本發(fā)明涉及一種基于非對(duì)稱疏水尾可電離脂質(zhì)的脂質(zhì)納米粒及其制備方法和應(yīng)用，屬于藥物遞送。

背景技術(shù)：

1、隨著rna干擾(rnai)的發(fā)現(xiàn)和小干擾rna(sirna)能瞬時(shí)誘導(dǎo)特異性信使rna(mrna)降解的證實(shí)，人們?cè)谶^(guò)去的二十年里進(jìn)行了大量的努力來(lái)利用基因沉默進(jìn)行疾病治療。sirna、mrna等核酸藥物由于能被快速化學(xué)合成并以序列依賴性方式直接作用于靶基因而成為理想的候選藥物。原則上sirna能夠靶向包括剪接變異體和突變體在內(nèi)的所有基因，這表明sirna適用于靶向不可藥物化的蛋白質(zhì)。因此，sirna對(duì)于多種疾病十分有應(yīng)用前景。

2、由于sirna是多價(jià)陰離子和高度親水性的中等大小分子，因此它幾乎不能被細(xì)胞攝取。此外，sirna容易被血液中的核酸酶降解，導(dǎo)致sirna不能在靶組織中累積。因此，建立合適的遞送載體對(duì)sirna藥物的開(kāi)發(fā)至關(guān)重要。脂質(zhì)納米粒(lnp)因其優(yōu)異的生物降解性、低毒性、結(jié)構(gòu)靈活性、生物相容性及易于大規(guī)模制備等優(yōu)點(diǎn)，已成為非病毒載體中最具臨床應(yīng)用前景的載體。lnp可以保護(hù)sirna免于降解，并確保其在循環(huán)中的穩(wěn)定性，減少免疫活化，能夠定位于靶組織，并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)遞送。lnp遞送系統(tǒng)直徑通常約為50～200nm，一般由可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)、膽固醇、磷脂和聚乙二醇(peg)-脂質(zhì)組成，可以有效地將sirna遞送到細(xì)胞質(zhì)中，參與rnai機(jī)制并隨后抑制特異性mrna翻譯。

3、可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)在基于lnp的sirna遞送中起關(guān)鍵作用。首先，在酸性條件下，脂質(zhì)帶正電荷，可將帶負(fù)電荷的核酸藥物裝載在納米顆粒內(nèi)。其次，含有可電離脂質(zhì)lnp的最佳酸解離常數(shù)(pka)為6.0～6.9，在生理ph值下總lnp表面電荷接近中性，在體內(nèi)遞送過(guò)程中毒性更低。第三，可電離脂質(zhì)在內(nèi)涵體酸性環(huán)境中(ph＝5-6)中顯示出正電荷，以便與內(nèi)源性陰離子脂質(zhì)相互作用釋放sirna進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。最后，為了有效地使內(nèi)涵體膜不穩(wěn)定并將核酸釋放到細(xì)胞膜中，脂質(zhì)必須表現(xiàn)出促進(jìn)六邊形(hii)脂質(zhì)相形成的物理形狀。因此，合理的脂質(zhì)設(shè)計(jì)與迭代篩選過(guò)程相結(jié)合，以確定烷基鏈、連接官能團(tuán)和可電離頭部基團(tuán)的最佳組合。盡管目前已經(jīng)報(bào)道了一系列可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)，但是仍然需要更高效和穩(wěn)定遞送性能的可電離脂質(zhì)化合物。高效的可電離脂質(zhì)為rna-lnp提供更好的轉(zhuǎn)染效果，同時(shí)保持低毒性。因此，本項(xiàng)目研究目標(biāo)旨在設(shè)計(jì)合成新型可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)，高效封裝遞送sirna用于疾病的治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為改善上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種式(i)所示的化合物：

2、

3、其中，

4、l1選自a1、a2、a3相同或不同，彼此獨(dú)立地不存在或者選自無(wú)取代或任選被一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)ra取代的下列基團(tuán)：亞c1-6烷基、亞c1-6烷基氧基、亞c2-6烯基、亞c3-8環(huán)烷基、亞3-8元雜環(huán)基、亞c6-10芳基、亞5-10元雜芳基、nh；每個(gè)ra相同或不同，彼此獨(dú)立地選自c1-10烷基；p和q相同或不同，彼此獨(dú)立地選自0、1、2、3、4、5或6；

5、j不存在或者選自h、

6、當(dāng)j不存在時(shí)，b2-j選自-oc(＝o)-、-c(＝o)o-；當(dāng)j為h時(shí)，b2-j選自-nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-；當(dāng)j為時(shí)，b2為n；

7、b1選自n、

8、u1、u2、g1、g2、e1、e2、j1、j2、k1、k2、q1、q2彼此獨(dú)立地選自-oc(＝o)-、-c(＝o)o-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)s-、無(wú)取代或任選被一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)rb取代的下列基團(tuán)：亞c1-6烷基、亞c1-6烷基氧基、亞c2-6烯基；每個(gè)rb相同或不同，彼此獨(dú)立地選自oh、c1-10烷基；

9、u1、u2與j1、j2不同；和/或，

10、g1、g2與k1、k2不同；和/或，

11、e1、e2與q1、q2不同；

12、n1、n2相同或不同，彼此獨(dú)立地選自2-25的數(shù)，例如3、5、7、10、12和13。

13、m1、m2相同或不同，彼此獨(dú)立地選自1-25的數(shù)，例如2、4、7、9、15、18和22。

14、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，a1、a2、a3相同或不同，彼此獨(dú)立地不存在或者選自無(wú)取代或任選被一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)ra取代的下列基團(tuán)：亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞甲氧基、亞乙氧基、亞丙氧基、o、nh、亞哌嗪基、亞苯基。

15、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，每個(gè)ra相同或不同，彼此獨(dú)立地選自c1-6烷基；例如甲基、乙基。

16、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，l1選自l-1、l-2、l-3、l-4、l-5、l-6、l-7、l-8、l-9、l-10、l-11或l-12；

17、

18、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，u1、u2相同或不同，彼此獨(dú)立地選自-ch2-、-(ch2)u-、-ch(oh)-、-ch2o-、-oc(＝o)-、-c(＝o)o-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)s-；u選自2、3、4、5、6、7、8、9或10；

19、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，j1、j2相同或不同，彼此獨(dú)立的選自-ch2-、-(ch2)u-、-ch(oh)-、-ch2o-、-oc(＝o)-、-c(＝o)o-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)s-、-ch＝ch-、-ch2-ch＝ch-；u選自2、3、4、5、6、7、8、9或10。

20、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，g1、g2相同或不同，彼此獨(dú)立地選自-ch2-、-ch(oh)-、-ch2o-、-oc(＝o)-、-c(＝o)o-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)s-、-ch＝ch-、-ch2-ch＝ch-。

21、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，e1、e2相同或不同，彼此獨(dú)立地選自-ch2-、-ch(oh)-、-ch2o-、-oc(＝o)-、-c(＝o)o-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)s-、-ch＝ch-、-ch2-ch＝ch-。

22、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，k1、k2相同或不同，彼此獨(dú)立地選自-ch2-、-ch(oh)-、-ch2o-、-oc(＝o)-、-c(＝o)o-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)s-、-ch＝ch-、-ch2-ch＝ch-、-(ch＝ch)2-、-(ch2-ch＝ch)2-。

23、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，q1、q2相同或不同，彼此獨(dú)立地選自-ch2-、-ch(oh)-、-ch2o-、-oc(＝o)-、-c(＝o)o-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)s-、-ch＝ch-、-ch2-ch＝ch-、-(ch＝ch)2-、-(ch2-ch＝ch)2-。

24、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，相同或不同，彼此獨(dú)立地選自-c8h17、

25、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，不同，彼此獨(dú)立地選自-c6h13、-c7h15、-c8h17、-c9h19、-c10h21、-c11h23、-c12h25、-c13h27、-c14h29、-c15h31、-c16h33、-c17h35、-(ch2)6-ch＝ch-(ch2)7ch3、-(ch2)6-ch＝ch-ch2-ch＝ch-(ch2)4ch3、-(ch2)6-ch＝ch-ch2-ch＝ch-ch2-ch＝ch-(ch2)2ch3、

26、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，式(i)所示化合物選自以下結(jié)構(gòu)的化合物：

27、

28、其中，l1、b1、b2、u1、u2、g1、g2、e1、e2、j1、k1、q1、n1、n2、m1彼此獨(dú)立地具有上文所述的定義。

29、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，式(i)所示化合物選自以下結(jié)構(gòu)的化合物：

30、

31、其中，j、l1、u1、u2、g1、g2、e1、e2、j1、k1、q1、n1、n2、m1彼此獨(dú)立地具有上文所述的定義。

32、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，式(i)所示化合物選自以下結(jié)構(gòu)的化合物：

33、

34、本發(fā)明提供了一種空白脂質(zhì)納米粒，包括式(i)所示的化合物、中性磷脂、甾類脂質(zhì)和聚乙二醇脂質(zhì)(peg)；

35、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述中性磷脂選自dspc、dppc、dppe、dmpe、popc、dopg、dope、pope和depc中的至少一種，優(yōu)選為二硬脂?；字Ｄ憠A(dspc)；

36、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述甾類脂質(zhì)選自燕麥甾醇、谷甾烷醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、麥角骨化醇、菜油甾醇、膽甾烷醇、膽固醇、糞甾醇、羥基膽固醇、羊毛甾醇、二氫膽固醇、二氫麥角甾醇、光甾醇、海藻甾醇、膽酸、甘氨膽酸、?；悄懰?、脫氫膽固醇、鏈甾醇、二氫麥角骨化醇、表膽甾醇、麥角甾醇、巖藻甾醇、六氫光甾醇和脫氧膽酸，優(yōu)選為膽固醇(cho)。

37、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述peg脂質(zhì)選自dspe-peg、dmg-peg、mg-peg、dag-peg、dsg-peg、dppe-peg和dma-peg至少一種，優(yōu)選為1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(dmg-peg?2000)。

38、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，式(i)所示的化合物占的摩爾分?jǐn)?shù)為15-65％，例如35-50％，如40％、43％、47％、49％；

39、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述peg脂質(zhì)占的摩爾分?jǐn)?shù)為0.1-6％，例如0.5-3.5％，如0.8％、1％、1.5％、1.7％、2.7％、3.4％；

40、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述中性磷脂占的摩爾分?jǐn)?shù)為5-25％，例如10-15％，如11％、13％、14％、15％；

41、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述甾類脂質(zhì)占的摩爾分?jǐn)?shù)為10-50％，例如30-45％，如32％、37％、39％、40％、41％、43％、45％。

42、根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案，式(i)所示的化合物、中性磷脂、甾類脂質(zhì)、peg脂質(zhì)的摩爾比為50:10:38.5:1.5。

43、本發(fā)明所述空白脂質(zhì)納米?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域常規(guī)的脂質(zhì)納米顆粒制備方法制備得到，例如高壓乳勻法、乙醇注入法、超聲分散法、微流控法等。

44、本發(fā)明還提供所述空白脂質(zhì)納米粒作為藥物載體的應(yīng)用。

45、本發(fā)明還提供一種載藥脂質(zhì)納米粒組合物，所述載藥脂質(zhì)納米粒包括所述的空白脂質(zhì)納米粒、藥學(xué)上可接受的輔料和藥物。

46、本發(fā)明所述的藥學(xué)上可接受的輔料包括佐劑、稀釋劑等。

47、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述空白脂質(zhì)納米粒與所述藥物的質(zhì)量比為(5-30):1，例如(10-20):1，優(yōu)選為10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、40:1。

48、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述藥物可以為小分子化合物、核酸、寡肽等，優(yōu)選地，所述的藥物為核酸。

49、進(jìn)一步的，核酸分子可以選自sirna、mrna、aso、質(zhì)粒和sarna中的至少一種。

50、進(jìn)一步的，所述核酸用于預(yù)防和/或治療癌癥、炎癥、纖維化疾病、自身免疫病、感染、精神性病癥、血液病、染色體疾病、遺傳病、結(jié)締組織疾病、消化性疾病、耳鼻喉疾病、內(nèi)分泌疾病、眼病、生殖性疾病、心臟病、腎病、肺病、代謝性病癥、口部疾病、肌肉骨骼疾病、新生兒篩查、營(yíng)養(yǎng)性疾病、寄生蟲(chóng)疾病、皮膚疾病等。

51、本發(fā)明還提供了所述載藥脂質(zhì)納米粒組合物用于遞送sirna至細(xì)胞或器官的應(yīng)用。

52、本發(fā)明還提供所述載藥脂質(zhì)納米粒組合物的制備方法，包括以下步驟：將所述藥物裝載于所述空白脂質(zhì)納米粒上，得到所述載藥脂質(zhì)納米粒組合物。

53、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述制備方法包括以下步驟：

54、(1)將所述藥物溶于檸檬酸鈉水溶液中，得到藥物溶液；

55、(2)將所述空白脂質(zhì)納米粒的溶液與檸檬酸鈉緩沖液混合，得到脂質(zhì)體溶液；

56、(3)將所述藥物溶液加入到所述脂質(zhì)體溶液中在適當(dāng)溫度下進(jìn)行加熱，得到所述載藥脂質(zhì)納米粒組合物。

57、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，步驟(3)中所述加熱的溫度為25℃-100℃。

58、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，步驟(3)中所述加熱的時(shí)間為10min～60min。

59、優(yōu)選地，所述加熱的溫度為50℃，加熱時(shí)間為30min。

60、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，步驟(3)中所述藥物溶液與所述脂質(zhì)體溶液的體積比為1:(0.5-5)，例如1:(0.8-3)，優(yōu)選為1:1。

61、有益效果

62、1.本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了一種式(i)所示的新型非對(duì)稱可電離脂質(zhì)；

63、2.本發(fā)明基于上述非對(duì)稱可電離脂質(zhì)制備的空白脂質(zhì)納米?？勺鳛樗幬镙d體，該脂質(zhì)納米粒具有均一粒徑、高載藥量和低毒性，在內(nèi)涵體中可電離，具有優(yōu)異的內(nèi)涵體逃逸效果。與上市可電離脂質(zhì)mc3或商品化轉(zhuǎn)染試劑lipo2000相比，具有更高的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率。