酵器中流出的發(fā)酵液經(jīng)膜過濾濃縮后，低溫干燥，干燥藻細(xì)胞用正己烷萃取，得到DHA毛油，DHA毛油經(jīng)脫膠、脫酸、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。DHA油脂經(jīng)甲基酯化，用氣相色譜分析確定其含量。
經(jīng)氣相層析確定的藻細(xì)胞中脂肪酸組成如下。
脂肪酸名稱 脂肪酸含量C10:0 0.3532
C12:0 0.1065C14:0 11.0994C16:0 22.39C16:1 0.199C18:0 0.9863C18:1 0.3714C18:2 0.3588C18:4 0.1092C20:4 3.645C20:5 0.4312C22:5 16.17C22:6 43.78實(shí)施例2海藻細(xì)胞的培養(yǎng)和發(fā)酵同實(shí)施例1相同。提取方法是將從發(fā)酵器中流出的發(fā)酵液經(jīng)膜過濾濃縮后，在濃縮發(fā)酵液中加入十二烷基硫酸鈉作為破壁劑，其用量為濃縮發(fā)酵液重量的0.1-0.6％，然后用正己烷浸提18h-28h后，得到二十二碳六烯酸毛油，將二十二碳六烯酸毛油經(jīng)脫膠、脫酸、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。
DHA精煉油過氧化值為0.1meq/kg，酸價(jià)0.14mg(KOH)/g。
DHA油脂經(jīng)甲基酯化，用氣相色譜分析確定其含量。
經(jīng)氣相層析確定的藻細(xì)胞中脂肪酸組成如下。
脂肪酸名稱 脂肪酸含量C10:0 0.3532C12:0 0.1065C14:0 11.0994C16:0 22.39C16:1 0.199C18:0 0.9863C18:1 0.3714C18:2 0.3588
C18:4 0.1092C20:4 3.645C20:5 0.4312C22:5 16.17C22:6 43.78實(shí)施例3培養(yǎng)基(I)氯化鈉1.35g 氯化鉀0.065g 氯化鈣0.04g硫酸鎂0.7g 磷酸二氫鉀0.3g 谷氨酸鈉4.3g酵母浸膏3.0g 葡萄糖8.5g 維生素B10.005g維生素B60.006g加水至100ml培養(yǎng)基(II)相對(duì)于培養(yǎng)基(I)，用10％(V/V)葡萄糖和2.4％(V/V)酵母浸膏補(bǔ)充到培養(yǎng)基(I)中形成的改良培養(yǎng)基。
將名稱為Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky的細(xì)胞接種在無菌斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為28.5℃，培養(yǎng)時(shí)間48h。
將新鮮的斜面菌種接入裝有100ml培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28.5℃搖床培養(yǎng)48-72小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速140r/min。然后將所得搖瓶菌種100ml接種到5個(gè)三角搖瓶(1000ml)中，每個(gè)含200ml培養(yǎng)基(PH6.8)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，28.5℃搖床培養(yǎng)48小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速140r/min。對(duì)以上每個(gè)搖瓶做無菌檢測(cè)，將反應(yīng)良好的搖瓶種子接入一級(jí)種子罐。
將三角搖瓶擴(kuò)大的菌種1000ml轉(zhuǎn)接入裝有60L種子培養(yǎng)基的100L一級(jí)種子罐中，保持罐溫28.5℃，罐壓0.07KPa，攪拌速率100rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發(fā)酵時(shí)間24小時(shí)。將一級(jí)種子罐菌種轉(zhuǎn)接入裝有700L種子培養(yǎng)基(PH7.0)的1000L容積的二級(jí)種子培養(yǎng)罐中，保持罐溫28.5℃、罐壓0.07KPa，攪拌速率100rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發(fā)酵時(shí)間28小時(shí)。將二級(jí)種子罐菌種轉(zhuǎn)接入裝有30000L培養(yǎng)基的50000L三級(jí)發(fā)酵罐中，保持罐溫28.5℃、罐壓0.07KPa，攪拌速率110rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發(fā)酵時(shí)間85小時(shí)。
本實(shí)施例中斜面培養(yǎng)基組成是(g/100ml)葡萄糖4.8，酵母浸膏1.5，瓊脂1.5，加水定容100ml。
本實(shí)施例中搖瓶培養(yǎng)、搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)、三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基為培養(yǎng)基(I)。
在發(fā)酵開始后，收集樣品，在105℃干燥5h以測(cè)量藻細(xì)胞密度。當(dāng)藻細(xì)胞的密度達(dá)到5g/L時(shí)，在與上述罐發(fā)酵相同的培養(yǎng)條件下，通過以0.1h/r的稀釋速率連續(xù)補(bǔ)充培養(yǎng)基(II)，從而開始連續(xù)培養(yǎng)3天。連續(xù)培養(yǎng)開始后，在培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)一個(gè)有復(fù)鞭毛的藻細(xì)胞。
從發(fā)酵器中流出的培養(yǎng)基在105℃干燥5h以找出產(chǎn)率為28.0g/L的干燥細(xì)胞和一個(gè)油脂生產(chǎn)量為7.84g/L的干燥藻細(xì)胞。
將從發(fā)酵器中流出的發(fā)酵液經(jīng)膜過濾濃縮后，低溫干燥，干燥藻細(xì)胞用氯仿萃取，得到DHA毛油，DHA毛油經(jīng)脫膠、脫酸、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。DHA油脂經(jīng)甲基酯化，用氣相色譜分析確定其含量。
經(jīng)氣相層析確定的藻細(xì)胞中脂肪酸組成如下。
脂肪酸名稱 脂肪酸含量C10:0 0.4673C12:0 0.4265C14:0 14.0800C16:0 21.6900C16:1 0.1690C18:0 0.9761C18:1 0.6521C18:2 0.3716C18:4 0.1889
C20:4 4.1000C20:5 0.4185C22:5 15.68C22:6 40.78實(shí)施例5培養(yǎng)基配方(g/100ml)(I)氯化鈉1.8g 氯化鉀0.05g 氯化鈣0.035g硫酸鎂0.55g 磷酸二氫鉀0.32g 谷氨酸鈉3.8g酵母浸膏3.5g 葡萄糖7.0g 維生素B10.006g維生素B60.008g加水至100ml。
培養(yǎng)基(II)與實(shí)施例1相同。
將名稱為Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky的細(xì)胞接種在無菌斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間50h。
將新鮮的斜面菌種接入裝有100ml培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28℃搖床培養(yǎng)48小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速140r/min。然后將所得搖瓶菌種100ml接種到5個(gè)三角搖瓶(1000ml)中，每個(gè)含200ml培養(yǎng)基(PH6.8)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，28℃搖床培養(yǎng)48小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速140r/min。對(duì)以上每個(gè)搖瓶做無菌檢測(cè)，將反應(yīng)良好的搖瓶種子接入一級(jí)種子罐。
將三角搖瓶擴(kuò)大的菌種1000ml轉(zhuǎn)接入裝有60L種子培養(yǎng)基的100L一級(jí)種子罐中，保持罐溫28℃，罐壓0.07KPa，攪拌速率120rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)。將一級(jí)種子罐菌種轉(zhuǎn)接入裝有700L種子培養(yǎng)基(PH7.0)的1000L容積的二級(jí)種子培養(yǎng)罐中，保持罐溫28℃、罐壓0.07KPa，攪拌速率120rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)。將二級(jí)種子罐菌種轉(zhuǎn)接入裝有30000L培養(yǎng)基的50000L三級(jí)發(fā)酵罐中，保持罐溫28℃、罐壓0.07KPa，攪拌速率120rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發(fā)酵時(shí)間80小時(shí)。
本實(shí)施例中斜面培養(yǎng)基組成是(g/100ml)葡萄糖5.5，酵母浸膏2.0，瓊脂1.5，加水定容至所需體積，PH值為自然。
本實(shí)施例中搖瓶培養(yǎng)、搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)、三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基為培養(yǎng)基(I)。
在發(fā)酵開始后，收集樣品，在105℃干燥5h以測(cè)量藻細(xì)胞密度。當(dāng)藻細(xì)胞的密度達(dá)到5g/L時(shí)，在與上述罐發(fā)酵相同的培養(yǎng)條件下，通過以0.1h/r的稀釋速率連續(xù)補(bǔ)充培養(yǎng)基(II)，從而開始連續(xù)培養(yǎng)3天。連續(xù)培養(yǎng)開始后，在培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)一個(gè)有復(fù)鞭毛的藻細(xì)胞。
從發(fā)酵器中流出的培養(yǎng)基在105℃干燥5h以找出產(chǎn)率為27.0g/L的干燥細(xì)胞和一個(gè)油脂生產(chǎn)量為7.02g/L的干燥藻細(xì)胞。
將從發(fā)酵器中流出的發(fā)酵液經(jīng)膜過濾濃縮后，低溫干燥，干燥藻細(xì)胞用正己烷萃取，萃取時(shí)用α-生育酚作為抗氧化劑在氮?dú)庵羞M(jìn)行萃取，得到DHA毛油，DHA毛油經(jīng)脫膠、脫酸、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。DHA油脂經(jīng)甲基酯化，用氣相色譜分析確定其含量。
經(jīng)氣相層析確定的藻細(xì)胞中脂肪酸組成如下。
脂肪酸名稱 脂肪酸含量C10:0 0.3800C12:0 0.1240C14:0 11.1174C16:0 22.1200C16:1 0.1625C18:0 0.9156C18:1 0.3485C18:2 0.3927C18:4 0.3892C20:4 5.2475C20:5 0.4326C22:5 18.2300
C22:6 40.1400各種培養(yǎng)基的對(duì)比試驗(yàn)數(shù)據(jù)如下表1培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)表


表2發(fā)酵液檢查結(jié)果表


通過表1、表2可以看出配方1優(yōu)于其他配方。從而可以得出以下結(jié)論同樣發(fā)酵條件下，在培養(yǎng)基中添加維生素B1和維生素B6，可提高發(fā)酵液中生物量，同時(shí)提高藻細(xì)胞的含油量。因此，本發(fā)明優(yōu)選配方1的培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
1.一種用寇氏隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法，它是以寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]為出發(fā)菌株，在液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)寇氏隱甲藻得到海藻細(xì)胞，然后從海藻細(xì)胞中提取二十二碳六烯酸油脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用寇氏隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法，其中所用的培養(yǎng)基為每100ml液體培養(yǎng)基中含有氯化鈉0.5-2.0g 硫酸鎂0.2-0.8g氯化鈣0.01-0.05g 葡萄糖1.0-10g氯化鉀0.01-0.08g 磷酸二氫鉀0.1-0.5g谷氨酸鈉0.5-5.0g 酵母膏0.5-5.0g維生素B10.001-0.01g 維生素B60.001-0.01g。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的用寇氏隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法，其中海藻細(xì)胞油脂中二十二碳六烯酸含量在30％-50％。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的用寇氏隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法，其中三級(jí)發(fā)酵時(shí)間為60h-120h，獲得的海藻細(xì)胞為20-40g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的用寇氏隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法，其中海藻細(xì)胞含油量為20-50％。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的用寇氏隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法，其中它采用斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)和三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)，得到海藻細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的用寇氏隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法，其中海藻細(xì)胞的生產(chǎn)方法具體步驟如下(1)取出斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶種，25-35℃培養(yǎng)，培養(yǎng)24-72小時(shí)。(2)將步驟1中的搖瓶菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，25-35℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120-180rpm/min，培養(yǎng)30-60小時(shí)。(3)將步驟2中的搖瓶菌種轉(zhuǎn)接入一個(gè)裝有一級(jí)種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為0.1-1％，保持罐溫25-35℃，罐壓0.05-0.09kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量10.3-0.5v/v.m，發(fā)酵24-48小時(shí)。(4)將一級(jí)種子罐中的菌種轉(zhuǎn)接入一個(gè)裝有二級(jí)種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為1-10％，保持罐溫25-35℃，罐壓0.05-0.09kPa，攪拌速度80-150rpm/min，通氣量10.3-0.5v/v.m，發(fā)酵24-48小時(shí)。(5)將二級(jí)種子罐種的菌種轉(zhuǎn)接入一個(gè)裝有三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為1-10％，保持罐溫25-35℃，罐壓0.05-0.09kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量10.3-0.5v/v.m，發(fā)酵60-120小時(shí)。在還原糖含量降低到0.5％以下，氮含量降低至0.02％以下時(shí)放罐。放罐后液體使用膜過濾方法，回收海藻細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用寇氏隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法，其中所述的提取方法是將海藻細(xì)胞經(jīng)低溫干燥，然后將干燥菌絲體用有機(jī)溶劑浸提18h-28h后，得到二十二碳六烯酸毛油，將二十二碳六烯酸毛油經(jīng)堿煉、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用寇氏隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法，其中所述的提取方法是在濃縮發(fā)酵液中加入破壁劑，其用量為濃縮發(fā)酵液重量的0.1-0.6％，然后用有機(jī)溶劑浸提18h-28h后，得到二十二碳六烯酸毛油，將二十二碳六烯酸毛油經(jīng)脫膠、脫酸、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用寇氏隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法，其中所述的有機(jī)溶劑為正己烷或氯仿。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種用海洋微藻中的寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法。它是以寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]為出發(fā)菌株，在液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)寇氏隱甲藻得到海藻細(xì)胞，然后從海藻細(xì)胞中提取二十二碳六烯酸油脂。本發(fā)明選用合適的海洋微藻作為菌種，在培養(yǎng)基中加入了維生素，通過篩選合適的工藝方法，大大提高了二十二碳六烯酸油脂的產(chǎn)量，海藻細(xì)胞中二十二碳六烯酸含量在30％－50％，獲得的海藻細(xì)胞為20－40g/L，海藻細(xì)胞含油量為20－50％。以上各項(xiàng)指標(biāo)明顯高于現(xiàn)有技術(shù)。
文檔編號(hào)C12R1/89GKCN1986822SQ200610125476
公開日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2006年12月15日
發(fā)明者蔡立剛, 袁謙, 簡(jiǎn)曉紅 申請(qǐng)人:湖北友芝友生物科技有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan