本發(fā)明涉及一種lasiodiplodiairanensis菌及其發(fā)酵產(chǎn)茉莉酸的方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：茉莉酸化學(xué)名稱3-氧-2-2′-順-戊烯基-環(huán)戊烷-1-乙酸，分子式c12h18o3，分子量210.27。是一種新型的植物激素，在植物的花、莖、葉、根等組織與器官中普遍存在，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。同時(shí)作為第二信號(hào)，在植物受到生物與非生物的傷害時(shí)誘導(dǎo)激活植物體內(nèi)的防御基因，抵御外界的傷害。并且因茉莉酸及其甲酯具有清淡、幽雅的香味，所以其可作為很多香花精油主香的成分，廣泛的應(yīng)用于香料業(yè)的產(chǎn)生中。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，茉莉酸類物質(zhì)能明顯的促進(jìn)不育植株開(kāi)花還可以用來(lái)提高植物的抗旱性，同時(shí)茉莉酸類物質(zhì)可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生有毒物質(zhì)、害蟲蛋白酶抑制劑等來(lái)達(dá)到抗蟲害的效果，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可以用其來(lái)代替部分殺蟲劑。目前茉莉酸的制備方法主要有三種，從植物中提取、化學(xué)合成及微生物發(fā)酵法。植物中茉莉酸含量在1-9～10-6g/g，因此，從植物中提取的量少，滿足不了當(dāng)前的需求。化學(xué)法根據(jù)起始原料不同，分為順-4-庚烯酸為起始原料、乙酸乙酯為起起始原料、及2-環(huán)戊烯-1-乙二醇縮酮和2-甲基-1,3-丁二烯為起始原料的方法，但這些方法的反應(yīng)收率不高(30％以下)，反應(yīng)條件苛刻，并且合成的茉莉酸都是外消旋物，限制了其使用的范圍。微生物發(fā)酵法是通過(guò)真菌發(fā)酵生產(chǎn)茉莉酸。aldridge等最早從真菌可可毛色二孢lasiodiplodiatheobroma培養(yǎng)液中分離出游離的茉莉酸(j.chemsocchemcoummum.1971,13:1623),這說(shuō)明某些微生物具有分泌茉莉酸的可能。美國(guó)專利us20020110881a1公開(kāi)了棉色二孢(diplodiagossypina)發(fā)酵產(chǎn)茉莉酸、茉莉酸甲酯及茉莉酸異構(gòu)體的方法，其中，d.gossypinaatcc10936產(chǎn)茉莉酸濃度可達(dá)1.2g/l。國(guó)內(nèi)，韓曉敏等為檢測(cè)可可毛色二孢菌對(duì)白木香產(chǎn)生倍半萜的誘導(dǎo)作用，采用氣質(zhì)聯(lián)用在其pda培養(yǎng)液中檢測(cè)到茉莉酸類化合物(中國(guó)中醫(yī)藥雜志，2014，39(2)：192-196)，但其中茉莉酸甲酯含量不高(250mg/l)，同時(shí)沒(méi)有進(jìn)行相關(guān)發(fā)酵生產(chǎn)方面的研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一株lasiodiplodiairanensisdwh-2，可以產(chǎn)生茉莉酸。本發(fā)明對(duì)變質(zhì)果蔬及玉蕊、拉貢木、海桑、水黃皮、玉米、棉花等植物的腐爛部位上的微生物進(jìn)行分離，篩選得到分泌茉莉酸的菌株dwh-2，經(jīng)分子鑒定屬于一株l.iranensis菌，其產(chǎn)量明顯高于一般野生菌株，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)一步提高了產(chǎn)物濃度。所述l.iranensisdwh-2已于2017年5月27日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno：m2017288。所述dwh-2的活化培養(yǎng)，可將菌株接于pda平板上，放置在25～28℃的培養(yǎng)箱中活化4～5天。所述dwh-2在pda平板上，菌落生長(zhǎng)初期為白色，且日生長(zhǎng)量較快，生長(zhǎng)到第四天時(shí)平板背面開(kāi)始出現(xiàn)綠色，生長(zhǎng)到第六天時(shí)培養(yǎng)基開(kāi)始變成黑色，生長(zhǎng)到第九天時(shí)培養(yǎng)基完全變成黑色。在電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)該菌的菌絲體有橫隔，且為多核。所述dwh-2的its基因序列與多株l.iranensis的its基因序列相似性達(dá)99％～100％，但這些l.iranensis都沒(méi)有關(guān)于產(chǎn)茉莉酸的報(bào)道。本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種應(yīng)用所述l.iranensisdwh-2發(fā)酵產(chǎn)茉莉酸的方法。應(yīng)用所述l.iranensisdwh-2發(fā)酵產(chǎn)茉莉酸，是在靜止培養(yǎng)狀態(tài)下進(jìn)行。包括在20～30℃，靜止發(fā)酵培養(yǎng)6～10天。用于所述l.iranensisdwh-2發(fā)酵產(chǎn)茉莉酸的發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源包括蔗糖、淀粉、麥芽糖、葡萄糖、果糖中的一種或幾種的混合。碳源濃度為25～500g/l。用于所述l.iranensisdwh-2發(fā)酵產(chǎn)茉莉酸的發(fā)酵培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)氮源包括硝酸鈉、尿素、硝酸銨中的一種或幾種的混合。無(wú)機(jī)氮源濃度為3～15g/l。用于所述l.iranensisdwh-2發(fā)酵產(chǎn)茉莉酸的發(fā)酵培養(yǎng)基的有機(jī)氮源包括牛肉膏、蛋白胨、玉米漿、酵母膏、麥芽提取物中的一種或幾種的混合。有機(jī)氮源濃度為3～15g/l。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，用于所述l.iranensisdwh-2發(fā)酵產(chǎn)茉莉酸的發(fā)酵培養(yǎng)基是蔗糖25～500g/l，硝酸鈉1～15g/l，磷酸二氫鉀0.5～3g/l，氯化鉀0.1～0.4g/l，七水硫酸鎂1～9g/l，七水硫酸鐵0.1～0.9g/l，玉米漿1～5g/l，0.2-20g/l大豆油，微量元素10～12ml/l，ph4.5～8；所述微量元素：七水硫酸鐵0.01～0.04g/l，七水硫酸錳0.001～0.004g/l，七水硫酸銅0.001～0.004g/l，二水合鉬酸鈉0.001～0.004g/l。在應(yīng)用l.iranensisdwh-2發(fā)酵產(chǎn)茉莉酸的過(guò)程中，還可以向發(fā)酵體系中添加大孔樹(shù)脂。大孔樹(shù)脂的型號(hào)包括xad-1、xad-2、xad-7hp、ab-8、d101。用量為5～20g/100ml。應(yīng)用本發(fā)明提供的l.iranensisdwh-2發(fā)酵產(chǎn)茉莉酸，茉莉酸的產(chǎn)量可達(dá)到1760mg/l。生物材料保藏lasiodiplodiairanensisdwh-2，已于2017年5月27日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno：m2017288，保藏地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)。附圖說(shuō)明圖1tlc產(chǎn)物初步鑒定圖圖2產(chǎn)物鑒定gc-ms圖圖3菌株dwh-2的進(jìn)化樹(shù)具體實(shí)施方式產(chǎn)物分析方法：采用薄層層析(tlc)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行初步定性。參照文獻(xiàn)方法，所用的薄層板為gf254，展開(kāi)劑為：正己烷：乙酸乙酯：醋酸＝60：40：1，顯色劑為濃硫酸：甲醇＝1：1用氣質(zhì)聯(lián)用(gc-ms)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。參照文獻(xiàn)方法。氣質(zhì)條件：氣相色譜柱ab--5ms30m×0.25mm×0.25μm，載氣為氦氣，壓力為130kg/cm2，分表壓力為0.31kg/cm2，流速0.8ml/min。色譜柱采用程序升溫，從起始溫度50℃以20℃/min升至180℃后保持4min，再以10℃/min升至290℃后保持15min，250℃進(jìn)樣，不分流，進(jìn)樣體積1μl。用hplc(高效液相色譜)對(duì)產(chǎn)物的濃度進(jìn)行檢測(cè)，參照文獻(xiàn)方法。流動(dòng)相為甲醇：水：磷酸＝55:44.9：0.1；進(jìn)樣量10～30ul；流速1ml/min；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器。實(shí)施例1產(chǎn)茉莉酸菌株的篩選與確定發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖25～500g/l，硝酸鈉1～15g/l，磷酸二氫鉀0.5～3g/l，氯化鉀0.1～0.4g/l，七水硫酸鎂1～9g/l，七水硫酸鐵0.1～0.9g/l，玉米漿1～5g/l，0.2-20g/l大豆油，微量元素10～12ml/l，ph4.5～8。所述微量元素：七水硫酸鐵0.01～0.04g/l，七水硫酸錳0.001～0.004g/l，七水硫酸銅0.001～0.004g/l，二水合鉬酸鈉0.001～0.004g/l。以腐爛的水果及玉蕊、拉貢木、海桑、水黃皮、玉米、棉花等植物的腐爛部位為篩菌材料，將其處理好稀釋涂布在pda平板，25℃～30℃培養(yǎng)4～7天。用打孔器將長(zhǎng)出的菌接于500ml裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，靜止放置在20～30℃的培養(yǎng)箱中發(fā)酵6～10天。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液離心后取上清液，用6mol/l的鹽酸將其ph調(diào)至3～4左右，再用0.5～5倍發(fā)酵液體積的乙酸乙酯萃取，萃取結(jié)束后用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將乙酸乙酯蒸除，產(chǎn)物溶于甲醇中。用tlc(薄層層析)進(jìn)行初步的定性檢測(cè)，將有紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)的發(fā)酵液(圖1)進(jìn)行hplc進(jìn)一步的檢測(cè)，觀察是否有與標(biāo)樣出峰時(shí)間相同的峰出現(xiàn)。與標(biāo)樣出峰時(shí)間相同的樣品用gc-ms(氣質(zhì)聯(lián)用)進(jìn)行鑒定，并用hplc(高效液相色譜)進(jìn)行產(chǎn)物的濃度測(cè)定，gc-ms圖見(jiàn)附圖2。經(jīng)篩選，獲得一株可以產(chǎn)茉莉酸的菌株dwh-2，產(chǎn)茉莉酸的濃度達(dá)到320mg/l發(fā)酵液。將dwh-2在pda平板上培養(yǎng)后進(jìn)行its測(cè)序，測(cè)得its基因序列(seqidno:1)與lasiodiplodiairanensis的its基因序列相似性達(dá)100％。dwh-2在pda平板上，菌落生長(zhǎng)初期為白色，且日生長(zhǎng)量較快，生長(zhǎng)到第四天時(shí)平板背面開(kāi)始出現(xiàn)綠色，生長(zhǎng)到第六天時(shí)培養(yǎng)基開(kāi)始變成黑色，生長(zhǎng)到第九天時(shí)培養(yǎng)基完全變成黑色。在電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)該菌的菌絲體有橫隔，且為多核。因此，經(jīng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定，dwh-2為lasiodiplodiairanensis。實(shí)施例2培養(yǎng)方式對(duì)菌株產(chǎn)茉莉酸的影響發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖25～500g/l，硝酸鈉1～15g/l，磷酸二氫鉀0.5～3g/l，氯化鉀0.1～0.4g/l，七水硫酸鎂1～9g/l，七水硫酸鐵0.1～0.9g/l，玉米漿1～5g/l，0.2-20g/l大豆油，微量元素10～12ml/l，ph4.5～8。微量元素：七水硫酸鐵0.01～0.04g/l，七水硫酸錳0.001～0.004g/l，七水硫酸銅0.001～0.004g/l，二水合鉬酸鈉0.001～0.004g/l。用打孔器將長(zhǎng)出的菌接于500ml裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，于25～3℃的培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)6～10天，在培養(yǎng)的過(guò)程中設(shè)置三種不同的培養(yǎng)方式，靜止培養(yǎng)、往復(fù)式搖床培養(yǎng)及旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)。發(fā)酵上清液用hplc測(cè)產(chǎn)物的濃度，結(jié)果如表1。表1培養(yǎng)方式對(duì)菌株產(chǎn)茉莉酸的影響培養(yǎng)方式產(chǎn)物濃度(mg/l)靜置培養(yǎng)342往復(fù)式搖床56旋轉(zhuǎn)式搖床62實(shí)施例3不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)茉莉酸的影響按實(shí)施例2的方法對(duì)dwh-2進(jìn)行靜止培養(yǎng)，其中發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源(50g/l)分別為蔗糖、乳糖、淀粉、麥芽糖、葡萄糖、果糖，在培養(yǎng)箱中25～30℃靜止培養(yǎng)6～10天，發(fā)酵上清液用hplc測(cè)產(chǎn)物的濃度，結(jié)果如表2。表2不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)茉莉酸的影響碳源產(chǎn)物濃度(mg/l)蔗糖314乳糖31淀粉140麥芽糖258葡萄糖199果糖102實(shí)施例4碳源不同濃度對(duì)菌株產(chǎn)茉莉酸的影響同實(shí)施例2方法，其中發(fā)酵培養(yǎng)基以蔗糖為唯一碳源，且設(shè)置蔗糖的濃度分別為25g/l、50g/l、75g/l、100g/l、125g/l、150g/l，300g/l，500g/l在培養(yǎng)箱中25～30℃靜止培養(yǎng)6～10天。hplc測(cè)發(fā)酵液中的產(chǎn)物的濃度，結(jié)果如表3。表3碳源不同濃度對(duì)產(chǎn)茉莉酸的影響蔗糖濃度(g/l)產(chǎn)物濃度(mg/l)253105051775267100238125177150185300189500201實(shí)施例5無(wú)機(jī)氮源對(duì)菌株產(chǎn)茉莉酸的影響按實(shí)施例2的方法，其中，發(fā)酵培養(yǎng)基以蔗糖為唯一碳源，無(wú)機(jī)氮源分別為硝酸鈉、尿素、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨，在培養(yǎng)箱中25～30℃靜止培養(yǎng)6～10天。hplc測(cè)產(chǎn)物的濃度如表4。表4無(wú)機(jī)氮源對(duì)產(chǎn)茉莉酸的影響無(wú)機(jī)氮源產(chǎn)物濃度(mg/l)硝酸鈉224尿素116硝酸銨3.6氯化銨0.503硫酸銨0.45實(shí)施例6無(wú)機(jī)氮濃度對(duì)菌株產(chǎn)茉莉酸的影響按實(shí)施例2的方法，其中發(fā)酵培養(yǎng)基以蔗糖為唯一碳源，無(wú)機(jī)氮源為硝酸鈉，設(shè)置硝酸鈉的濃度為3g/l、4.5g/l、6g/l、7.5g/l、9g/l、10.5g/l，15g/l在培養(yǎng)箱中25～30℃靜止培養(yǎng)6～10天。hplc測(cè)產(chǎn)物的濃度如表5。表5無(wú)機(jī)氮濃度對(duì)產(chǎn)茉莉酸的影響硝酸鈉濃度(g/l)產(chǎn)物濃度(mg/l)37934.580567097.5447.49660.410.5399.515380.9實(shí)施例7有機(jī)氮源對(duì)菌株產(chǎn)茉莉酸的影響按實(shí)施例2的方法，其中發(fā)酵培養(yǎng)基以蔗糖為唯一碳源，無(wú)機(jī)氮源為硝酸鈉，有機(jī)氮源為牛肉膏、蛋白胨、玉米漿、酵母膏、麥芽提取物，在培養(yǎng)箱中25～30℃靜止培養(yǎng)6～10天。hplc測(cè)產(chǎn)物的濃度如表6。表6有機(jī)氮源種類對(duì)菌株產(chǎn)茉莉酸的影響有機(jī)氮種類產(chǎn)物濃度(mg/l)牛肉膏849蛋白胨475玉米漿850酵母膏702麥芽提取物294實(shí)施例8大孔樹(shù)脂對(duì)對(duì)菌株產(chǎn)茉莉酸的影響按實(shí)施例2的方法，在接種后培養(yǎng)第3-5天時(shí)，向培養(yǎng)基中加入滅過(guò)菌的xad-1、xad-2、xad-7hp、ab-8、d101，5～20％(w/v)，吸附部分產(chǎn)物，避免當(dāng)培養(yǎng)液中產(chǎn)物濃度達(dá)到一定后，不再增加反而會(huì)分解。發(fā)酵結(jié)束后，分離樹(shù)脂和上清液，用乙酸乙酯洗脫，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除乙酸乙酯。hplc測(cè)產(chǎn)物的濃度如表7。表7大孔樹(shù)脂對(duì)菌株產(chǎn)茉莉酸的影響樹(shù)脂類型產(chǎn)物濃度(mg/l)xad-11210xad-21760xad-7hp1527ab-81760d1011720雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。sequencelisting<110>江南大學(xué)<120>一種lasiodiplodiairanensis菌及其發(fā)酵產(chǎn)茉莉酸的方法<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>519<212>dna<213>lasiodiplodiairanensis<400>1cctgcggaaggatcattaccgagttttcgggcttcggctcgactctcccaccctttgtga60acgtacctctgttgctttggcggctccggccgccaaaggacctccaaactccagtcagta120aacgcagacgtctgataaacaagttaataaactaaaactttcaacaacggatctcttggt180tctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagt240gaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccttggtattccggggggcatgcctgtt300cgagcgtcattacaaccctcaagctctgcttggaattgggcaccgtcctcactgcggacg360cgcctcaaagacctcggcggtggctgttcagccctcaagcgtagtagaatacacctcgct420ttggagtggttggcgtcgcccgccggacgaaccttctgaacttttctcaaggttgacctc480ggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaa519當(dāng)前第1頁(yè)12