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一種Ano3基因敲除的非人哺乳動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

文檔序號(hào):39526445發(fā)布日期:2024-09-27 17:02閱讀:52來(lái)源:國(guó)知局
一種Ano3基因敲除的非人哺乳動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥,更具體地,涉及一種ano3基因敲除的非人哺乳動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。


背景技術(shù):

1、ano3是哺乳動(dòng)物anoctiamin蛋白家族的成員,其是一種ca2+依賴(lài)的磷脂促翻轉(zhuǎn)酶。人類(lèi)anoctiamin家族蛋白具有一系列分子功能,在參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)、磷脂翻轉(zhuǎn)和調(diào)節(jié)其他膜蛋白起著重要作用。內(nèi)源性ano3是位于細(xì)胞膜及胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜蛋白,能夠發(fā)揮ca2+依賴(lài)的磷脂促翻轉(zhuǎn)酶和調(diào)節(jié)離子通道的作用。

2、ano3主要表達(dá)在神經(jīng)組織中,尤其是神經(jīng)元細(xì)胞中。其主要存在于紋狀體、海馬、皮層、背根神經(jīng)節(jié)等。ano3可與離子通道相互作用,參與調(diào)控神經(jīng)元興奮性。ano3蛋白能夠與鈉激活的鉀通道(kcnt1)直接相互作用,參與靜息膜電位的維持,因此ano3蛋白通過(guò)提高鈉離子通道的敏感性來(lái)抑制興奮性,從而參與調(diào)控神經(jīng)元的興奮性。其次ano3蛋白具有磷脂促翻轉(zhuǎn)酶,它能使磷脂在質(zhì)膜上的不對(duì)稱(chēng)分布消失,以響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的小幅升高。功能研究已表明ano3具有鈣離子激活的磷脂促翻轉(zhuǎn)酶活性而缺少離子通道活性。ano3基因是熱性驚厥、肌張力障礙等的重要致病基因。如何快速高效地構(gòu)建ano3基因敲除小鼠動(dòng)物模型,以促進(jìn)相關(guān)疾病的研究,是目前亟待解決的問(wèn)題。

3、因此,本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)一種ano3基因敲除的非人哺乳動(dòng)物模型。


技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述問(wèn)題,本發(fā)明的目的是提供了一種ano3基因敲除的非人哺乳動(dòng)物模型。

2、在本發(fā)明的第一方面提供了一種試劑,包括:

3、(a)基因編輯蛋白或其表達(dá)載體,所述基因編輯蛋白選自下組:casrx、cpf1、cas9、cas13a、cas13b、cas13c、或其組合;和

4、(b)sgrna或其表達(dá)載體,其中所述sgrna是引導(dǎo)所述基因編輯蛋白特異性結(jié)合ano3基因的rna。

5、另一優(yōu)選例中,所述sgrna包括sgrna1和/或sgrna2,所述sgrna1的靶向核酸序列如seq?id?no:1所示,所述sgrna2的靶向核酸序列如seq?idno:2所示。

6、在另一優(yōu)選例中,所述sgrna引導(dǎo)基因編輯蛋白特異性結(jié)合于ano3基因的核苷酸序列。

7、在另一優(yōu)選例中,所述組分(a)和/或(b)中的所述表達(dá)載體包括病毒載體。

8、在另一優(yōu)選例中,所述的病毒載體選自下組:腺相關(guān)病毒(aav)、腺病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、sv40、痘病毒、或其組合。

9、在另一優(yōu)選例中,所述的病毒載體選自下組:慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒(aav)、或其組合,較佳地,所述載體為腺相關(guān)病毒(aav)。

10、在另一優(yōu)選例中,所述試劑的劑型選自下組:凍干制劑、液體制劑、或其組合。

11、在另一優(yōu)選例中,所述試劑的劑型為液體制劑。

12、在另一優(yōu)選例中,所述試劑的劑型為注射劑型。

13、在另一優(yōu)選例中,所述基因編輯蛋白的表達(dá)載體和sgrna的表達(dá)載體為同一載體或不同載體。

14、在另一優(yōu)選例中,所述組分(a)與組分(b)的重量比為100:1-0.01:1,較佳地,10:1-0.1:1,更佳地,2:1-0.5:1。

15、在另一優(yōu)選例中,所述組合物中,所述組分(a)的含量為0.0001-99wt%,較佳地,0.1-90wt%,更佳地,1-70wt%。

16、在另一優(yōu)選例中,所述組合物中,所述組分(b)的含量為0.0001-99wt%,較佳地,0.01-90wt%,更佳地,0.1-70wt%。

17、在另一優(yōu)選例中,所述組合物中,所述組分(a)和組分(b)占所述組合物總重的0.01-99.99wt%,較佳地0.1-90wt%,更佳地1-80wt%。

18、在本發(fā)明的第二方面提供了一種分離的細(xì)胞,所述的細(xì)胞經(jīng)如第一方面所述的試劑處理,且所述細(xì)胞中ano3蛋白失活。

19、在另一優(yōu)選例中,所述細(xì)胞的基因組中ano3基因轉(zhuǎn)錄本的第1個(gè)外顯子至第13個(gè)外顯子切除。

20、在另一優(yōu)選例中,所述細(xì)胞包括體細(xì)胞、生殖細(xì)胞和/或胚胎干細(xì)胞。

21、在另一優(yōu)選例中,所述細(xì)胞選自人、和/或非人哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。

22、在另一優(yōu)選例中,所述胚胎干細(xì)胞還包括少于14天的胚胎、和/或受精卵。

23、在另一優(yōu)選例中,所述細(xì)胞選自嚙齒動(dòng)物,如小鼠、和/或大鼠。

24、在另一優(yōu)選例中,所述細(xì)胞為小鼠的受精卵。

25、在本發(fā)明的第三方面提供了一種ano3基因敲除的非人哺乳動(dòng)物的制備方法,包括以下步驟:

26、(m1)提供一種非人哺乳動(dòng)物的細(xì)胞,將所述細(xì)胞中ano3基因轉(zhuǎn)錄本的第1個(gè)外顯子至第13個(gè)外顯子切除,得到ano3蛋白失活的非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞;和

27、(m2)利用步驟(m1)中得到的ano3蛋白失活的細(xì)胞,制備得到ano3蛋白失活的非人哺乳動(dòng)物。

28、在另一優(yōu)選例中,所述細(xì)胞包括體細(xì)胞、生殖細(xì)胞和/或胚胎干細(xì)胞。

29、在另一優(yōu)選例中,所述細(xì)胞包括如第二方面所述的細(xì)胞和/或使用如第一方面所述的試劑處理的細(xì)胞。

30、在另一優(yōu)選例中,所述非人哺乳動(dòng)物包括嚙齒動(dòng)物,如小鼠、和/或大鼠。

31、在另一優(yōu)選例中,所述方法還包括:(m3)對(duì)步驟(m2)獲得的非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行雜交,通過(guò)基因型鑒定,從而獲得ano3蛋白失活的純合子代。

32、在另一優(yōu)選例中,所述鑒定的引物對(duì)包括wt-f和/或wt-r和/或mut-r引物對(duì),所述wt-f的核苷酸序列如seq?id?no:3所示:gtcaggacagatgccagcttcacc;所述wt-r的核苷酸序列如seq?id?no:4所示:gatgcagagcgggatgtggtgc;所述mut-r的核苷酸序列如seq?idno:5所示:ggggtattgcttaaggacatccacttcc。

33、在本發(fā)明的第四方面提供了一種ano3基因敲除的非人哺乳動(dòng)物模型,其特征在于,所述非人哺乳動(dòng)物模型利用如本發(fā)明第三方面所述的方法制備。

34、在另一優(yōu)選例中,所述非人哺乳動(dòng)物選自下組:嚙齒動(dòng)物(如小鼠、大鼠)。

35、在本發(fā)明的第五方面提供了一種用本發(fā)明第三方面所述的構(gòu)建方法制備的非人哺乳動(dòng)物模型或本發(fā)明第四方面所述的非人哺乳動(dòng)物模型的用途,其特征在于,可用于篩選,以確定用于治療或緩解熱性驚厥、肌張力障礙相關(guān)疾病的潛在治療劑。

36、應(yīng)理解,在本發(fā)明范圍內(nèi)中,本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合,從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅,在此不再一一累述。

37、與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有以下技術(shù)效果:

38、本發(fā)明提供了特異性靶向ano3基因的兩條sgrna,利用cas9蛋白將ano3基因的exon?1-exon13敲除,所敲區(qū)域序列為非3倍數(shù),造成移碼突變,且敲除區(qū)域包含該基因編碼區(qū)的70.59%,從而達(dá)到將該基因敲除的目的。使用crispr/cas9系統(tǒng)構(gòu)建ano3基因敲除小鼠模型方法簡(jiǎn)單易行,周期短,拿到陽(yáng)性小鼠的概率高,利用該小鼠模型可以用于研究多種疾病的致病機(jī)理,并為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)此類(lèi)疾病的治療方式提供服務(wù)。

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