專(zhuān)利名稱:一種人外泌汗腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人類(lèi)細(xì)胞的培養(yǎng)，具體涉及一種外泌汗腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
外泌汗腺是皮膚重要的附屬器之一，有分泌、排泄和調(diào)節(jié)體溫的作用。體外分離和培養(yǎng)外泌汗腺細(xì)胞的意義在于它能提供跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究和外泌汗腺相關(guān)疾病研究的模型；其次，皮膚組織工程發(fā)展至今，已基本解決了創(chuàng)面覆蓋的問(wèn)題，但未達(dá)到真正的組織結(jié)構(gòu)和功能的完全重建，在目前所有的組織工程皮膚產(chǎn)品中，都無(wú)皮膚附件，分離和培養(yǎng)外泌汗腺各種細(xì)胞能為汗腺的三維重建和研究帶附件的組織工程皮膚奠定基礎(chǔ)。
上世紀(jì)90年代始，國(guó)外有研究者進(jìn)行了人外泌汗腺細(xì)胞培養(yǎng)和藥理學(xué)特性方面的研究，既往的研究均采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)。其缺點(diǎn)在于組織塊培養(yǎng)方法的原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，且并非每一塊都有細(xì)胞萌出，故細(xì)胞傳代次數(shù)和最終獲取的細(xì)胞數(shù)較少，細(xì)胞種類(lèi)不純，使進(jìn)一步持續(xù)深入研究受到限制。目前，尚未見(jiàn)有關(guān)于人外泌汗腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法的專(zhuān)利文獻(xiàn)公開(kāi)；有一件公開(kāi)號(hào)為CN1082109A的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)于1994年2月16日公開(kāi)，它是“一種肝細(xì)胞體外培養(yǎng)方法”，包括取肝、分離、清洗、沉淀、消化、培養(yǎng)、接種等步驟，采用邊條參液合成培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)，方法簡(jiǎn)便，培養(yǎng)的肝細(xì)胞活性良好，生物學(xué)特征正常，但不適合于人外泌汗腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種區(qū)別于組織塊培養(yǎng)法的人外泌汗腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，使之簡(jiǎn)單易行，培養(yǎng)獲得的人外泌汗腺上皮細(xì)胞較純，生長(zhǎng)良好，細(xì)胞增殖快，可多次傳代，還可誘導(dǎo)汗腺樣管狀結(jié)構(gòu)形成。
采取以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
一種人外泌汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，由人外泌汗腺挑取、酶消化、離心純化、培養(yǎng)基配制、二維培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)和三維構(gòu)建汗腺樣管狀結(jié)構(gòu)培養(yǎng)七步過(guò)程組成。
一)人外泌汗腺挑取首先獲取健康人的皮膚切除術(shù)后皮條，并立即置于D-Hank’s液中反復(fù)沖洗3-5次，再用眼科剪剪碎后置于磷酸鹽緩沖液中重懸，然后將組織懸液置于至少20倍解剖顯微鏡下觀察，用眼科鑷直接挑取人外泌汗腺。
二)酶消化將挑取的人外泌汗腺置入體積分?jǐn)?shù)為0.4％的IV型膠原酶中，在37℃消化10-14小時(shí)，并不時(shí)搖動(dòng)，使組織消化均勻、完全。
三)離心純化將D-Hank’s液40-50ml加入到酶消化好的人外泌汗腺組織中，反復(fù)離心3-5次，每次2000-3000rpm×5min，獲得純化的人外泌汗腺上皮細(xì)胞，然后用0.2％臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。
四)培養(yǎng)基配制在無(wú)血清表皮細(xì)胞培養(yǎng)基中加入5ug/L的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和50mg/L的牛垂體提取物，獲得汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基，保存?zhèn)溆谩?br> 五)二維培養(yǎng)將純化的人外泌汗腺上皮細(xì)胞用汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基重懸，制得人外泌汗腺上皮細(xì)胞重懸液，再加入到涂有膠原的培養(yǎng)瓶中接種，接種密度為1-100×103個(gè)細(xì)胞/cm2，蓋緊膠塞，置于37℃，5％CO2的孵箱培養(yǎng)，每3天更換汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基一次，每天取樣置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，至細(xì)胞融合度達(dá)70％～80％。
六)傳代培養(yǎng)將融合度達(dá)70％～80％的細(xì)胞每瓶加胰酶0.5ml，在37℃孵箱中消化5～10min，當(dāng)細(xì)胞變圓、細(xì)胞間隙增大時(shí)，用胰酶抑制劑終止消化，加入D-Hank’s液10ml，離心2000-3000rpm×5min，獲得的細(xì)胞再加入汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基重懸，接種于瓶底涂有膠原的培養(yǎng)瓶中，接種密度為1-20×104個(gè)/cm2，置于37℃，5％CO2孵箱中繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)；每3天更換汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基一次，每天取樣置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
七)三維重建汗腺管狀結(jié)構(gòu)培養(yǎng)在冰浴條件下，將純化的人外泌汗腺上皮細(xì)胞以1-50×103個(gè)/ml的密度，混合于Matrigel凝膠中，以每孔2ml加入到12孔板中，再加入汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基2ml/孔進(jìn)行三維培養(yǎng)，并每3天更換汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基一次，每天取樣置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)生長(zhǎng)9天后的細(xì)胞團(tuán)取樣固定、切片、HE染色觀察管狀結(jié)構(gòu)形成情況。
在本發(fā)明的人外泌汗腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法中，所用原輔材料全層皮膚、磷酸鹽緩沖液、IV型膠原酶、無(wú)血清表皮細(xì)胞培養(yǎng)基、表皮生長(zhǎng)因子、牛垂體提取物、膠原和Matrigel凝膠等，均應(yīng)符合無(wú)菌要求。
本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)一是制備方法簡(jiǎn)便，技術(shù)穩(wěn)定，重復(fù)性好；二是采用膠原酶消化法獲得了單個(gè)的外泌汗腺上皮細(xì)胞，避免了既往的組織塊法獲得細(xì)胞量少，細(xì)胞不純的缺點(diǎn)；三是采用無(wú)血清培養(yǎng)基，避免了血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用；四是在Matrigel凝膠中進(jìn)行三維培養(yǎng)使細(xì)胞生長(zhǎng)好，增殖更快，更重要的是經(jīng)切片染色后發(fā)現(xiàn)有汗腺樣管狀結(jié)構(gòu)形成，有利于體外實(shí)驗(yàn)和研究，為體外重建汗腺奠定基礎(chǔ)。
四具體實(shí)施方式
下面是本發(fā)明的人外泌汗腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法一個(gè)具體的培養(yǎng)實(shí)例，但需要說(shuō)明的是，本發(fā)明方法絕不局限于所舉的培養(yǎng)實(shí)例。
取人體腋部整形術(shù)切除的全層皮膚3×3cm大小，立即將皮膚組織置于D-Hank’s液中反復(fù)沖洗五次，剪成小皮條后，再用眼科剪剪碎，再置于50ml磷酸鹽緩沖液中重懸，獲得的組織懸液置于20倍解剖顯微鏡下觀察，用眼科鑷直接挑取人外泌汗腺；將挑取的人外泌汗腺置入體積分?jǐn)?shù)為0.1％的IV型膠原酶30ml中，在37℃消化12小時(shí)，并不時(shí)搖動(dòng)，使組織消化均勻、完全；在酶消化好的人外泌汗腺組織中加入D-Hank’s液至50ml，反復(fù)離心5次，每次2500rpm×5min，獲得純化的人外泌汗腺上皮細(xì)胞細(xì)胞，然后用0.2％臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。
將純化的人外泌汗腺上皮細(xì)胞用汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基重懸，制得人外泌汗腺上皮細(xì)胞重懸液，再將該懸液加入到涂有鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶中接種，接種密度為5×104個(gè)細(xì)胞/cm2，蓋緊膠塞，置于37℃，5％CO2的孵箱培養(yǎng)，每3天換汗腺腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基一次，每天取樣置于顯微鏡下觀察，在24小時(shí)后可觀察到細(xì)胞貼壁，3-4天左右觀察到細(xì)胞呈多個(gè)克隆樣麥粒樣生長(zhǎng)，3周左右細(xì)胞融合呈鋪路石樣生長(zhǎng)，基本鋪滿瓶底，融合后的汗腺腺上皮細(xì)胞為扁平多角形，中間有圓形核，細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)70％～80％時(shí)可用于實(shí)驗(yàn)或傳代。
將融合度達(dá)70％～80％的細(xì)胞每瓶加胰酶0.5ml，在37℃孵箱中消化5～10min，當(dāng)細(xì)胞變圓、細(xì)胞間隙增大時(shí)，用胰酶抑制劑終止消化，加入D-Hank’s液10ml，離心2500rpm×5min，獲得的細(xì)胞加入汗腺腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基重懸，接種于瓶底涂有膠原的培養(yǎng)瓶中，接種密度為1×104個(gè)/cm2，置于37℃，5％CO2孵箱中繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)；每3天更換汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基一次，每天取樣置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，可見(jiàn)傳代細(xì)胞于24小時(shí)內(nèi)貼壁，第I代細(xì)胞形態(tài)與原代相似，大部分為扁平多角形，從第II代開(kāi)始細(xì)胞體積變大，形態(tài)逐漸變得不規(guī)則，有的細(xì)胞伸出長(zhǎng)的偽足與鄰近細(xì)胞相接。本方法培養(yǎng)的人外泌汗腺腺上皮細(xì)胞能傳代3～5次。
三維構(gòu)建汗腺管狀結(jié)構(gòu)培養(yǎng)是在冰浴條件下，將純化的人外泌汗腺上皮細(xì)胞以5×103個(gè)/ml的密度，混合于Matrigel凝膠中，以每孔2ml加入到12孔板中，再加入汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基2ml/孔進(jìn)行三維培養(yǎng)，并每3天更換汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基一次；每天取樣置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，Matrigel凝膠中可見(jiàn)，前9天細(xì)胞團(tuán)直徑平均每?jī)商煸鲩L(zhǎng)約一倍，每?jī)商熘g有顯著差異，但9天后增殖減慢，第11天和第13天之間無(wú)明顯差異。取第九天的細(xì)胞團(tuán)HE染色，可見(jiàn)Matrigel中有細(xì)胞，細(xì)胞呈團(tuán)塊狀分布，細(xì)胞之間互相排列成管腔樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核藍(lán)染，細(xì)胞質(zhì)紅染。細(xì)胞具有極性，圍成管腔樣結(jié)構(gòu)，周?chē)鸀閱螌优帕械耐饷诤瓜偕掀ぜ?xì)胞，中央為圓形管腔。
權(quán)利要求
1.一種人外泌汗腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于1)它由人外泌汗腺挑取、酶消化、離心純化、培養(yǎng)基配制、二維培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)和三維構(gòu)建汗腺樣管狀結(jié)構(gòu)培養(yǎng)七步過(guò)程組成；2)人外泌汗腺挑取是首先獲取健康人的皮膚切除術(shù)后皮條，并立即置于D-Hank’s液中反復(fù)沖洗3-5次，再用眼科剪剪碎后置于磷酸鹽緩沖液中重懸，然后將組織懸液置于至少20倍解剖顯微鏡下觀察，用眼科鑷直接挑取人外泌汗腺；3)酶消化是將挑取的人外泌汗腺置入體積分?jǐn)?shù)為0.01-0.8％的IV型膠原酶中，在37℃消化4-18小時(shí)，并不時(shí)搖動(dòng)，使組織消化均勻、完全；4)離心純化是將D-Hank’s液40-50ml加入到酶消化好的人外泌汗腺組織中，反復(fù)離心3-5次，每次2000-3000rpm×5min，獲得純化的人外泌汗腺上皮細(xì)胞，用0.2％臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)；5)培養(yǎng)基配制是在無(wú)血清表皮細(xì)胞培養(yǎng)基中加入5ug/L的表皮生長(zhǎng)因子和50mg/L的牛垂體提取物，獲得汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基，保存?zhèn)溆茫?)二維培養(yǎng)是將純化的人外泌汗腺上皮細(xì)胞用汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基重懸，制得人外泌汗腺上皮細(xì)胞重懸液，再加入到涂有膠原的培養(yǎng)瓶中接種，接種密度為1-100×103個(gè)細(xì)胞/cm2，蓋緊膠塞，置于37℃，5％CO2的孵箱培養(yǎng)，每3天更換汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基一次，每天取樣置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，至細(xì)胞融合度達(dá)70％～80％；7)傳代培養(yǎng)是將融合度達(dá)70％～80％的細(xì)胞每瓶加胰酶0.5ml，在37℃孵箱中消化5～10min，當(dāng)細(xì)胞變圓、細(xì)胞間隙增大時(shí)，用胰酶抑制劑終止消化，加入D-Hank’s液10ml，離心2000-3000rpm×5min，獲得的細(xì)胞再加入汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基重懸，接種于瓶底涂有膠原的培養(yǎng)瓶中，接種密度為1-20×104個(gè)/cm2，置于37℃，5％CO2孵箱中繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，每3天更換汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基一次，每天取樣置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；8)三維構(gòu)建汗腺管狀結(jié)構(gòu)培養(yǎng)是在冰浴條件下，將純化的人外泌汗腺上皮細(xì)胞以1-50×103個(gè)/ml的密度，混合于Matrigel凝膠中，以每孔2ml加入到12孔板中，再加入汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基2ml/孔進(jìn)行三維培養(yǎng)，并每3天更換汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基一次，每天取樣置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)生長(zhǎng)9天后的細(xì)胞團(tuán)取樣固定、切片、HE染色觀察管狀結(jié)構(gòu)形成情況。
專(zhuān)利摘要
一種人外泌汗腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，由人外泌汗腺挑取、酶消化、離心純化、培養(yǎng)基配制、二維培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)和三維構(gòu)建汗腺樣管狀結(jié)構(gòu)培養(yǎng)七步過(guò)程組成。本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)一是制備方法簡(jiǎn)便，技術(shù)穩(wěn)定，重復(fù)性好；二是采用膠原酶消化法獲得了單個(gè)的細(xì)胞，避免了既往的組織塊法獲得細(xì)胞量少，細(xì)胞不純的缺點(diǎn)；三是采用無(wú)血清培養(yǎng)基，避免了血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用；四是在Matrigel中進(jìn)行三維培養(yǎng)使細(xì)胞生長(zhǎng)好，增殖更快，更重要的是經(jīng)切片染色后發(fā)現(xiàn)有汗腺樣管狀結(jié)構(gòu)形成，有利于體外實(shí)驗(yàn)和研究，為體外重建汗腺奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N5/08GKCN1924009SQ200610095140
公開(kāi)日2007年3月7日 申請(qǐng)日期2006年9月20日
發(fā)明者伍津津, 雷霞, 魯元?jiǎng)? 楊亞?wèn)| 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan