專利名稱：:等溫檢測方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：該公開涉及核酸化學(xué)和分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及聯(lián)合使用酶的多元件(multi-element)多核苷酸探針在檢測生物樣品中的特定核酸序列中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：存在多種這樣的情況，其中期望檢測復(fù)雜混合物背景中的低水平的特定核酸序列。例子包括(但不限于)檢測醫(yī)學(xué)或環(huán)境病原體，或檢測特定基因的等位基因以鑒定基因異常。在所有情況下，旨在用于此目的的方法必須具有高特異性和高敏感性。優(yōu)選的方法還應(yīng)該耐用的、在應(yīng)用中相對簡單的和廉價的。使用DNA或RNA檢測，檢測體系可能是必需的，其足夠敏感來檢測單一分子(或至多一些分子)，原因在于一種靶序列可表示具有引起廣泛疾病潛力的單一傳染劑。目前不存在這樣的簡便方法，其可直接檢測特定序列的單一核酸分子，并且所有目前使用的方法都包括一個或多個放大信號的步驟。由于DNA具有制備其本身拷貝的固有能力，因此可以使用模擬細胞復(fù)制的體內(nèi)過程的靶序列的體外復(fù)制，從而擴增復(fù)雜混合物中靶多核苷酸的數(shù)量，使得它們可在具有需要的敏感度的情況下被識別。大多數(shù)DNA合成(除了短鏈DNA(例如寡核苷酸)的合成之外)通過酶法來進行，其中使用DNA聚合酶。用于實現(xiàn)該目標的最常用的方法是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR；如美國專利No.4，683，195,4,683，202和4，800，159中詳細描述)。該方法通過使用熱循環(huán)和耐熱性DNA聚合酶而提供靶分子的幾何擴增。使用高溫將兩個互補DNA鏈變性(分開)，然后使用低溫促進通過引發(fā)和通過聚合酶的鏈合成。因此，PCR合成法使用這樣的反應(yīng)來進行，所述反應(yīng)包括三個步驟，每個步驟在不連續(xù)溫度下發(fā)生。PCR產(chǎn)物的檢測可通過下列方式實時監(jiān)控TaqDNA聚合酶(具有5’_3’核酸外切酶活性)介導(dǎo)的下游寡核苷酸的降解(Gelfand，1993)，或者使用熒光嵌入染料，所述染料在結(jié)合至雙鏈DNA時發(fā)出更大強度的熒光。允許RNA靶的擴增和檢測的PCR反應(yīng)方案的改進是逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)法，其是PCR和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的組合,這在TrendsinBiotechnology,10146-152(1992)中有所描述。通常應(yīng)用于分子診斷學(xué)領(lǐng)域的PCR方法的基礎(chǔ)是其借助于擴增靶核酸而獲得期望的信號水平，進而檢測這些擴增產(chǎn)物。相反，連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)通過探針本身構(gòu)象的幾何級數(shù)增加而實現(xiàn)信號放大(Barany，1991)。在該方法中，DNA連接酶在存在靶互補鏈的情況下結(jié)合兩個寡核苷酸。所得連接的形式成為用于第二對引物的互補寡核苷酸。LCR的一個示例性應(yīng)用是在性傳播疾病Chlamydia的檢測中。其以試劑盒的形式出售(RocheCobas，RocheAmplicor板式試劑盒)。上述方法中的固有不足在于需要反應(yīng)在高溫和低溫之間反復(fù)循環(huán)_例如，在PCR的情況下在促進各輪模板變性和引物退火/延伸的溫度的循環(huán)之間循環(huán)。因此，反應(yīng)體系3使用不連續(xù)相或循環(huán)來進行，原因在于反應(yīng)受到上述溫度的限制。因此，所述方法花費更長時間來進行，因為在各相要求的時間是不清楚的，并且還因為設(shè)備需要重復(fù)改變孵育溫度。在調(diào)節(jié)溫度方面損失的時間和循環(huán)數(shù)成比例增加。另外，所述方法需要使用昂貴的可在時間內(nèi)精確地調(diào)節(jié)至較寬溫度范圍的熱循環(huán)機。其是難以小型化的專門設(shè)備，并且需要不間斷的電源供應(yīng)。因此，這些要求極大地妨礙了PCR基分子診斷在使用點測試中的應(yīng)用。針對這些限制，人們花費很多努力來開發(fā)等同于PCR的單一溫度(等溫)法。等溫法通常通過使用聚合酶而消除了部分熱循環(huán)問題，所述聚合酶同時實現(xiàn)鏈置換和鏈合成，進而除去高溫變性步驟的需要。這種等溫核酸擴增法的例子包括鏈置換擴增(SDA)法(如JP-B7-114718中所述)、和各種改進SDA法(如美國專利No.5，824，517、以及PCT國際專利申請公開WO99/0921UffO95/25180和WO99/49081中所述)。用于特定核酸擴增的其他等溫反應(yīng)包括自主序列復(fù)制(3SR)法、核酸序列基擴增(NASBA)法(如日本專利No.2650159中所述)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)法、和Q.beta.復(fù)制酶法(如日本專利No.2710159中所述)。寡核苷酸的等溫酶合成法在美國專利No.5，916，777中有所描述。在這些方法的反應(yīng)中，多核苷酸合成(通常包括從引物延伸的步驟、和/或引物退火至單鏈延伸產(chǎn)物或初始靶序列、接下來從引物延伸的步驟)在于恒溫下孵育的反應(yīng)混合物中平行發(fā)生，從而簡化了應(yīng)用并減少了反應(yīng)時間。各種方法在它們?nèi)绾谓鉀Q引物入侵的困難和常規(guī)PCR要求的退火方面存在較大的區(qū)別。在等溫核酸擴增法中，SDA法是這樣的體系的例子，其中靶DNA最后被擴增。在SDA的初始描述中，樣品中的靶核酸序列(及其互補鏈)通過使用DNA聚合酶和限制性核酸內(nèi)切酶的雙鏈置換而擴增。所述方法要求四種引物擴增，其中兩種應(yīng)該被設(shè)計成含有限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點。所述方法要求使用大量改性脫氧核糖核苷酸三磷酸酯作為大量DNA合成中的底物。這些方法中使用的改性脫氧核糖核苷酸三磷酸酯的例子是(α-S)脫氧核糖核苷酸三磷酸酯，其中α-位的磷酸酯基團的氧原子被硫原子(S)取代。(α-S)脫氧核糖核苷酸引入含有限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點的引物新合成的互補鏈中會產(chǎn)生在核酸內(nèi)切酶的裂解點處的半硫代磷酸酯。因此，限制性核酸內(nèi)切酶只攻擊未改性的鏈，從而促進攻擊位點的序列5’的延伸和攻擊位點的3’側(cè)鏈的置換。然而，如果反應(yīng)常規(guī)進行的話(例如基因測試)，和使用改性脫氧核糖核苷酸三磷酸酯有關(guān)的費用變得較高。此外，改性核苷酸(例如(α-S)脫氧核糖核苷酸)引入擴增的DNA片段中可停止使用限制性核酸內(nèi)切酶對擴增的DNA片段的裂解性，例如在經(jīng)歷限制性核酸內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)分析時就是這樣。改進SDA法(如美國專利No.5，824，517中所述)是DNA擴增法，該方法使用嵌合引物，所述嵌合引物包含RNA和DNA，并且具有基本元件結(jié)構(gòu)(其中DNA位于至少3’-末端)。美國專利No.7，056,671和美國專利申請公開No.2003/0073081涉及嵌合DNA/RNA寡核苷酸引物在SDA反應(yīng)方案中的另一種應(yīng)用。改進SDA法(如PCT國際專利申請公開WO99/09211中所述)需要使用產(chǎn)生3，突出端的限制酶。改進SDA法(如PCT國際專利申請公開WO95/25180中所述)要求使用至少兩對引物。改進SDA法(如PCT國際專利申請公開WO99/49081中所述)要求使用至少兩對引物和至少一種改性脫氧核糖核苷酸三磷酸酯。改進SDA法(如美國專利申請公開No.2005/0136417中所述)使用尿嘧啶DNA轉(zhuǎn)葡糖基酶和脫嘌呤核酸內(nèi)切酶來攻擊雙鏈DNA部分的一個鏈的作用，所述鏈在存在dUTP的條件下合成。這在已經(jīng)引入尿嘧啶的位置處有效地產(chǎn)生隨即引發(fā)位點。在該方案下，dUTP與4dTTP的比例的調(diào)節(jié)可用于調(diào)整攻擊事件的頻率。這些方法可被認為在操作上類似于PCR，只要通過靶擴增實現(xiàn)靶核酸的敏感性檢測即可。SDA的涉及DNA靶的等溫擴增的另外一種應(yīng)用是LAMP法，如PCT國際專利申請公開WO00/28082中所述。該方法采用了四引物識別6個序列以便形成一個循環(huán)結(jié)束，能夠?qū)U增中間一個鏈-沒有一個中間的攻擊步驟需要置換聚合酶。在這個原始靶序列是在不同長度concatemeric產(chǎn)品異構(gòu)混合物形式擴增計劃。該可環(huán)化擴增，或“鎖”探針等溫下的“滾環(huán)擴增條件”(RCA)的反應(yīng)計劃是另一個SDA的應(yīng)用(MolecularDiagnosis，6141-150)。通過使用與互補的圓形探針，支化產(chǎn)物序列的多重引物組成的引物通過結(jié)合到流離失所的聚合酶鏈所產(chǎn)生的。在這個“分枝”反應(yīng)計劃，對DNA產(chǎn)生量以幾何級數(shù)倍增。RCA的不同作為反應(yīng)的產(chǎn)物是一個具有DNA的序列或互補的圓形探針延伸concatameric陣列，而不是靶DNA的其他上述SDA。作者對這些例子包括商業(yè)化SDA的戰(zhàn)略，EikenChemicalCo.(Japan)提供使用LAMP技術(shù)來檢測細菌和病毒的各種病原體的診斷檢測。此外，Becton-Dickson提供沙眼衣原體和淋球菌，SDA的技術(shù)為基礎(chǔ)的一個限制性核酸內(nèi)切酶診斷的分子診斷平臺介導(dǎo)的循環(huán)策略。另一個攻擊以方便員工在等溫擴增應(yīng)用循環(huán)的方法是NationalAcademyofSciences,1004504-4509(2002)、美國專利No.7，112，423和6，884，586以及PCT國際專利申請PCT/US02/22657(公開為W003/008622)。在這種情況下，攻擊(即只有復(fù)式的核酸鏈裂解)是通過突變限制性核酸內(nèi)切酶，它能夠減少只有從最初的引物延伸步驟形成了產(chǎn)品鏈使用。在一個實施方案中，隨后各輪的攻擊，并延伸在中短寡核苷酸線性擴增的結(jié)果。在另一個實施方案中(被稱為指數(shù)擴增反應(yīng)/EXPAR)，模板的初始階段使用的引物延伸包含的引物序列串聯(lián)重復(fù)，這樣從模板鏈產(chǎn)生的產(chǎn)物能夠約束進一步模板鏈，并作為引起進一步延伸和攻擊反應(yīng)物，從而產(chǎn)生存在的寡核苷酸數(shù)量幾何級數(shù)增加。與SDA的法相反，該反應(yīng)是完成的溫度是相當(dāng)高的產(chǎn)品從攻擊反應(yīng)生成的模板鏈游離而不一的DNA聚合酶鏈置換的需要。然而，在NationalAcademyofSciences,1004504-4509(2002)的DNA聚合酶是使用具有鏈置換活動。另一個已被應(yīng)用到消滅聚合酶鏈反應(yīng)熱循環(huán)問題的方法是各種DNA的結(jié)合蛋白利用，使引物結(jié)合和延伸不熱變性的模板的DNA。解螺旋酶蛋白，在存在和單鏈結(jié)合蛋白都沒有，都被用來單獨的雙鏈的DNA鏈，使引物結(jié)合，和隨后的延伸。這種方法被命名為解螺旋酶依賴性擴增(HDA)法(美國專利申請公開號2004/0058378和2006/0154286)。重組酶蛋白也被用于其他地方，使連續(xù)幾輪的引物結(jié)合到靶雙鏈核酸(PL0SBiology,41115-1121和美國專利申請公開號2007/0054296,2005/0112631和2003/0219792)。HAD技術(shù)是市售IsoAmpIIUniversalHAD試劑盒(得自NewEnglandBiolabs(USA))的基礎(chǔ)。目前這項技術(shù)只適用于靶在70-120核苷酸長度合理范圍。另一種方法來實現(xiàn)等溫擴增的靶核酸是利用了RNA聚合酶，它能夠生成多個RNA轉(zhuǎn)錄活動給定適當(dāng)?shù)膯幼有蛄械碾p鏈DNA的模板出席。這是自主序列復(fù)制(3SR)方法，核酸序列的擴增(NASBA)法(如日本專利No.2650159中所述)，以及轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增(TMA)的法。Q0復(fù)制酶法在日本專利No.2710159也是類似的概念，但它利用的RNA聚合酶活性的Q0復(fù)制酶蛋白，有一種RNA聚合酶/鏈置換活動。雖然這些方法可以用來生產(chǎn)特定的靶5序列的多個拷貝，它們也可以用于生產(chǎn)的報道子成績單是無關(guān)的靶核酸，如NucleicAcidsResearch,2954-61(2001)中的改進方法所述。上述方法產(chǎn)生的擴增的靶，讓感興趣的核酸檢測足夠的金額。一旦有足夠靶可用，若干戰(zhàn)略可以用來產(chǎn)生一個檢測信號。在這以前，這是最常見的使用放射或免疫標記、免疫熒光標記或凝膠電泳實現(xiàn)。發(fā)展是更優(yōu)雅的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET;Kidwelll994)。熒光共振能量轉(zhuǎn)移使量子效應(yīng)，即熒光分子淬火時使用分子在接近第二個_作為淬滅劑已知的。熒光共振能量轉(zhuǎn)移的一個早期的執(zhí)行與分子信標(TyagiandKramer,1996reviewedBroude2005)。在這里，莖環(huán)型寡核苷酸所使用的地方的熒光團和淬滅劑對分子的兩端是，但帶來的堿基對，整個發(fā)夾干配對在一起。在存在特定的靶序列的條件下，莖是打亂了優(yōu)惠的堿基對和構(gòu)象變化的熒光團分離和淬滅劑，從而增加熒光。目前最常用的應(yīng)用是的TaqMan熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Livak，1998)這是一個對實時擴增增強/的蓋爾范德檢測方法。在此方法中，或俗稱的實時定量PCR，綁定，雙標記探針領(lǐng)導(dǎo)知道的是裂解由核酸外切酶活性的TaqDNA聚合酶(或同等物)期間的PCR延伸階段。這項規(guī)定限制了TaqMan熒光技術(shù)適用于非等溫擴增系統(tǒng)。等溫法使用聚合酶具有置換活動，而不是核酸外切酶活性(參見上文)。結(jié)果，這些聚合酶不會裂解的TaqMan探針，所以不會產(chǎn)生檢測信號。然而，主要利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的等溫核酸檢測的若干戰(zhàn)略已記錄在案。通常用于實時PCR檢測儀器結(jié)合常數(shù)或定期熒光熱循環(huán)監(jiān)測。在這樣的一種反應(yīng)，釋放每延伸一步一個熒光單元和該方法的主要優(yōu)點是它可用于定量。然而，這種儀器價格昂貴復(fù)雜的。這些方法的共同點是它們通過使用熒光的檢測和靶擴增組合信號是否足夠的水平。兩種不同的方法在概念上的方法體現(xiàn)了描述。第一種方法放大靶序列的擴增，然后檢測DNA和第二個使用觸發(fā)啟動的靶產(chǎn)生的事件是由獨立于擴增殘余分子靶設(shè)置離散信號序列。AnalyticalBiochemistry,333246-255(2004)以及美國專利No.4，876，187和5，011，769描述探針嵌合的DNA/RNA的應(yīng)用程序通過雜交與核酸循環(huán)探針技術(shù)檢測熒光團和淬滅劑標記的靶。這個過程通過使用RNAseH實現(xiàn)。探針與靶的結(jié)合在嵌合殘基處產(chǎn)生RNA/DNA復(fù)式結(jié)構(gòu)，其是RNAseH的底物。探針的RNA部分被RNAseH水解導(dǎo)致產(chǎn)生熒光信號，并允許探針脫離靶，從而能夠第二探針退火，并引發(fā)又一輪信號產(chǎn)生。結(jié)果是源自反應(yīng)中的探針降解(其由存在特定核酸靶催化)的線性信號放大。類似的策略也被用來作為后基因分型PCR技術(shù)戰(zhàn)略，如ClinicalChemistry,521855-1863(2006)中所述。在此反應(yīng)中，特定靶核酸序列的存在導(dǎo)致三路交界結(jié)構(gòu)(包括靶核酸、含有硫代磷酸酯_改性限制酶識別位點的寡核苷酸和報道子寡核苷酸)的形成，部分互補于限制性核酸內(nèi)切酶識別位點區(qū)域中的錨寡核苷酸，并具有熒光團和淬滅劑。報道子和錨與靶的關(guān)聯(lián)允許互補區(qū)域的結(jié)合，繼而這使限制酶識別位點雙鏈化，允許報道子寡核苷酸被合適的限制性核酸內(nèi)切酶裂解。然后裂解的報道子寡核苷酸能夠從絡(luò)合物中脫離，從而允許新報道子寡核苷酸的結(jié)合。美國專利申請公開No.2004/0101893使用脫嘌呤核酸內(nèi)切酶來裂解來自熒光探針一端的熒光報道子，這通過從兩個寡核苷酸產(chǎn)生類似脫堿基位點的結(jié)構(gòu)而實現(xiàn)，所述寡核苷酸退火靶核苷酸的臨近區(qū)域。在該方案中，探針的裂解不產(chǎn)生實質(zhì)上更短的片段，因此6不伴隨著探針從靶的解離，如本文其他反應(yīng)方案中所發(fā)生的。另一種檢測特定核酸序列存在的FRET基等溫信號放大方法在NatureProtocols,1=554-558(2006)中有所描述。這種方法使用“傳感”寡核苷酸，其在兩端形成發(fā)夾。靶核酸的存在改變了這種寡核苷酸的構(gòu)象，從而允許一端被限制酶FokI裂解。然后所得產(chǎn)物能夠催化一部分第二“燃料”寡核苷酸的消化，這將熒光團和淬滅劑分開(導(dǎo)致信號增加)，并允許該寡核苷酸結(jié)合FokI和催化另一“燃料”寡核苷酸的降解(因此傳遞反應(yīng))。兩個另外的方法涉及“可見核酸傳感”的策略，并記錄在AngewandteChemieInternationalEdition,452879-2883(2006)VXROrganicandBiomolecularChemistry,5=223-225(2007)中。在這種情況下，發(fā)光或比色反應(yīng)由存在的靶寡核苷酸引起，而不是采用FRET基體系來產(chǎn)生熒光信號。在第一種方法中，使用“分子信標”型發(fā)夾mRNA寡核苷酸(其在3’位有熒光素酶或β-半乳糖苷酶開放閱讀核酸框)、在莖部分中的核糖體結(jié)合位點、和互補于靶核酸是環(huán)部分。在存在靶時，發(fā)夾被打開，從互補鏈釋放核糖體結(jié)合位點，并允許熒光素酶基因翻譯，從而產(chǎn)生發(fā)光或比色信號。RNAseH用來在存在靶核酸的條件下降解部分發(fā)夾。該水解導(dǎo)致組成上游離的核糖體結(jié)合位點，并允許靶核酸循環(huán)。在第二種方法中，靶核酸的存在引發(fā)圓形探針的滾環(huán)擴增(RCA)反應(yīng)，所述圓形探針含有具有過氧化物酶活性的脫氧核酶的反向互補的多個拷貝。因此，靶的存在產(chǎn)生脫氧核酶的多個拷貝，其繼而催化比色反應(yīng)。雖然多種等溫核酸擴增/檢測策略已被描述，但DNA診斷領(lǐng)域占主導(dǎo)地位的仍然是聚合酶鏈式反應(yīng)。一種原因是因為多數(shù)等溫替換方案無法給出期望的靈敏性和特異性。其他方法在概念上復(fù)雜，可能需要長時間優(yōu)化，以及在某些情況下采用不易從標準來源獲得的酶。仍然需要這樣的檢測體系，其能夠在單一等溫反應(yīng)中提供信號放大和檢測，而無需靶核酸擴增。本發(fā)明的實施方案的目的是在一定程度上滿足上述一種或多種需要，或克服或改善至少一種固有或目前技術(shù)中存在的不足，或至少提供比現(xiàn)有方案更有用的選擇。發(fā)明概述所述方法發(fā)揮作用以在恒溫下在溶液中介導(dǎo)裂解的多核苷酸探針的量成幾何級數(shù)增加。該裂解由存在的特定靶核苷酸序列所引發(fā)。隨帶還實現(xiàn)探針的反向互補的片段拷貝數(shù)量的增加。因而，所述方法可用于通過監(jiān)控探針裂解或監(jiān)控反向互補多核苷酸的片段的積累而在等溫條件下檢測所述靶序列的目的。因此，在本發(fā)明的實施方案的第一方面，提供一種檢測樣品中的靶核酸的方法，該方法包括下列步驟a)提供包含單鏈靶核酸的樣品，其中所述單鏈靶核酸具有游離的3’末端；b)提供單體多核苷酸探針，包含i)至少兩個靶結(jié)合域，其中所述結(jié)合域被核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解影響的域分開，或ii)靶結(jié)合域和至少一部分所述靶核酸的拷貝，它們被核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解影響的域分開；c)使所述樣品和所述單體探針的多于一種拷貝接觸；7[0039]d)使所述樣品和使靶核酸結(jié)合至單體探針并合成單體探針的反向互補的聚合酶接觸；e)使所述樣品和至少一種核酸酶接觸以在目前復(fù)式結(jié)構(gòu)的探針中裂解所述核酸酶裂解元件或降解所述易受核酸酶降解影響的域，以及f)檢測所述探針的裂解或降解。提供另外的實施方案，其中單體探針的反向互補包含靶核酸的至少一種拷貝和靶結(jié)合域的至少一種拷貝。提供另外的實施方案，其中所述切割位點的幾何形狀為使得裂解產(chǎn)物中成對核苷酸的數(shù)量減少。提供另外的實施方案，其中所述探針的裂解或降解通過熒光法、比色法、免疫法、電泳法或雜交法來檢測。提供另外的實施方案，所述探針的裂解或降解使用納米孔道技術(shù)來檢測。下列實施方案中的任一種可適用于所述方法的任一方面。在優(yōu)選的實施方案中，所述探針的裂解或降解導(dǎo)致可檢測標記或標記產(chǎn)生的信號的改變。可選擇地，所述探針的裂解或降解允許通過任意其他方式來檢測構(gòu)象改變，例如電泳法或納米孔道技術(shù)。在任一情況下，該信號的變化或檢測到的存在構(gòu)象變化是樣品中存在靶核酸的指示。在一個實施方案中，單體探針帶有可檢測標記和一個或多個掩蔽基團，其中當(dāng)單體探針完整時，可檢測標記的信號通過掩蔽基團而減少或降低到檢測不到。換句話說，當(dāng)單體探針裂解時，可檢測標記的信號通過一個或多個掩蔽基團與標記分開而加強。在另一個實施方案中，單體探針帶有可檢測標記和另外一種或多種基團，其中當(dāng)單體探針裂解時，可檢測標記的信號通過另外的一種或多種基團而降低。在另一個實施方案中，單體探針帶有兩種或多種可檢測標記，其中當(dāng)單體探針裂解時，信號組合改變。在另一個實施方案中，單體探針被按照這種方式雙標記，該方式為探針裂解通過其他可檢測的化學(xué)方式來改變探針特性，包括(但不限于)酶標記、免疫標記、免疫熒光標記。在另一個實施方案中，單體探針的裂解通常產(chǎn)生報道子寡核苷酸而檢測，所述報道子寡核苷酸通過上述方式檢測。在另一個實施方案中，單體探針的裂解通過方法直接檢測，例如但不限于凝膠電泳法、核酸雜交法或納米孔道技術(shù)。在另一個實施方案中，反應(yīng)過程可通過監(jiān)控對應(yīng)于反應(yīng)中產(chǎn)生的探針的反向互補的片段的寡核苷酸的積累而跟蹤，并且該監(jiān)控可通過多種可選擇的方法和化學(xué)方式來實現(xiàn)。在一個實施方案中，單鏈靶核酸加入樣品中。在一個實施方案中，單鏈靶核酸在存在第二靶核酸的條件下產(chǎn)生。在一個實施方案中，靶核酸和第二靶核酸的序列是相同的。在可選擇的實施方案中，靶核酸和第二靶核酸的序列是不同的。優(yōu)選地，單鏈靶核酸通過將引物結(jié)合到第二靶核酸而產(chǎn)生。8[0058]優(yōu)選地，引物在結(jié)合至第二靶核酸時易受裂解影響。在優(yōu)選的實施方案中，靶核酸或第二靶核酸存在于待檢測或分析的生物體中，核苷酸序列是被檢測或分析的內(nèi)容的指示，其中所述內(nèi)容包括有機體、多態(tài)性或隔離或在其他序列混合物中存在的任何特定序列。在優(yōu)選的實施方案中，該樣品可包括任何生物材料，包括(但不限于)含有血液、尿液、糞便、唾液、淋巴液、土壤、水、細菌、病毒、寄生蟲、或食物的樣品。靶核酸可能是內(nèi)源性樣品(例如人血樣品中的人類基因組DNA)或外源性樣品(例如血液、土壤、水或食物樣品中的細菌或病毒DNA)。在一個實施方案中，靶結(jié)合域包含至少部分靶核酸序列的反向互補。應(yīng)該理解，只要方法中發(fā)生反應(yīng)，所述方法就包括a)提供包含單鏈靶核酸分子的樣品，其中所述單鏈靶核酸分子包含靶核酸序列，靶核酸分子具有游離的3’末端或裂解位點，使得當(dāng)在步驟(b)中接觸探針時，核酸可被核酸內(nèi)切酶裂解以產(chǎn)生游離的3’末端，b)提供單體多核苷酸探針，包含i)至少兩個靶結(jié)合域，其中所述結(jié)合域被核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解影響的域分開，或ii)靶結(jié)合域和至少一部分所述靶核酸的拷貝，它們被核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解影響的域分開；c)使所述樣品和所述單體探針的多于一種拷貝接觸，使得靶結(jié)合域結(jié)合單鏈靶核酸序列，d)使樣品和聚合酶接觸，所述聚合酶結(jié)合與單體探針結(jié)合的靶核酸分子，從而從靶核酸分子的3’端合成單體探針的反向互補，e)使樣品和至少一種核酸酶接觸以在目前復(fù)式結(jié)構(gòu)的探針中裂解核酸酶裂解元件或降解易受核酸酶降解影響的域，其中單體探針和合成的反向互補被分開以暴露靶結(jié)合域的至少兩個拷貝和靶核酸序列的至少兩個拷貝，f)使靶結(jié)合域結(jié)合靶核酸序列，g)保持樣品以允許重復(fù)步驟d)和e)，從而暴露靶結(jié)合域和靶核酸序列另外的拷貝，并根據(jù)需要重復(fù)步驟f)和g)以產(chǎn)生可檢測的信號，h)通過該過程連續(xù)地或該過程結(jié)束后測量或檢測裂解。應(yīng)該理解，取決于上述段落b)中指定的探針的設(shè)計，步驟e)暴露裂解的單體探針的靶結(jié)合域的至少兩個拷貝和裂解的單體探針的反向互補的靶核酸序列的至少兩個拷貝(例如參見圖1)，或可選擇地，步驟e)暴露靶結(jié)合域的一個拷貝和裂解的單體探針的內(nèi)源性靶的一個拷貝(例如參見圖6)。在各種實施方案中，步驟a)至h)依次或同時進行。明顯的是，核酸酶裂解元件的裂解或所述域易受降解的影響導(dǎo)致探針的構(gòu)象改變，這可通過多種方法來檢測。在一個實施方案中，核酸酶裂解元件包含限制性核酸內(nèi)切酶識別位點的一個鏈(單體核酸序列組分)，并且核酸酶是限制性核酸內(nèi)切酶。在另一個實施方案中，核酸酶裂解元件含有兩個限制性核酸內(nèi)切酶識別位點的一個鏈(單體核酸序列組分)，核酸酶是一種或多種限制性核酸內(nèi)切酶。更優(yōu)選地，一個或多9個識別位點位于靶結(jié)合域和核酸酶裂解域的一個或兩個結(jié)合處。更優(yōu)選地，限制性核酸內(nèi)切酶切割位點懸垂布置為降低裂解的多核苷酸的熔融溫度，使得兩個鏈的分解率增強。在另一個方面，提供增加樣品中靶核酸的拷貝數(shù)量的方法，該方法包括下列步驟a)提供包含單鏈靶核酸的樣品，其中所述單鏈靶核酸分子具有游離的3’末端，b)提供上述單體多核苷酸探針，c)使樣品和單體探針接觸，使得靶結(jié)合域結(jié)合單鏈靶核酸序列，d)使樣品和聚合酶接觸，所述聚合酶結(jié)合與單體探針結(jié)合的靶核酸分子，從而從靶核酸分子的3’末端合成單體探針的反向互補，e)使樣品和至少一種核酸酶接觸以在目前復(fù)式結(jié)構(gòu)的探針中裂解核酸酶裂解元件或降解易受核酸酶降解影響的域，f)保持樣品以允許重復(fù)步驟d)和e)，暴露靶結(jié)合域和靶核酸序列另外的拷貝，從而暴露所需量的靶核酸序列。在一個實施方案中，單體探針是圓形的。在另一個實施方案中，單體探針是線性的。優(yōu)選地，一個靶結(jié)合域位于5’末端或3’末端，更優(yōu)選一個靶結(jié)合域位于5’末端，并且一個靶結(jié)合域位于3’末端。在一個實施方案中，核酸酶裂解元件是限制性核酸內(nèi)切酶識別位點的一個鏈(單體核酸序列組分)，從而當(dāng)結(jié)合至其互補部分時，核酸酶裂解元件形成限制性核酸內(nèi)切酶識別位點。在一個實施方案中，當(dāng)所述靶核酸是DNA時，所述核酸酶裂解元件含有RNA。在一個實施方案中，可檢測標記是熒光團，所述掩蔽基團是當(dāng)在相當(dāng)接近時能淬滅熒光團熒光的淬滅劑。在其他實施方案中，可檢測標記使用免疫標記、免疫熒光標記或凝膠電泳，盡管明顯的是可以使用任何用于檢測裂解的方法。在其他實施方案中，裂解利用接方法檢測，例如凝膠電泳或納米孔道技術(shù)、或任何能夠可視化這種分子改變的方法。在特別優(yōu)選的實施方案中，該方法提供了單體多核苷酸探針，含有至少兩個靶結(jié)合域，它們被核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解影響的域分開，單體探針帶有熒光團和淬滅劑。優(yōu)選地，所述熒光團的位置5’是裂解元件或易受核酸酶降解影響的域，淬滅劑的位置3'是裂解元件或易受核酸酶降解影響的域，或反之亦然。在另一個方面，提供用于檢測樣品中的靶核酸的方法，該方法包括下列步驟a)提供包含單鏈靶核酸的樣品，其中所述單鏈靶核酸分子具有游離的3’末端，b)提供上述單體多核苷酸探針，c)使所述樣品和所述單體探針的多于一種拷貝接觸，d)使樣品和聚合酶接觸，所述聚合酶結(jié)合與單體探針結(jié)合的靶核酸分子，聚合酶能夠從靶核酸分子的3’末端合成單體探針的反向互補，反向互補含有靶序列域的至少一種拷貝和靶結(jié)合域的至少一種拷貝，e)使樣品和至少一種核酸酶接觸以裂解核酸酶裂解元件或降解易受核酸酶降解影響的域，以及f)通過該過程連續(xù)地或該過程結(jié)束后測量或檢測裂解。優(yōu)選地，靶結(jié)合域含有至少部分靶核酸序列的反向互補。靶序列域包含至少部分靶核酸序列。在另一個方面，提供增加樣品中靶核酸的拷貝數(shù)量的方法，該方法包括下列步驟a)提供包含單鏈靶核酸的樣品，其中所述單鏈靶核酸分子具有游離的3’末端，b)提供單體多核苷酸探針，其含有至少一個靶結(jié)合域，所述靶結(jié)合域被核酸酶裂解元件或至少一個靶序列域的易受核酸酶降解影響的域分開，單體探針帶有可檢測標記和掩蔽基團，其中當(dāng)單體探針完整時，可檢測標記的信號通過掩蔽基團而減少或降低到檢測不到，c)使樣品和單體探針接觸，使得靶結(jié)合域結(jié)合單鏈靶核酸序列，d)使樣品和聚合酶接觸，所述聚合酶結(jié)合與單體探針結(jié)合的靶核酸分子，從而從靶核酸分子的3’末端合成單體探針的反向互補，反向互補含有靶序列域的至少一種拷貝和靶結(jié)合域的至少一種拷貝，e)使樣品和至少一種核酸酶接觸以裂解核酸酶裂解元件或降解易受核酸酶降解影響的域，f)保持樣品以允許重復(fù)步驟d)和e)，暴露靶結(jié)合域和靶核酸序列另外的拷貝，從而暴露所需量的靶核酸序列。在又一方面，所述方法提供單體多核苷酸探針，含有至少一個靶結(jié)合域，其被核酸酶裂解元件或至少一個靶序列域的易受核酸酶降解影響的域分開，單體探針帶有可檢測標記和掩蔽基團。在另一個方面，所述方法提供上述單體多核苷酸探針在檢測靶核酸中的應(yīng)用。在又一方面，本發(fā)明的方法提供組合物，其含有探針以及一種或多種添加劑、緩沖劑、賦形劑或穩(wěn)定劑。優(yōu)選地，所述組合物還含有一種或多種下列物質(zhì)，包括核酸酶；核酸外切酶；具有鏈置換活性的聚合酶；活化或增強核酸酶活性的化合物、輔助因子或輔酶；活化或增強核酸外切酶活性的化合物、輔助因子或輔酶；活化或增強聚合酶活性的底物、化合物、輔助因子或輔酶。在另一個方面，本發(fā)明的方法提供用于檢測樣品中的靶核酸的試劑盒，所述試劑盒含有一定量的單體探針、一定量的核酸酶和一定量的鏈分開活性劑、以及使探針、核酸酶和鏈分開活性劑與樣品接觸的說明書。在一個實施方案中，試劑盒還含有引物，優(yōu)選地引物是本文所述的二聚物寡核苷酸引物。在這方面的資料參考規(guī)范的地方已經(jīng)取得了書，其他外部文件，或其他來源，這是一般方法為目的，提供一個功能的范圍內(nèi)討論。除非特別說明，否則這種外部參11或資料，例如來源管轄權(quán)，任何現(xiàn)有技術(shù)或技術(shù)形式的一部分，在共同的一般知識。附圖簡要說明可參照附圖，其中圖1是示出未標記的TandemRepeat限制酶促進的(TR-REF)探針和示例性限制性核酸內(nèi)切酶位點的主要元件的圖。使用該探針的方法依靠至少一種限制性核酸內(nèi)切酶和聚合酶來催化反應(yīng)。示出鏈式反應(yīng)的單獨嵌入步驟。圖2是示出標記的TandemRepeat限制酶促進的(TR-REF)探針和示例性限制性核酸內(nèi)切酶位點的主要元件的圖。使用該探針的方法依靠至少一種限制性核酸內(nèi)切酶和聚合酶來催化反應(yīng)。示出鏈式反應(yīng)的單獨嵌入步驟。圖3是示出示例性TandemRepeat限制酶促進的(TR-REF)探針的序列分布和在反應(yīng)過程中由靶核酸產(chǎn)生的反向互補序列。圖4是示出在實施例1中所述的TR-REF反應(yīng)中FAM熒光信號的產(chǎn)生對時間的圖。圖5是示出在存在外源性人基因組DNA的條件下在實施例1中所述的TR-REF反應(yīng)中FAM熒光信號的產(chǎn)生對時間的圖。圖6是示出未標記的Inverted反向互補限制酶Facilitated(IRC-REF)探針的主要元件的圖。使用該探針的方法依靠至少一種限制性核酸內(nèi)切酶和聚合酶來催化反應(yīng)。示出鏈式反應(yīng)的單獨嵌入步驟。圖7是示出標記的Inverted反向互補限制酶Facilitated(IRC-REF)探針的主要元件的圖。使用該探針的方法依靠至少一種限制性核酸內(nèi)切酶和聚合酶來催化反應(yīng)。示出鏈式反應(yīng)的單獨嵌入步驟。雖然方法大致如上所述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員明白所述方法不限于此，并且還包括下列給出例子的實施方案。發(fā)明詳述如上所述，在一個方面，本發(fā)明的方法涉及檢測靶核酸的等溫檢測法，其中所述方法依靠來自與核酸探針結(jié)合的可檢測標記的信號的靶核酸依賴性放大。此處，信號放大是由于存在靶核酸而發(fā)生的?？偠灾?，信號放大通過使用單體標記的探針而實現(xiàn)，至少一部分探針能夠與靶核酸雜交。這在本文中稱為靶結(jié)合區(qū)域或靶結(jié)合域。探針和靶核酸序列的雜交形成能引起單體探針的反向互補合成的復(fù)式結(jié)構(gòu)，繼而產(chǎn)生能夠被核酸酶裂解的核酸酶裂解元件。核酸酶裂解元件最終導(dǎo)致可檢測標記從掩蔽基團分開，所述掩蔽基團能夠使來自可檢測標記的信號降低或不可檢測。在一些實施方案中，裂解元件的裂解最終也揭示探針內(nèi)存在的至少一種額外靶核酸序列或合成的反向互補，其本身能夠和另外的探針分子雜交，從而導(dǎo)致形成另外的探針靶核酸序列復(fù)式結(jié)構(gòu)。這些另外的復(fù)式結(jié)構(gòu)中的每一個都能夠引起含有核酸酶裂解元件(其能夠被核酸酶裂解)反向互補的合成。再次，裂解導(dǎo)致標記進一步從掩蔽基團分開，信號發(fā)射，進一步暴露另外的探針分子內(nèi)存在的靶核酸序列等，使得實現(xiàn)信號的幾何級別增加。從根本上以后，靶核酸可以被看作是信號催化劑的分離標記和掩蔽基團及相應(yīng)的12排放。在一個實施方案中，方法的探針包含能夠核酸結(jié)合的序列的至少兩個拷貝，優(yōu)選至少一部分靶核酸序列的反向互補。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，當(dāng)用作合成模板時，這樣產(chǎn)生的反向互補包括至少一部分靶核酸序列，或能夠與靶結(jié)合域結(jié)合的序列。該優(yōu)選的實施方案在本文中稱為TandemRepeat限制酶促進的(TR-REF)鏈式反應(yīng)，并在實施例1中詳細描述。在另一個實施方案中，方法的探針包含靶核酸序列或能夠雜交探針的靶-結(jié)合區(qū)域的序列的一個或多個拷貝，其以下也稱為固有靶。當(dāng)探針是完整的時，這些固有靶不能引起引物延伸，并且只對核酸酶裂解的裂解或易受降解影響的域的降解可以這樣做。在一個實施方案中，使用至少一種限制性核酸內(nèi)切酶。第二優(yōu)選的實施方案在本文中稱為Inverted反向互補限制酶促進的(IRC-REF)鏈式反應(yīng)，并在實施例2中詳細描述。在由于存在待檢測的靶核酸(其可被認為是“外在”靶序列以將其和IRC-REF探針或IRC-REF探針的反向互補中存在的固有拷貝相區(qū)別)而被引發(fā)后，單體探針的反向互補的合成在核酸酶裂解域中產(chǎn)生至少一種核酸酶位點(例如限制性核酸內(nèi)切酶位點)，或使所述域易于受到降解影響。通過設(shè)計單體探針以含有固有靶或其反向互補的至少兩個拷貝，在每次反復(fù)反應(yīng)時都可以實現(xiàn)信號的幾何級別擴大(兩倍或三倍)。鏈式反應(yīng)的引發(fā)可概念化為靶的形成探針靶_結(jié)合域的和靶DNA之間探針雜交，從而產(chǎn)生引物以通過聚合酶延伸。在各種實施方案中，導(dǎo)致可檢測信號的構(gòu)象變化可由于核酸酶活性的裂解事件而直接發(fā)生，或由于(例如)能夠被裂解事件裂解的單體探針的變性而間接發(fā)生。例如，這種間接分離可包括部分探針通過核酸外切酶的外核降解。無論分離是直接或間接，其將主要是裂解元件的相對位置、掩蔽基團和探針內(nèi)標記的函數(shù)。在優(yōu)選的實施方案中，超過一種限制性核酸內(nèi)切酶位點被安排在裂解元件內(nèi)，使得裂解導(dǎo)致裂解產(chǎn)物的成對區(qū)域縮短，并因此降低其熔點溫度(Tm)，從而協(xié)助單鏈多核苷酸的再生，所述單鏈多核苷酸然后可用于下一循環(huán)。在其他實施方案中，裂解可導(dǎo)致產(chǎn)生報道子寡核苷酸，其可不依賴于單體探針通過各種方式來檢測。靶DNA在檢測前應(yīng)該是單鏈，從而應(yīng)主要保護避免受到存在任何核酸酶的作用。然而，在靶染色體其他位點上的核酸內(nèi)切酶活性不損害該方法。核酸外切酶活性可通過靶側(cè)翼的互補PNA阻斷劑而最小化。PNA的這種方式的使用具有雙重功能，因為已知PNA會導(dǎo)致復(fù)式結(jié)構(gòu)DNA的鏈的入侵，從而產(chǎn)生和穩(wěn)定DNA的單鏈區(qū)域(Pefferetal，1993)。使用本發(fā)明的方法的線性探針，在一些實施方案中阻斷劑可用于抑制核酸外切酶活性或未引發(fā)的探針上的其他降解。這些可以是DNA的任何修飾形式，包括氨基酸連接、硫醇連接、3'-3'連接、5'-5'連接、核苷酸類似物、間隔劑或5'或3'端修飾(包括去磷酸化)。此外，末端可以被修飾的DNA的短互補鏈阻斷或被結(jié)合蛋白阻斷。當(dāng)然應(yīng)意識到，用于延伸的末端不應(yīng)以任何抑制聚合酶活性的方法阻斷。因此，在第一方面，提供一種檢測樣品中的靶核酸的方法，該方法包括下列步驟a)提供包含單鏈靶核酸的樣品，其中所述單鏈靶核酸分子具有游離的3’末端，b)提供單體多核苷酸探針，其含有至少兩個靶結(jié)合域，所述靶結(jié)合域被核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解影響的域分開，單體探針帶有可檢測標記和掩蔽基團，其中當(dāng)單體探針完整時，可檢測標記的信號通過掩蔽基團而減少或降低到檢測不到，c)使所述樣品和所述單體探針的多于一種拷貝接觸，d)使樣品和聚合酶接觸，e)使樣品和至少一種核酸酶接觸，以裂解核酸酶裂解元件或降解易受核酸酶降解影響的域，f)檢測或測定可檢測標記的信號，其中信號增加表示樣品中存在靶核酸。更具體地，檢測樣品中靶核酸的方法包括下列步驟a)提供包含單鏈靶核酸的樣品，其中所述單鏈靶核酸分子具有游離的3’末端，b)提供單體多核苷酸探針，其含有至少兩個靶結(jié)合域，所述靶結(jié)合域被核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解影響的域分開，c)使所述樣品和所述單體探針的多于一種拷貝接觸，使得靶結(jié)合域結(jié)合單鏈靶核酸序列，d)使樣品和聚合酶接觸，所述聚合酶結(jié)合與單體探針結(jié)合的靶核酸分子，從而從靶核酸分子的3’末端合成單體探針的反向互補，反向互補含有靶序列域的至少兩種拷貝，e)使樣品和至少一種核酸酶接觸，以裂解核酸酶裂解元件或降解易受核酸酶降解影響的域，f)通過該過程連續(xù)地或該過程結(jié)束后測量或檢測裂解。其中信號增加表示樣品中存在靶核酸。在另一個方面，本發(fā)明的方法提供檢測樣品中的靶核酸，該方法包括下列步驟a)提供包含單鏈靶核酸的樣品，其中所述單鏈靶核酸分子具有5’或3’末端，b)提供單體多核苷酸探針，其含有至少一個靶結(jié)合域，所述靶結(jié)合域被核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解影響的域從至少一個靶序列域分開，c)使所述樣品和所述單體探針的多于一種拷貝接觸，d)使樣品和聚合酶接觸，所述聚合酶結(jié)合與單體探針結(jié)合的靶核酸分子，聚合酶能夠從靶核酸分子的3’末端合成單體探針的反向互補，反向互補含有靶序列域的至少一種拷貝和靶結(jié)合域的至少一種拷貝，e)使樣品和至少一種核酸酶接觸以裂解核酸酶裂解元件或降解易受核酸酶降解影響的域，以及f)通過該過程連續(xù)地或該過程結(jié)束后測量或檢測裂解。其中信號增加表示樣品中存在靶核酸。在一個實施方案中，熒光團和淬滅劑包括在分子中以能夠進行FRET-基檢測(Livaketal，1998)。這些元件可置于多種可能位置處，只要所述兩種物質(zhì)由于核酸內(nèi)切酶的作用而彼此分開?？蛇x擇地，可用其他標記系統(tǒng)，例如免疫標記、免疫熒光標記，或可選擇地通過凝膠電泳或納米孔道技術(shù)可直接檢測探針的裂解。該方法識別靶序列或、靶結(jié)合序列、或兩者的額外拷貝可使用聚合酶生成其中單鏈靶核苷酸是延伸引物，單體探針的核酸分子是模板。在這里，在靶序列結(jié)合和/或核酸酶裂解區(qū)域裂解或降解后，分子的其余的5'片段可雜交第二單體探針，并引發(fā)單體探針的反向互補的合成。通過適當(dāng)?shù)呐渲媚０宸肿拥男蛄?，聚合酶產(chǎn)生的反向互補可包含一個或多個靶序列的額外拷貝，從而使更多的引物分子結(jié)合，并引發(fā)進一步的聚合反應(yīng)，或一個或多個靶結(jié)合序列的拷貝，或兩者。使用的聚合酶將是一種能夠再生核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解影響的區(qū)域，從而使探針接觸的靶序列，或靶結(jié)合序列，或兩者兼而有之，這取決于單體的配置。例如，核酸酶裂解元件易受RNAseH裂解，可對DNA的RNA聚合酶再生或修改，以納入核糖核酸聚合酶基團。在這樣的實施方案，同樣的核酸酶可催化核酸分子初始裂解第一靶序列，以及元件裂解的核酸酶裂解后形成的合成第二核酸分子的反向互補。合成的互補的反向最終導(dǎo)致模板裂解的單體探針反向互補全雙工的裂解分離分子的序列上曝光更多拷貝的靶，在一個或靶結(jié)合序列，或者兩者兼而有之。例如，在不同的實施方案中，該方法包括聯(lián)系核酸酶的樣品與一秒鐘裂解或降低核酸酶裂解元件時，單體探針必將其反向互補。核酸應(yīng)意識到的使用酶可以方便地讓元件使用第二個限制性核酸內(nèi)切酶位點在裂解邊界的核酸酶能需要由于核苷酸序列的要求。在優(yōu)選的實施方案中，單體探針帶有可檢測標記。最好的標記信號的可檢測是減少或無法檢測時提供足夠接近掩蔽基團，和單體探針帶有掩蔽基團標記能夠減少或使無法察覺的信號時，在充分的接近到可檢測標記。在這個實施方案，當(dāng)單體探針是完整的可檢測標記和掩蔽基團在足夠接近的掩蔽基團會減少或者呈現(xiàn)無法察覺的標記信號的可檢測。該元件裂解的核酸酶裂解導(dǎo)致基分離的可檢測標記和掩蔽基團足以減少或防止團掩蔽的掩蔽基的信號。優(yōu)選地，該序列的步驟檢測靶核酸是由檢測或測定的增加，該標記的信號相比，信號其中的，完整的單體探針的檢測或測定團分離的標記和掩蔽基增加信號是指示性的存在上述靶核酸的樣品。在另一個實施方案中，該序列的步驟檢測核酸的數(shù)額的靶是向一個額外步驟接觸它的反向互補雜交與第二探針的檢測序列存在于單體探針或檢測順序，第二探針含有可檢測標記。在第二探針也稱為此處為“報道子”探針。在一個實施方案中，檢測探針序列存在于單體是會產(chǎn)生反向互補序列的能夠綁定到一個模板探針檢測，其中合成核酸序列使用這種檢測能夠作為核酸綁定到一個檢測探針。在這個實施方案，步驟的序列檢測核酸的數(shù)量是由合成的靶序列的反向互補，檢測的，并聯(lián)系了一個第二反向互補序列與檢測探針的雜交，以檢測序列反向互補。優(yōu)選地，在第二探針它還包含掩蔽基團的減少或者呈現(xiàn)無法察覺的標記信號的可檢測時，第二探針不綁定到探測序列，其中的探針結(jié)合的第二對檢測順序?qū)е禄蛛x的可檢測標記和掩蔽基團足以減少或防止團掩蔽的掩蔽基的信號，其中一個標記增加檢測的信號是在可指示在場的說第二探針靶核酸的樣品。更優(yōu)選的是此處所述單鏈RMD探針。優(yōu)選地，方法包括額外步驟h-i)使樣品和第二探針接觸，所述第二探針結(jié)合檢測序列，所述第二探針帶有可檢測標記，i-ii)檢測或測定可檢測標記的信號，其中信號增加表示樣品中存在靶核酸。[0186]優(yōu)選地，第二探針是單鏈RNA探針，其含有熒光團、淬滅劑和檢測序列結(jié)合域，更優(yōu)選第二探針是本文所述RMD探針。在一個實施方案中，核酸酶裂解元件包含限制性核酸內(nèi)切酶識別位點的單鏈(單體核酸序列組分)，第一核酸酶是限制性核酸內(nèi)切酶。在一個實施方案中，核酸酶裂解元件含有RNA，第一核酸酶是RNAase，更優(yōu)選地是RNAseH。本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是在各種實施方案中，該方法的步驟，有秩序進行的任何順序或同時進行。在鏈式反應(yīng)和信號放大時，才觸發(fā)反應(yīng)部件-靶核酸的單體探針，至少一種核酸酶，而聚合酶_都存在。在一個實施方案中，可能的靶核酸聯(lián)絡(luò)與聚合酶的組成包含單體探針對至少一種核酸酶。有利地，這最大限度地減少封閉系統(tǒng)引入污染的機會時，一個方法是進行研究。應(yīng)意識到的方法可以進行定性或定量分析。例如，該方法可以使一個二進制(是/否的樣品)指示一個或多個物種是否靶在核酸存在。在另一個例子，說明可能是半定量，例如，提供三個層次的信號_高，低和無信號。根據(jù)不同的標記，這些級別可以例如是色調(diào)相同，其中一個深色陰影表示高度中等色調(diào)的靶核酸，表示一個靶核酸水平低，與淺色或無色顯示沒有靶核酸目前。該方法也為PCR方法定量分析靶實時核酸，例如通過測量，包括實時的測量，生產(chǎn)的信號的方式類似于。一個例子的靶核酸定量測量等，提出了在這里的例子(見圖2)。明顯的是在單體探針，當(dāng)所使用的引物和/或檢測探針，最好是目前靶核酸序列的摩爾過多的被檢測到。在大多數(shù)實施方案的將得到優(yōu)先考慮有限制的探針在非本不是限速過剩量，使摩爾濃度或探針。然而，在一些實施方案中可能都認為，在數(shù)量或濃度是一個或兩個探針或本引物速率限制，例如在需要的情況下一個定性的結(jié)果。適當(dāng)?shù)姆椒▉碛嬎?第適量探針)或引物獲得的等額或條件濃度靶核酸或其他反應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。術(shù)語“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”和等價物其中可能包括作為此處使用的單一或雙鏈脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸長度的聚合物，也可能包括作為非限制的例子，編碼和非編碼序列的核酶基因，正義和反義序列，外顯子，內(nèi)含子，基因組DNA，基因，mRNA前體，mRNA和rRNA基因，小干擾RNA，miRNA的，tRNA基因，重組多核苷酸，分離和純化天然DNA或RNA序列，合成RNA和DNA序列，核酸探針，引物，片段，基因結(jié)構(gòu)，載體和修改多核苷酸。沒有任何區(qū)別的條款，長度打算“核酸“，”寡核苷酸“和”多核苷酸“，這些條款將被交替使用。術(shù)語“靶區(qū)域”，“靶序列”，“靶核酸”，“靶核酸序列”，“靶多核苷酸”和“靶多核苷酸序列”和語法及其等值，可指一個地區(qū)是其中的一個核酸被檢測到。因此，本文中使用的術(shù)語“靶核酸”或“靶核酸序列”包括的靶核酸被檢測到，例如，目前在樣品或者物存在于一個引所述外，并在拷貝的靶核酸序列或一本內(nèi)所產(chǎn)生的探針第例如，拷貝的至少一種反向互補的例子，該單體探針是包括合成的聚合酶以下約束力的單體探針靶核酸序列。術(shù)語“第二靶核酸”或“第二靶核酸序列，，這里所用的同樣可以包含一個核苷酸序列被發(fā)現(xiàn)，并且這個序列可能是相同或不同的“靶核酸”。優(yōu)選地，將靶核酸單鏈的對外債務(wù)，從而促進靶探針雜交形成。方法使靶核酸單鏈不但有著名的藝術(shù)，將最常見的是雙鏈核酸熱變性的影響?；瘜W(xué)劑，防止或減少對形成良好的堿基也是最先進的核酸已知的使用呈現(xiàn)單鏈版。這將是明顯的熟練技工，這些人員必須謹慎使用的方法，這些方法都依賴于雜交形成的，例如，通過雜交靶探頭。它也將是被理解的存在，一些核酸擁有“鏈侵略”性質(zhì)，無論這種入侵的互補鏈置換的結(jié)果核酸鏈的靶和靶形成探針全雙工，或靶形成探針三重靶，第一次是沒有序列的單鏈版。肽核酸(美國國家科學(xué)院院刊)及其衍生物可能是核酸鏈入侵的能力，即含有靶探針結(jié)合區(qū)域包括巴民族權(quán)力機構(gòu)可以用來檢測靶核酸還沒有提供充分的單鏈版。使用的靶-結(jié)合區(qū)域包括巴民族權(quán)力機構(gòu)是特別有助于模板版的圓形探針，其中，前形成的靶探針雜交，在靶的_結(jié)合區(qū)域探針可能大幅雙鏈。所謂“探針”，可指一個多核苷酸檢測用在雜交為基礎(chǔ)，以檢測靶多核苷酸序列是互補，以至少探針部分。該探針可包括靶結(jié)合域的雜交，以一序列的靶核酸地區(qū)。在各種實施方案中，本發(fā)明的方法是標記探針與領(lǐng)導(dǎo)，即必然，可檢測標記，以便檢測。該探針可以組成一個“片段多”所界定的核苷酸此處?！跋鄳?yīng)”，可指一個核酸是相同或核酸雜交能夠向指定的反向互補的。本文使用的術(shù)語的“暴露”，“暴露”，“揭露”，以及“發(fā)現(xiàn)”及其語法等同可能意味著該元素(被使用過)這些方面的條件是/是訪問或/呈現(xiàn)訪問。例如，元件暴露了核酸酶裂解可能表明核酸酶裂解元件呈現(xiàn)訪問裂解由核酸酶。又如檢測序列，曝光的可能暗示，該檢測序列呈現(xiàn)例如簡易的檢測，獲得用于綁定到一個檢測探針。相反，條款“隱藏”或“掩蓋”，其語法等同可能意味著該元素(被使用過)這些方面的條件是/是不可訪問。例如，一個檢測序列可能被隱藏或屏蔽時勢必核酸分子探針探測除外。術(shù)語“雜交”和語法等值可參考互補形成一個多聚結(jié)構(gòu)，通常一個復(fù)式結(jié)構(gòu)的全面，由綁定之間的兩個或更多的單鏈核酸之正當(dāng)基礎(chǔ)，以互補配對。雜交可能發(fā)生核酸鏈之間或核酸鏈包含錯配的小區(qū)域。兩個單鏈核酸的是不匹配的互補，除了輕微的地區(qū)被稱為大幅互補。互補序列的穩(wěn)定雙鏈大幅下可以實現(xiàn)較寬松的雜交條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員的核酸技術(shù)可以憑經(jīng)驗判斷雙工穩(wěn)定考慮離子強度的變數(shù)，包括數(shù)字，例如，長度核苷酸和堿基對濃度的多以及對不匹配的發(fā)病基礎(chǔ)。雜交條件的可以進行適當(dāng)修訂，例如只允許那些單鏈的互補程度高的地區(qū)，足以與雜交。高度互補嚴格的條件為雜交核酸是此處所述。由于此處使用的“復(fù)式形成區(qū)域”是指核酸序列或現(xiàn)在在一個多核苷酸是充分互補，以核酸多序列，以目前在另一個核苷酸多讓雜交的核苷酸，特別是組模板選更多的地區(qū)目前在核酸分子包含二聚物引物的方法的二聚物形成雙鏈區(qū)域的完整。由于此處使用的“靶_結(jié)合域”，其相當(dāng)于“靶結(jié)合域”是指核酸序列和目前在核酸分子是充分互補，以核酸靶序列的核酸存在于允許的雜交的靶-結(jié)合區(qū)域的靶核酸等，形成一個靶探針雜交。由于此處使用的“核酸酶裂解元件”是指核酸序列探針在一本核酸分子，構(gòu)成了一個地區(qū)的行動延伸受裂解由核酸酶雜交時與靶核酸序列或序列所對應(yīng)的靶核酸?？蛇x擇地的“核酸酶裂解雙鏈元件”提供可能由一種DNA聚合酶。優(yōu)選地，一個或多個裂解元探針目前在顯著不易被裂解的因素，仍然只要任何一方單鏈不被綁定到靶核酸，或者未將變得雙鏈版由一種DNA聚合酶。更優(yōu)選地，存在任何裂解元件靶的探針結(jié)合區(qū)域的不容易裂解只要探針不一定靶核酸，或在第一和第二核酸分子探針是完整的探針的雜交。由于此處使用，核酸酶可包括分子，化合物，或酶，酶的專一性最好能夠選擇性切割核酸。優(yōu)選地，該核酸酶裂解高選擇性地將特定核酸序列。首選核酸酶將裂解都核酸鏈的雙鏈。核酸內(nèi)切酶是優(yōu)選的核酸酶的例子。許多核酸內(nèi)切酶，包括限制性核酸內(nèi)切酶，存在并受到良好的藝術(shù)特點和已知的。任何特定網(wǎng)站核酸內(nèi)切酶可用于的方法，并且可以根據(jù)選擇與探針設(shè)計的。如上所述，這可能是核酸序列測定靶的。不過，首選核酸內(nèi)切酶將有減少識別位點的頻率，盡量減少片段核酸款的靶，例如染色體上的靶核酸序列的謊言。核酸的酶的選擇將取決于檢測到的核酸是由提供適當(dāng)?shù)臐撛诘陌行蛄械牡貐^(qū)內(nèi)。在本例子中描述的限制性核酸內(nèi)切酶所用的BsmAI,MwoI,BsaXI，BsiHKAI，BsoBI，但應(yīng)意識到其他核酸內(nèi)切酶可用于取決于反應(yīng)溫度和所需的幾何形狀的切割位點。所謂“聚合酶”這里所用的可能是指任何活動，能夠合成了一個模板反向互補的核酸分子。許多例子聚合酶，最好的DNA聚合酶，合適的使用方法在本發(fā)明是已知的。首選的例子包括Taq酶聚合酶和斯托費爾片段為單位。DNA的聚合酶我和偶合片段。靶核酸的檢測方法是測定依賴于檢測或信號從一個標記，最好是一個發(fā)光的探針標記導(dǎo)致了發(fā)光標記。術(shù)語“標記”，因為此處使用的，可以指任何原子，分子，化合物或基團，可連接到核酸，而且可以使用，也可以提供檢測信號或標記互動與第二修改探測信號標記提供的第二位。首選標記是或發(fā)光化合物的化學(xué)發(fā)光，產(chǎn)生熒光信號檢測。還有更多的首選標記是發(fā)光化合物對信號是減少或無法檢測時提供足夠接近掩蔽基團，例如，淬火生色。替代標記系統(tǒng)也可以用于矩陣裂解，演示了標記固體從基團可以綁定到。例子是生物素標記，可以綁定到固定化親和，因此非探針裂解隨之而來的將綁定標記的探針的另一端中學(xué)目前在。這種方法將檢測試紙申請為基礎(chǔ)的。然而，更多的檢測系統(tǒng)可以使用技術(shù)標記，可以區(qū)分的納米孑L道。該方法適用于探針檢測的標記率領(lǐng)單一的，雖然多個標記可受聘。探針檢測時發(fā)生的裂解的標記，例如熒光團，有足夠的團刪除從掩蔽基，例如變性過程中的裂解事件淬滅齊U，經(jīng)裂解事件或允許探針。這削弱了標記相互作用的掩蔽基團和等允許排放量的信號。本文使用的術(shù)語“掩蔽基團”是指任何原子，分子，化合物或基團，可以標記與互動，以降低發(fā)射信號的標記。標記的基分離和掩蔽基團探針產(chǎn)生的裂解事件或變性過程中裂解事件允許附加的標記，從而導(dǎo)致發(fā)射信號的探測增長的需要。根據(jù)不同的標記，信號發(fā)射可能包括發(fā)光，顆粒排放，外觀或失蹤的復(fù)合色，等。首選發(fā)光標記和掩蔽基團可以交互修改的標記發(fā)光的說明如下。所謂“色”是指非放射性化合物，在吸收光能的形式。有的色體，可興奮發(fā)光或者通過化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，或由光吸收，產(chǎn)生熒光。術(shù)語“熒光團”是指它是一個復(fù)合的熒光頻率可在，即吸收頻率和發(fā)光另外，普遍較低。術(shù)語“發(fā)光”是指化學(xué)發(fā)光形式，其中發(fā)光化合物是生物體是生活中找到。化合物發(fā)光的例子包括細菌熒光素酶和螢火蟲熒光素酶。所謂“淬火”是指一種化合物減少造成的第二個化合物熒光第一，無論機制。淬火通常要求該化合物在靠近。由于此處使用的，無論是化合物或化合物的熒光據(jù)說是淬火，并據(jù)了解，這兩種用法指的是同樣的現(xiàn)象。該機制的化合物能發(fā)光的淬火通過第二個化合物莫里森介紹，199213，在非同位素的DNA探針技術(shù)(Krickaed.，AcademicPress,Inc.SanDiego,Calif.)。機制是一個眾所周知的熒光能量轉(zhuǎn)移(場效應(yīng)管)，也稱為轉(zhuǎn)移到能源的文學(xué)作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，無輻射，遠程能量轉(zhuǎn)移，偶極耦合的能量轉(zhuǎn)移，能量轉(zhuǎn)移和福斯特。對于場效應(yīng)管的主要要求是這種化合物發(fā)射光譜，能源供體，必須與其他復(fù)合重疊的吸收光譜，能量受體。StyerandHaugland，1967，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:719引入本所引用，表明滅劑對能量傳遞效率的一些常見的發(fā)射極淬可達到100%時的間隔距離小于10埃。能量的傳輸速率下降的比例間距第六權(quán)力之間的距離的能量供體和受體分子的能量增加英寸因此，大大減少能量的傳輸速率，捐助者造成的能源增加熒光，如果該淬滅劑發(fā)色也是一個熒光團，一個能受體熒光的下降。該方法的標記信號發(fā)射，最好是熒光標記，必將對探針檢測。許多熒光團和藝術(shù)的發(fā)色團介紹了適合的方法是使用英寸合適的熒光團和淬火生色團對的選擇，要的發(fā)色團的發(fā)射光譜的熒光團的吸收光譜重疊的。理想情況下，熒光團應(yīng)具有較高的Stokes位移(一大差異最大發(fā)射波長之間的最大吸收波長和)，以盡量減少光的干涉零星激勵。合適的標記是眾所周知的藝術(shù)包括(但不限于)，fluoroscein和衍生工具，例如FAM,HEX,TET和JOE；羅丹明及其衍生物例如得克薩斯紅，羅紅霉素，和坦拉；路西法黃色和香豆素衍生物例如7-我2的N-香豆素-4-醋酸，7-羥基-4-CH的。3香豆素-3-醋酸和7新罕布什爾州2-4-CH的3香豆素-3-醋酸(孫家正)。FAM，HEX,四環(huán)素，JOE,羅紅霉素和坦拉是銷售的珀金埃爾默，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司分部(福斯特城，加利福尼亞州)。得克薩斯紅和許多其他合適的化合物分子探針銷售秒(尤金，厄賴格)?；衔锏幕瘜W(xué)發(fā)光和發(fā)光的例子可能是合適的捐贈者作為能源的利用，包括魯米諾(aminophthalhydrazide)和衍生物，熒光素酶。雖然在大多數(shù)實施方案的將是首選的可檢測標記是一個發(fā)光標記和掩蔽基團是淬滅劑，例如一個淬火生色，其他可檢測標記和掩蔽基團是可能的。例如，該標記可能是一種酶和掩蔽基團的酶抑制劑說。當(dāng)酶抑制劑在相當(dāng)接近的密切互動，該抑制劑能夠抑制這種酶的活性。對裂解或抑制變性的探針，酶和分離，不再能夠互動，使得這種酶呈現(xiàn)活躍。抑制劑A和多種產(chǎn)品的酶能夠探測催化反應(yīng)產(chǎn)生一個在生產(chǎn)酶的活性等是眾所周知的熟練技工，例如β-半乳糖苷酶和辣根過氧化物酶。在另一個方面本發(fā)明的方法提供了一個單體多可檢測核苷酸探針，包括至少2運載靶結(jié)合域隔開，核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解的單體探針影響的域，標記和掩蔽基團。在另一個方面，該方法提供了一個單體多單體探核苷酸探針，包括至少一對，靶結(jié)合域隔開，核酸酶裂解元件或易受核酸域酶降解影響的域由至少1靶序列針攜帶一個可檢測標記和掩蔽基團。優(yōu)選地，可檢測標記和掩蔽基團的位置，使標記信號的可檢測是減少或使之團無法察覺的掩蔽基在單體探針是完整的。在一個實施方案中，單體探針是循環(huán)的。在另一個實施方案中，單體探針是線性。優(yōu)選地，域之一靶結(jié)合位于5'末端或3'末端，更優(yōu)選之一靶結(jié)合域是位于5'末端和域靶結(jié)合位于3'末端。在一個實施方案中，核酸酶裂解元件是一個鏈的限制性核酸內(nèi)切酶(即單體核酸序列的組成部分)識別位點，即在一定的補充，該核酸酶裂解元件構(gòu)成了限制性核酸內(nèi)切酶識別位點。在一個實施方案中，當(dāng)所述靶核酸是基因時，所述核酸酶裂解元件包含核糖核酸。最好是可檢測標記是一個熒光團，并表示掩蔽基團是淬滅劑的熒光能夠淬火時表示熒光團在充分接近。在特別優(yōu)選的實施方案中，該方法提供了一個單體多攜帶一個核苷酸探針，包括至少兩個探針單體靶結(jié)合域隔開，核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解影響的域時，熒光團和淬滅劑。優(yōu)選地，所述熒光團的位置5'的裂解元件或易受核酸酶降解影響的域和淬滅劑被定位3'的裂解元件或易受核酸酶降解影響的域，或反之亦然。單體探針不同配置的允許變化的方法來檢測靶核酸被聘用。本發(fā)明的方法還可以使用一個方法檢測探針在此統(tǒng)稱為核糖核酸酶介導(dǎo)檢測(RMD)，可用于檢測DNA的靶是幾何擴增足夠高的數(shù)字是這樣的靶分子不需要?？蛇x擇地，它可以用于任何方法結(jié)合DNA的擴增與方法，除了本文所述的檢測。該方法利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移再次產(chǎn)生歧視性的熒光信號，但標記不同于雙重領(lǐng)導(dǎo)的TaqMan探針是它使用一種RNA探針和核糖核酸酶閣下對核糖核酸酶H非破壞性的酶的DNA雜交的DNA鏈的RNA/意味著使用RNA探針將離開靶DNA的完整性。此外，這種酶完全水解行動的退火探針等能讓新的探針結(jié)合。從本質(zhì)上講，在DNA鏈只是作為一個探針介導(dǎo)的裂解催化劑的酶。因此，有足夠的探針，信號強度會隨時間增加線性的方式。該方法靈敏度高。這樣一個系統(tǒng)可以檢測少至320德阿莫萊斯(3.2X10-16)的靶序列(約2.0億分子)。這樣的水平是非常好的靈敏度為等溫檢測方法，當(dāng)溫結(jié)合等擴增提供了強大的檢測系統(tǒng)。因此，該方法提供了一種檢測DNA方法的一個靶所述者外，其中包括額外的單體探針，檢測序列互補或相應(yīng)的至少部分鏈核糖核酸序列的單探針攜帶一個可檢測標記和掩蔽基團，探針方法此外包括單鏈的步驟與樣品接觸。優(yōu)選地，可檢測標記是熒光團，和掩蔽基團是淬滅劑。優(yōu)選地，核酸酶是核糖核酸酶的H(核糖核酸酶H)或代理人有核糖核酸酶H活性。由于此處使用的，一個“代理人有核糖核酸酶H活性”包括核糖核酸酶小時，變異體及其功能和現(xiàn)金等價物，即同等功能是任何化合物，基團或酶具有一種RNA溶核RNA組分活性反對DNA的雜交，但仍然核糖核酸DNA的雜交無溶的DNA核活性成分的一對。應(yīng)意識到，RMD方法可以采用的方法是在聯(lián)同述。在一些實施方案中，這樣的組合標記允許聯(lián)合國主導(dǎo)的(從而降低成本)探針的是制造和使用。有了這個辦法的實施方案，產(chǎn)生的信號由RMD探針可以保持通用的，不論靶序列被檢測到。明顯的是，在這種合并實施方案秒，當(dāng)探針存在于單體的檢測次序，此處使用的是一個序列能夠向RMD探針雜交。另外提供的方法和探針作為上文所述及本數(shù)字，參照實例。在另一個方面，本發(fā)明的方法提供了一個組成包含探針，穩(wěn)定與一個或一個以上的添加劑，緩沖器，輔料。優(yōu)選地，所述組合物還含有一種或多種下列物質(zhì)，包括核酸酶；鏈分開活性劑；活化或增強具有核酸酶活性的試劑的化合物、輔助因子或輔酶；活化或增強鏈分開活性的試劑的化合物、輔助因子或輔酶。在另一個方面，本發(fā)明的方法提供了樣品試劑靶核酸盒檢測，說含有活性試劑盒數(shù)量單體探針，核酸數(shù)量的酶，并分離數(shù)量的鏈，探針與指示一起接觸時，核酸酶和活性與樣品鏈分離。在一個實施方案中，試劑盒額外含有引物，優(yōu)選地引物是本文所述的二聚物寡核苷酸引物。工具箱包含的材料的方法進行必要的可組裝方便和促進標準化處理。通常情況下，試劑盒將包括單體探針，對至少一種核酸酶，聚合酶和必要的緩沖區(qū)，以及或更多的標準。該標準可靶核酸，核酸酶或聚合酶底物，或進行數(shù)據(jù)的方法(經(jīng)驗)以印刷或電子形式校準需要必要的。材料是包含在套件，以及以何種形式試劑盒組件提供的，可能取決于最終的目的。例如，在使用固相技術(shù)(例如但不限于著名的“量尺”技術(shù))，其中反應(yīng)的單體探針成分例如在核酸酶和聚合酶活動存放在一個堅實的底物是那么樣品接觸的是核酸為靶分析存在的，例如輕易讓場分析的樣品在實驗室設(shè)施的情況下不使用。應(yīng)意識到一個試劑盒可能含有單一品種的探針，并從而能夠顯示核酸存在種靶單一的，或者可能包含探針，多物種如核酸存在的靶多個品種，可表示。在后者的實施方案可能是可取的種探針標記的不同導(dǎo)致的差異，因此，目前的身份更多種靶核酸的一個或可確定。但是，在其他情況下物種鑒定的具體靶核酸不是必需的，其中便沒有必要差異標記的探針各物種。在優(yōu)選的實施方案中，試劑盒可以包括多個品種，最好的引物二聚物引物作為本網(wǎng)站所介紹。應(yīng)意識到單一的種(普遍)單體探針，單體探針，從而可以被用于引物各種。它也將是被理解的，這些材料目前在該試劑盒可以選擇，使定性，半定量或定量盒評價靶的核酸存在于樣品。例如，該試劑可以給二元(是/否)樣品說明或更多種靶是否存在核酸的研究。在另一個例子，說明可能是半定量，例如，提供三個層次的信號-高，低和無信號。根據(jù)不同的標記，這些級別可以例如是色調(diào)相同，其中一個深色陰影表示高度中等色調(diào)的靶核酸，表示一個靶核酸水平低，與淺色或無色顯示沒有靶核酸目前。該試劑盒還可以提供用于信號的定量分析靶生產(chǎn)核酸，例如通過測量，包括實時測量。一個例子的靶核酸定量測量等提出了在這里的例子。方法和探針在所有情況下具有寬廣的應(yīng)用，其中特定核酸的存在或量杯確定。本文所述的方法應(yīng)用的非限制性例子包括檢測微生物劑，包括病原體細菌和病毒，在這兩個領(lǐng)域的醫(yī)藥和生物恐怖主義檢測劑；ii.利什曼原蟲檢測的寄生蟲病，例如瘧疾，錐蟲；iii.檢測，歧視的目的，或量化的人類DNA或農(nóng)業(yè)為法醫(yī)或檢測，歧視，或量化獸醫(yī)動物或植物的DNAiv.微生物檢測，植物或生物蟲害；[0256]v.生物體的轉(zhuǎn)基因檢測；vi.在第檢測特定遺傳等位基因或多態(tài)性。其目的是，提及一個數(shù)字范圍的披露者外(例如1到10)也納入?yún)⒖挤秶鷥?nèi)，7所有相關(guān)號碼范圍(例如，1，1.1，2，3，3.9，4，5，6，6.5，8，9和10)，并有合理數(shù)量范圍內(nèi)的范圍(例如2至8，1.5至5.5和3.1到4.7)，因此，所有分全范圍的范圍明確披露均為明確披露。這些只是具體的例子是什么目的和價值列舉所有可能的組合數(shù)值之間的最低值和最高將被認為是明確地說，這在類似的應(yīng)用在。應(yīng)意識到變異體的核酸，例如，對靶核酸或本單體探針，可以通過利用中的方法。本文使用的術(shù)語“變體”是指多核苷酸序列的殘留物或多肽的具體確定不同的序列，其中一個或多個核苷酸或者氨基酸被刪除，替換或補充。變異體可能是自然發(fā)生的等位基因變異體或非自然發(fā)生的變異體。變異體可能來自同一個或其他物種，可能涵蓋同源，paralogues和orthologues。在某些實施方案秒，變異體的多肽和多核苷酸發(fā)明是具有生物活性相同或相似的核苷酸這些多肽的發(fā)明或者多。術(shù)語“變種”的提述，以多核苷酸和多肽的多核苷酸包括一切形式的定義和多肽此處。變異多核苷酸序列最好展出至少50%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少98%，而且大多數(shù)最好至少99%的同源序列的方法，以一本發(fā)明的。身份是發(fā)現(xiàn)了一個核苷酸的立場比較窗口至少5，最好是至少10個核苷酸位置，最好是至少20個核苷酸的立場，最好是至少50核苷酸的立場，更優(yōu)選至少100個核苷酸位置，最最好的多核苷酸對整個長度。多核苷酸序列的身份可以按以下方式確定。這個題目多核苷酸序列進行比較候選人多核苷酸序列使用方案BLASTN程序(高爐組曲版本，2.2.5[2002年11月]bl2seq)在(塔蒂亞娜答Tatusova，托馬斯屬馬登(1999)，“高爐2序列_1核苷酸序列比較新的工具和S蛋白”，F(xiàn)EMS觀測微生物萊特。174:247-250)，這是可以從公開的ncbi(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)。參數(shù)bl2seq默認可以使用。多核苷酸序列的身份也可以計算在核苷酸序列的整個長度多的候選人之間的重疊和主體的使用全局序列比對程序(例如尼德爾曼，SB和文施，光盤(1970)j的分子。誘導(dǎo)法。48,443-453)。一個比對算法全面實施的Needleman-Wunsch全球被發(fā)現(xiàn)在該方案2000年6月使用EMBOSS針包(水稻，第朗登，和布萊斯比，甲使用EMBOSS歐洲分子生物學(xué)開放式軟件套件，遺傳學(xué)趨勢，第16，第6。pp.276-277)，它可以從獲得http//www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS八歐洲生物信息研究所服務(wù)器還提供了設(shè)施，以執(zhí)行與浮針兩個序列之間的全球路線上http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/線的?？蛇x擇地的GAP方案可用于計算的兩個終端的差距沒有懲罰的最優(yōu)序列全局比對。間隙中介紹了以下文件黃，十(1994)，全球序列比對。227-235計算機應(yīng)用生物科學(xué)十。BLASTN程序使用上述作為核苷酸多是首選的身份使用序列測定變異體根據(jù)本發(fā)明的方法。可選擇地，變異多核苷酸對本發(fā)明的方法雜交的多核苷酸序列披露者外，或補充條件及其嚴格的。所謂“條件下雜交”嚴格和語法等值段，是指分子能力的多核苷酸進行雜交，以一靶多核苷酸分子(例如一靶多核苷酸例如，固定在一個DNA分子或RNA印跡Southern雜交或Northern雜交)規(guī)定的條件下鹽的濃度和溫度。雜交的能力受到嚴格的雜交條件可以決定由最初較寬松的條件下雜交然后增加至所需的嚴謹。關(guān)于多核苷酸分子條件大于長度約100基地，是典型的嚴格的雜交不超過25至30攝氏度(例如，10°C)，低于熔點溫度本土雙工(Tm)(見一般，薩姆布魯克等人。主編，1987，分子克隆，實驗室手冊，第二版。冷泉港出版社奧蘇貝爾等人。，1987年，出版，當(dāng)前的協(xié)議在分子生物學(xué)，格林)?；氐腡m為100多核苷酸分子大于大約可以計算公式的Tm=81.5+0.41%(G+C的日志(鈉)。(薩姆布魯克等人。主編，1987，分子克隆，實驗室手冊，第二版。冷泉港出版社博爾頓和麥卡錫，1962年，美國國家科學(xué)院院刊84:1390)。典型核苷酸分子嚴格的條件，多長度大于100個基地，將雜交條件例如prewashingSDS溶液在南南合作的6倍，0.2%，直徑在65<雜交，6倍南南合作，0.2%的SDS—夜之間，其次的兩個洗0每30分鐘在IX南南合作特別職務(wù)隊在65，0.的SDS在65攝氏度和0.兩個洗300.2X南南合作，每分鐘在C關(guān)于多核苷酸分子有一個長度小于100基地，示例性嚴格的雜交條件的Tm5至10度C以下。平均而言，長度的Tm—個多核苷酸分子小于IOObp的是減少了約(500/寡核苷酸長度)攝氏度變異多核苷酸對本發(fā)明的方法還包括阿多核苷多核苷酸的序列不同于的方法，但指出，作為一個舉足輕重的遺傳密碼的簡并，編碼一個多肽有類似活動，由編碼的多肽酸的本發(fā)明的方法。一個序列改變，不改變氨基酸序列的多肽是一種“無聲的變化”。除ATG的(蛋氨酸)和TGG(色氨酸)，其他氨基酸的密碼子為同一可能會更改公認的藝術(shù)技巧，例如，密碼子優(yōu)化表達宿主生物體在特定。多核苷酸序列改變方法而產(chǎn)生的保守氨基酸替換在一個或幾個編碼的多肽氨基酸序列沒有顯著改變其生物活性也列入。一個熟練的工匠將制作方法知道沉默的表型氨基酸替換(見，例如，鮑伊等，1990年，科學(xué)247，1306)。由于變異多核苷酸和多肽序列變異沉默保守換人的編碼可能會決定使用(版本2.2.5[11月的公開程序從現(xiàn)有bl2seq的爆破方案套件2002])從NCBI(ftp://ftp。ncbi.nih.gov/爆炸/)通過tblastx算法如前面所述。該變異多核苷酸序列的方法也可確定由本領(lǐng)域技術(shù)人員計算機為基礎(chǔ)的方法眾所周知的，使用公共域序列比對算法和序列相似性搜索工具來搜索序列數(shù)據(jù)庫(GenBank中公共領(lǐng)域的數(shù)據(jù)庫包括，歐洲分子生物研究室，瑞士普羅特，紅外等)。例如，見核酸不動產(chǎn)的。291-10和11-16,2001例如序列的S網(wǎng)上資源。檢索和相似性檢索調(diào)整靶s評分1矩陣分配一個序列的比較進行分析(例如，一個查詢序列)。使用序列比較算法總體評分為路線的每個。一個示例性的方案數(shù)據(jù)庫家庭有用的順序確定變異體是爆破方案套件(版本2.2.5[2002年11月])，包括BLASTN程序，經(jīng)BLASTp，BLASTX的，tBLASTN和tBLASTX，這是公開的，從(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/爆炸/)或從美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)，國家醫(yī)師醫(yī)學(xué)圖書館，大廈38A條，室8N805，貝塞斯達，20894美國。NCBI的服務(wù)器還提供了設(shè)備使用屏幕上的方案，許多數(shù)據(jù)庫的公開序列。BLASTN程序比較1核苷酸序列數(shù)據(jù)庫查詢核苷酸序列反對。經(jīng)BLASTp比較蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。BLASTX的查詢序列的氨基酸對一個比較一個核苷酸序列數(shù)據(jù)庫查詢翻譯的蛋白質(zhì)序列在所有閱讀框反對。tBLASTN比較閱讀框。tBLASTX蛋白質(zhì)序列查詢所有針對動態(tài)1核苷酸序列數(shù)據(jù)庫翻譯比較了核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中的6張翻譯，查詢序列對6幀翻譯的核苷酸。該方案可用于高爐使用默認參數(shù)或參數(shù)可以根據(jù)需要改變屏幕改進。該算法使用家庭爆炸，包括BLASTN程序，經(jīng)BLASTp和BLASTX的，是描述在al出版阿爾特舒爾等。，核酸不動產(chǎn)的。25:3389-3402，1997。在“點擊”，以一個或多個算法，數(shù)據(jù)庫，或tBLASTX序列上的同源性產(chǎn)生質(zhì)疑序列，經(jīng)BLASTp，BLASTX的，tBLASTN，類似的調(diào)整和確定序列相似部分。相似的點擊率是按順序排列的程度與序列長度的重疊。點擊到一個數(shù)據(jù)庫序列通常代表一個序列重疊多只質(zhì)疑一小部分序列的長度。該BLASTN程序，經(jīng)BLASTp，BLASTX的，tBLASTN和tBLASTX算法也產(chǎn)生“期望”的路線，值。在期待值(五)表明點擊數(shù)可以“預(yù)期”來搜索時偶然看到一個連續(xù)的序列數(shù)據(jù)庫大小相同的含隨機的。確定的期待值作為閾值的意義數(shù)據(jù)庫是否擊中一說明真正的相似性。例如，一個0.IE值分配給一個多核苷酸擊中放映解釋為這意味著在一個數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫的大小，人們可能會看到0.1匹配一致部份的序列比類似的評分只是偶然的部分。匹配的序列一致，并有一E的價值為0.01或以下，該數(shù)據(jù)庫的概率在這找到一個匹配的機會是1%或更少使用BLASTN程序，經(jīng)BLASTp，BLASTX的，tBLASTN或tBLASTX算法。為了找出多核苷酸變異體最有可能被披露同等功能的序列，進一步以電腦為基礎(chǔ)的方法幾個已知本領(lǐng)域技術(shù)人員。相關(guān)序列的多序列比對的一組可以進行與中Clustalw(湯普森，法學(xué)博士，希金斯，DG和吉布森的TJ(1994)中Clustalw比重逐步提高，通過多序列比對序列的敏感性，職位的具體差距和處罰權(quán)重矩陣的選擇。核酸的研究，22=4673-4680,http//www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/Clustalff/Top.html)或T-咖啡(塞德里克Notredame，德斯蒙德克希金斯，夏侯Heringa，T型咖啡一個序列比對方法快速，準確的多，j的分子。誘導(dǎo)法。(2000)302:205-217))或堆積，使用向上，強成對路線(豐和杜利特爾，1987.分子·Evol.25，351)。模式識別軟件應(yīng)用是可序列尋找圖案或簽名。例如，模因(多為啟發(fā)式電磁母題)發(fā)現(xiàn)一組序列的圖案和簽名序列，桅(母題比對和搜索工具)使用這些圖案，以識別類似或在查詢序列的相同圖案。肥大的結(jié)果，由于本主題的一系列路線，以適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計數(shù)據(jù)可視化概述和資料。與肥大的MEME制定了在加州大學(xué)圣地亞哥分校。對于PR0SITE(貝羅奇和布赫爾，1994年，核酸不動產(chǎn)的。22，3583；霍夫曼等人。，1999年，核酸不動產(chǎn)的。27，215)是一序列的cDNA的方法確定蛋白質(zhì)的功能，或為下一步的基因組翻譯。這對于PR0SITE數(shù)據(jù)庫(www.expasy.org/對于PR0SITE)包含重要的模式生物，是設(shè)計和配置文件，以便它可以使用適當(dāng)?shù)挠嬎愎ぞ?，分配一個新的序列已知的蛋白質(zhì)，以確定哪些家庭或已知的域名(第)的人目前在序列(法爾凱等。，2002年，核酸不動產(chǎn)的。30，235)。Prosearch是一個工具，可以搜索一個給定的序列模式或簽名瑞士PROT和EMBL的數(shù)據(jù)庫的。一個“片段序列”提供的多核苷酸此處可能指的是連續(xù)的核苷酸序列的長度是至少在5核苷酸。該片段可能包括至少5個核苷酸，最好是至少10個核苷酸，最好至少15個核苷酸，最好是至少20個核苷酸，更優(yōu)選至少30個核苷酸，更優(yōu)選至少50個核苷酸，更優(yōu)選至少50個核苷酸，最最好至少60個核苷酸的方法連續(xù)多核苷酸核苷酸的所謂“引物”可能是指短多核苷酸，通常有一個游離的3'OH組，這是一個模板雜交和核苷酸用于多聚合一吸互補的靶。裝配方法和操縱遺傳結(jié)構(gòu)和載體，再加上利用生物酶分子酶普遍采用的技術(shù)，包括核酸例如核糖核酸酶，核酸外切酶和限制性核酸內(nèi)切酶，聚合酶，連接酶等，是眾所周知的在藝術(shù)和描述人一般在薩姆布魯克等。分子克隆一個實驗室手冊，第二版。冷泉港出版社，1987；奧蘇貝爾等人。1987年當(dāng)前的協(xié)議在分子生物學(xué)，格林出版)。該方法的各個方面，現(xiàn)在便顯示了一個非限制的方法參照下面的例子。下面的例子描述了熒光使用標記和淬滅劑秒不過，這主要是為方便起見和不打算限制的方式在任何應(yīng)用程序。如上所述，明顯的是其他標記和掩蔽基團也可使用的方法。實施例實施例1-線性單體NCR探針這個例子說明所附的數(shù)字的元素之一實施方案的方法步驟，并在鏈式反應(yīng)，導(dǎo)致信號放大。應(yīng)該注意的元素的順序可以不同，它描述了本文及圖1所示。該線性配置，單鏈多核苷酸探針顯示在圖1。本實施方案是在此統(tǒng)稱為一串聯(lián)重復(fù)限制酶鏈式反應(yīng)提供便利(的TR-REF的)探針。這個例子描述了特定的反應(yīng)核酸序列。成分的使用其在的TR-REF的探針擴增法檢測包括的TR-REF的探針，包括靶核酸串聯(lián)重復(fù)的反向互補；一靶核酸；一種DNA聚合酶和至少限制性核酸內(nèi)切酶。這將是感謝本領(lǐng)域技術(shù)人員，一個聚合酶的數(shù)量和組合的限制性核酸內(nèi)切酶可以替代這個例子為那些使用。也將是本領(lǐng)域技術(shù)人員贊賞的各種方法可用于在核酸或?qū)到鉁鐒┑腡R-REF的探針在淬除了熒光團/產(chǎn)生一個熒光信號通過分離檢測靶無論是積累多拷貝作為實施說明，在當(dāng)前方案。例如在探針的TR-REF的這一實施方案描繪在圖1，包括一個靶核酸串聯(lián)重復(fù)的反向互補，酶分離，接頭，該內(nèi)切核酸編碼序列承認的限制性人工智能的BSM和接頭的一部分這一設(shè)計的網(wǎng)站承認的限制性核酸內(nèi)切酶最低工資條例的，就是這樣，唯一的限制放在核酸序列的靶的選擇是一個核苷酸的要求為地方選區(qū)期余下的適當(dāng)距離，從最低工資條例余識別位點接頭在目前，以生成完整的最低工資條例限制我的網(wǎng)站。其他限制酶的意志其他地方的探針設(shè)計上的限制。靶核酸應(yīng)具有相應(yīng)的TR-REF的探針互補的結(jié)合位點上，和一個游離的3'羥基，可以用DNA聚合酶延伸。核酸適當(dāng)靶的例子包括(但不僅限于)引物秒，包括短寡核苷酸，只在靶產(chǎn)生的核酸存在的第二和單鏈靶DNA的裂解的一個核酸酶，這樣的3'端可以用DNA聚合酶延伸。例如，在使用這些引物的實施方案中，靶核酸產(chǎn)生(直接或間接)專門在分析了存在的第二靶核酸，它是第二靶核酸是最終被檢測或核酸。一旦產(chǎn)生，靶核酸是能夠綁定的TR-REF的探針，并用DNA聚合酶延伸。核酸延伸了用DNA聚合酶靶(使用的TR-REF的探針作為模板)生成一個第二拷貝對靶核酸?；パa裂解的所得雙鏈探針/反向的限制酶秒(在這個例子中的BSM人工智能，我和最低工資條例)探針在的結(jié)果是降解的TR-REF，和兩個分離的序列拷貝的靶核酸。分隔拷貝的靶核酸的游離于的探針對其余片段的TR-REF。每個拷貝，然后可以綁定一個新的(完整)探針拷貝的TR-REF的，并開始隨后的一個回合的反應(yīng)。在每次迭代的反應(yīng)，雙打人數(shù)靶，從而導(dǎo)致信號的幾何擴增。從的TR-REF的反應(yīng)中獲得的結(jié)果示于圖4和5中。反應(yīng)包括0.25微米的FAM/BHQ-標記的TR-REF的探針[5‘-FAM的-GCATCGCAAAGCGGTTGCGAGACGCATGCATCGCAAAGCGGTTG-3'-BHQ-參見圖3，如SEQID號1]；1.25U型的BSM人工智能；1.25我U的最低工資條例;5聚合酶U對TaqDNA片段的斯托費爾的；IOmM的氯化鎂2，50mM的鹽；2%二甲基亞砜，ImM的數(shù)碼地面電視和200μM的dNTP濃度，PH值在7.5最后的量，20μ1的IOmM的磷酸三。0.1羅紅霉素μM的加入對反應(yīng)的正?；g的熒光。如圖4中所示，0摩爾，5att0m0le，50attomole、500attomole和5femtomole的量的靶寡核苷酸被添加到不同的反應(yīng)孵化之前在59°C的反應(yīng)進度監(jiān)測是通過測量孵化期間的票價調(diào)整機制熒光增加對課程的影響。圖5顯示了一個反復(fù)試驗的地方基因組DNA，添加到樣品。實施例2-線性單體IRC-REF探針這個例子說明的探針元素的TR-REF另一種形態(tài)的，和鏈式反應(yīng)的步驟，從而導(dǎo)致信號放大也有所說明。同樣應(yīng)該注意的元素的順序的不同可以從此處所述和數(shù)字顯示在陪同。這個例子說明了特定核酸擴增檢測系統(tǒng)替代了序列的基礎(chǔ)上重排反應(yīng)，的該元素的TRREF，并在此統(tǒng)稱為倒反向互補限制酶易化系統(tǒng)(IRC-REF的)鏈式反應(yīng)。該中心-REF的探針包括，在3'端，在核酸序列反向互補的靶，并在5'端序列拷貝的靶核酸。附加組件的反應(yīng)是靶核酸；一種DNA聚合酶和至少一種限制性核酸內(nèi)切酶。應(yīng)該感謝本領(lǐng)域技術(shù)人員，一個聚合酶的數(shù)量和組合的限制性核酸內(nèi)切酶可以替代的例子說明了那些用于。還應(yīng)人員贊賞本領(lǐng)域技術(shù)，各種方法可用為探針檢測REF的任何一方的體育館，積累了多個拷貝的靶核酸或降解的。例如在6描繪在圖方案的實施，在IRC-REF的探針包括核酸序列反向互補的靶，以及序列拷貝的靶核酸如上所述，點位分隔包含識別一個接頭對限制性核酸內(nèi)切酶BSAXI。靶核酸應(yīng)具有相應(yīng)的IRC-REF的探針互補的結(jié)合位點上，和一個游離的3'羥基，可以用DNA聚合酶延伸。核酸適當(dāng)靶的例子包括(但不僅限于)引物秒，包括短寡核苷酸，只在靶產(chǎn)生的核酸存在的第二和單鏈靶DNA的裂解的一個核酸酶，這樣的3'端可以用DNA聚合酶延伸。例如，在實施方案利用這些引物時，靶核酸產(chǎn)生(直接或間接)專門在分析了存在的第二靶核酸，它是第二靶核酸或是最終被檢測的核酸。一旦產(chǎn)生，靶核酸是能夠綁定的IRC-REF的探針，并用DNA聚合酶延伸。核酸延伸的靶用DNA聚合酶模板(的探針作為使用IRC-REF)呈現(xiàn)識別位酶點對BSAXI雙面鏈，允許有效的新合成的DNA裂解這一限制性核酸內(nèi)切。這項結(jié)果發(fā)表在核酸的原始拷貝的靶和靶的釋放核酸編碼的IRC-REF的探針。每個拷貝，然后可以綁定一個新的(完整)探針拷貝的TR-REF的，并開始了隨后的一輪反應(yīng)。應(yīng)意識到上述介紹的方法提供了榜樣和人員的變化只在這兩個領(lǐng)域技術(shù)和材料所使用的技術(shù)是眾所周知的。公幵文獻Mullis.1987,UnitedStatesPatent4,683,202.ProcessForAmplifyingNucleicAcidSequences.Livaketal.1998，UnitedStatesPatent5，723，591.Self-QuenchingFluorescenceProbe.Gelfandetal.1993UnitedStatesPatent5，210，015.HomogenousAssaySystemUsingTheNucleaseActivityOfANucleicAcidPolymersase.Baranyetal.2006，UnitedStatesPatent7，014，994.CoupledPolymeraseChainReaction-Restriction-EndonucleaseDigestion—LigaseDetectionReactionProcessFisheretal.1996,UnitedStatesPatent5,491,063.MethodsForIn-SolutionQuenchingOfFluorescently-LabelledOligonucleotideProbesKidwell.(1994),UnitedStatesPatent5,332,659.LightEmissionOrAbsorbance-BasedBindingAssaysForPolynucleicAcidsMatsumotoetal.,UnitedStatesPatent6,830,889.MethodOfDetectingDnaByDnaHybridizationMethodWithTheUseOfFluorescentResonanceEnergyTransferCoullet.Al.2005,UnitedStatesPatent6,949,343:Methods,KitsAndCompositionsPertainingToPnaMolecularBeaconsBaranyet.Al.1996，UnitedStatesPatent5，494，810:ThermostableLigase-MediatedDnaAmplificationsSystemForTheDetectionOfGeneticDiseaseTyagiS.andKramerF.(1996)MolecularBeaconsProbesThatFluoresceUponHybridization.Nat.Biotechnology.14:303_308·BaranyF.(1991)TheLigaseChainReactionInAPerWorld.PCRMethodsandApplications，vol.lpp.5-16.BroudeN.(2005)MolecularBeaconsAndOtherHairpinProbes.EncyclopediaofDiagnosticGenomicsandProteomics.MarcelDekkerInc.PefferN.,HanveyJ.，BisiJ.，ThomsonS.,Hassman,F.，Noble，S.andBabiss，L(1993)StrandInvasionOfDuplexDnaByPeptideNucleicAcidOligomers.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9010648-10652SlaitasA.，AnderC.,Foldes"PappZ，RiglerR.andYeheskielyE.(2003)SupressionOfExonucleolyticDegradationOfDouble-StrandedDnaAndInhibitionOfExonucleaseIiiByPna.Nucleosides,NucleotidesandNucleicAcids221603-1605.權(quán)利要求一種檢測樣品中的靶核酸的方法，該方法包括下列步驟a)提供包含單鏈靶核酸的樣品，其中所述單鏈靶核酸具有游離的3’末端；b)提供單體多核苷酸探針，包含i)至少兩個靶結(jié)合域，其中所述結(jié)合域被核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解影響的域分開，或ii)靶結(jié)合域和至少一部分所述靶核酸的拷貝，其中所述靶結(jié)合域和所述靶核酸被核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解影響的域分開；c)使所述樣品和所述單體多核苷酸探針的多于一種拷貝接觸；d)使所述樣品和合成所述單體探針的反向互補的聚合酶接觸；e)使所述樣品和至少一種核酸酶接觸以裂解所述核酸酶裂解元件或降解所述易受核酸酶降解影響的域；以及f)檢測所述探針的裂解或降解。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述單體探針的反向互補包含靶核酸的至少一種拷貝和靶結(jié)合域的至少一種拷貝。3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述切割位點的幾何形狀為使得裂解產(chǎn)物中成對核苷酸的數(shù)量減少。4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述探針的裂解或降解通過熒光法檢測。5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述探針的裂解或降解通過比色法檢測。6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述探針的裂解或降解通過免疫法檢測。7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述探針的裂解或降解通過電泳法檢測。8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述探針的裂解或降解通過雜交法檢測。9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述探針的裂解或降解使用納米孔道技術(shù)來檢測。專利摘要本公開涉及快速、單一溫度(等溫)檢測特定核酸序列的方法和探針。所述方法和探針提供檢測生物制劑(包括細菌和病毒)和檢測任何核酸序列的特定基因標志的簡便方法。文檔編號C12P19/34GKCN101970677SQ200980102090公開日2011年2月9日申請日期2009年1月8日發(fā)明者D·J·索羅,L·S·佩恩申請人:賽進有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan