本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種基于crispr-cas9系統(tǒng)的小麥基因組編輯載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：自上世紀(jì)80年代末，基于人工核酸內(nèi)切酶的基因修飾技術(shù)開始發(fā)展，目前主要包括：第一代人工核酸內(nèi)切酶鋅指核酸酶(zfn)技術(shù)、第二代人工核酸內(nèi)切酶轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)物核酸酶(talen)技術(shù)、第三代人工核酸內(nèi)切酶crispr-cas9核酸酶技術(shù)。zfn技術(shù)特異識別能力差，容易出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象，引起其他目的基因突變和染色體畸變。此外，zfn的設(shè)計篩選耗時費力，成本高，因此限制了其更加廣泛的應(yīng)用。talen相對zfn技術(shù)脫靶幾率小，細(xì)胞毒性小，一度得到廣泛的應(yīng)用。作為新興的基因編輯技術(shù)，crispr-cas9具有無可比擬的優(yōu)點:1.靶向精確性更高。rna靶向序列和基因組序列必須完全匹配，cas9才會對dna進(jìn)行剪切。2.可實現(xiàn)對靶基因多個位點同時敲除。3.實驗周期短，效率高。4.靶點多，無物種限制。小麥?zhǔn)怯蒩、b、d三套基因組組成的異源六倍體，基因的平均拷貝數(shù)為2.8個，其中接近一半的基因(46％)有3-4個拷貝，12％的基因有1-2個拷貝，42％的基因拷貝數(shù)≥5個，因此迫切需要在小麥中建立重組酶介導(dǎo)的基因疊加轉(zhuǎn)基因操作系統(tǒng)，實現(xiàn)dna疊加/刪除，并利用該系統(tǒng)，在小麥中開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的目標(biāo)株系。與傳統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)zfn和talen相比，利用crispr-cas9定點突變，成本更低，更易于操作，效率更高，更容易得到純合子突變體，對小麥基因功能的研究具有重要意義。中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞實驗室從事植物基因組定點編輯技術(shù)研究，已在二穗短柄草、水稻等植物物種中建立了talen核酸酶介導(dǎo)的基因定點突變技術(shù)體系。2014年該實驗室利用crispr-cas9系統(tǒng)實現(xiàn)tamlo-a在面包小麥原生質(zhì)體和轉(zhuǎn)基因植株中的定點突變。crispr-cas9基因編輯系統(tǒng)的載體均含有兩個表達(dá)框——sgrna表達(dá)框和cas9表達(dá)框，cas9表達(dá)框表達(dá)的cas9基因編碼一種核酸酶，sgrna表達(dá)框表達(dá)的帶有靶序列的sgrna，引導(dǎo)cas9核酸酶在基因組上靶序列的位置對dna雙鏈進(jìn)行剪切。cas9基因和sgrna的表達(dá)水平以及sgrna的序列結(jié)構(gòu)，都會影響基因編輯效率。本發(fā)明基于以上技術(shù)背景，通過比較crispr-cas9系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化載體，采用不同cas9啟動子、不同sgrna啟動子和不同sgrna序列結(jié)構(gòu)時的基因編輯效率，獲得了在小麥中編輯效率更高的crispr-cas9轉(zhuǎn)化載體。此優(yōu)化載體顯著提高了小麥作物利用crispr-cas9進(jìn)行基因編輯的效率，克服了小麥等作物中crispr-cas9載體轉(zhuǎn)化后突變率低、獲得crispr-cas9轉(zhuǎn)基因突變株系難的問題，節(jié)約了轉(zhuǎn)化時間，減少了轉(zhuǎn)化成本，對crispr-cas9基因編輯系統(tǒng)在作物中的推廣應(yīng)用奠定了更好的基礎(chǔ)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本文提到的所有參考文獻(xiàn)都通過引用并入本文。除非有相反指明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。材料、方法和例子僅作闡述用，而非加以限制。本發(fā)明提供了一種基因編輯效率更高的crispr-cas9基因編輯系統(tǒng)，可以廣泛的應(yīng)用于不同的作物，所述作物包括但不限于玉米、小麥、油菜、水稻、高粱、大豆、大麥和谷子等。為了提高作物中的基因編輯效率，本發(fā)明對crispr-cas9系統(tǒng)中的sgrna序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造和優(yōu)化，改造后的sgrna結(jié)構(gòu)命名為sgrna4tmc+5，其核苷酸序列如seqidno:20所示。實驗發(fā)現(xiàn)，sgrna結(jié)構(gòu)為sgrna4tmc+5(seqidno:20)結(jié)構(gòu)的crrispr/cas9系統(tǒng)在轉(zhuǎn)入小麥植株后，其基因編輯效率優(yōu)于傳統(tǒng)的sgrna結(jié)構(gòu)和trna–grna結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明所提供的crispr-cas9基因編輯載體中，sgrna4tmc+5結(jié)構(gòu)前還連有一個啟動子，所述啟動子包括但不限于tau3p、osu3p、tau6和osu6bp等啟動子,優(yōu)先為tau3啟動子。上述crispr-cas9基因編輯系統(tǒng)還包含一個cas9基因，所述cas9基因的核苷酸序列如seqidno:5所示。更具體的，所述cas9基因的前面可操作性連接有一個啟動子驅(qū)動其表達(dá)，所述啟動子包括但不限于ubi和2*35s啟動子，優(yōu)選為ubi啟動子。本發(fā)明還提供了一種植物基因的crispr-cas9編輯方法，所述方法中sgrna結(jié)構(gòu)為sgrna4tmc+5，其核苷酸序列如seqidno:20所示。本發(fā)明所提供的crispr-cas9基因編輯方法中，sgrna4tmc+5結(jié)構(gòu)前還連有一個啟動子，所述啟動子包括但不限于tau3p、osu3p、tau6和osu6bp等啟動子,優(yōu)先為tau3啟動子。具體的，crispr-cas9基因編輯方法還包含一個cas9基因，所述cas9基因的核苷酸序列如seqidno:5所示。更具體的，所述cas9基因的前面可操作性連接有一個啟動子驅(qū)動其表達(dá)，所述啟動子包括但不限于ubi和2*35s啟動子，優(yōu)選為ubi啟動子。本發(fā)明所提供的crispr-cas9基因編輯載體和方法，可以應(yīng)用于對不同植物的基因組dna進(jìn)行編輯，所述編輯包括但不限于通過該系統(tǒng)使得植物基因組dna出現(xiàn)堿基缺失或插入；還包括可以應(yīng)用于條件性基因敲除、基因敲入、基因替換、點突變等領(lǐng)域。本發(fā)明還提供了一種獲得小麥抗白粉病突變體的方法，所述方法采用crispr-cas9基因編輯方法，其特征在于所述基因編輯系統(tǒng)的靶標(biāo)序列如seqidno:2所示。本發(fā)明所提供的獲得小麥抗白粉病突變體的方法，其中所述的crispr-cas9基因編輯方法中的sgrna結(jié)構(gòu)為sgrna4tmc+5結(jié)構(gòu)，所述sgrna4tmc+5結(jié)構(gòu)的核苷酸序列如seqidno:20所示。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所提供的crispr-cas9基因編輯方法和載體的優(yōu)點是：顯著提高麥crispr-cas9的編輯效率，克服小麥crispr-cas9載體轉(zhuǎn)化后突變率低、獲得crispr-cas9轉(zhuǎn)基因突變株系難的問題，節(jié)約了轉(zhuǎn)化時間，減少了轉(zhuǎn)化成本。附圖說明圖1為p286和p294載體結(jié)構(gòu)示意圖。tamlo-a為小麥tamlo-a基因上的靶序列，sgrna為singleguiderna編碼序列，amp為載體氨芐青霉素抗性位點。圖2為p286和p294載體基因編輯效率比較結(jié)果圖。plasmid為質(zhì)粒示意，draii為限制性內(nèi)切酶，“+/-”分別為加入/未加入draⅱ內(nèi)切酶，mutationrate為突變效率。圖3為p342、p338、p295和p341載體結(jié)構(gòu)示意圖。l475小麥基因組上的靶序列，sgrna為singleguiderna編碼序列，amp為載體氨芐青霉素抗性位點。圖4為p342、p338、p295和p341載體基因編輯效率比較結(jié)果圖。plasmid為質(zhì)粒示意，bani為限制性內(nèi)切酶，“+/-”分別為加入/未加入bani內(nèi)切酶，mutationrate為突變效率。圖5為p345和p349載體結(jié)構(gòu)示意圖。l475小麥基因組上的靶序列，sgrna為singleguiderna編碼序列，sgrna4tmc+5為優(yōu)化的singleguiderna編碼序列，trna為trnagly編碼序列，amp為載體氨芐青霉素抗性位點。圖6為p342，p345和p349載體基因編輯效率比較結(jié)果圖。plasmid為質(zhì)粒示意，bani為限制性內(nèi)切酶，“+/-”分別為加入/未加入bani內(nèi)切酶，mutationrate為突變效率。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。本發(fā)明中若無特別說明，原料均可市購獲得，方法為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。實施例一：選擇用于驅(qū)動cas9基因的啟動子本實驗以小麥白粉病基因tamlo-a基因上的一段核苷酸序列作為靶序列，通過比較不同啟動子驅(qū)動cas9基因表達(dá)時crispr-cas9系統(tǒng)載體的基因編輯效率，優(yōu)化crispr-cas9系統(tǒng)的載體。1.載體說明p286載體和p294載體均包含兩個表達(dá)框——sgrna表達(dá)框和cas9表達(dá)框，其差別在于cas9表達(dá)框的啟動子不同，p286載體采用2*35s啟動子驅(qū)動cas9基因的表達(dá)，p294載體采用ubi啟動子驅(qū)動cas9基因的表達(dá)。具體地講：p286載體包括tau6p::tamlo-a-sgrna表達(dá)框和2*35s::cas9表達(dá)框。tau6p::tamlo-a-sgrna表達(dá)框元件包括tau6p啟動子(seqidno:1)、tamlo-a基因上的靶序列(seqidno:2)和sgrnascaffold(seqidno:3)；tau6p啟動子來源于小麥cb037，tamlo-a基因上的靶序列和sgrnascaffold為根據(jù)文章公布序列人工合成片段。2*35s::cas9表達(dá)框包括2*35s啟動子(seqidno:4)、cas9片段(seqidno:5)和camv終止子(seqidno:6)；2*35s啟動子和camv終止子分別來源于質(zhì)粒pgigi和plgz2，cas9為根據(jù)文章公布序列人工合成片段(yanpengwang,xicheng,qiweishan,yizhang,jinxingliu,caixiagao&jin-longqiu.simultaneouseditingofthreehomoeoallelesinhexaploidbreadwheatconfersheritableresistancetopowderymildew.nat.biotech.2014,32:947-951)。p286載體結(jié)構(gòu)見圖1a。p294載體包括tau6p::tamlo-a-sgrna和ubi::cas9兩個表達(dá)框。tau6p::tamlo-a-sgrna表達(dá)框如前所述，ubi::cas9表達(dá)框包括ubi啟動子(seqidno:7)、cas9基因(seqidno:5)和camv終止子(seqidno:6)，ubi啟動子來源于小麥基因槍常規(guī)轉(zhuǎn)化載體pahc20。p294載體結(jié)構(gòu)見圖1b。2.不同載體的基因編輯效率比較利用peg法將p286、p294、gfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)化小麥葉片原生質(zhì)體，gfp質(zhì)粒作為原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的陽性對照和基因編輯的陰性對照。24℃培養(yǎng)48小時后，收集原生質(zhì)體。利用pcr/re(polymerasechainreaction/restrictiondigestion)方法對不同質(zhì)粒的基因編輯效率進(jìn)行檢測和比較。首先，提取原生質(zhì)體的基因組dna，擴(kuò)增tamlo-a片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增目的條帶單一。擴(kuò)增引物如下：p1：5’-tggcgctggtcttcgccgtcatgatcatcgtc-3’(seqidno:8)p2：5’-tacgatgagcgccaccttgcccgggaa-3’(seqidno:9)然后，利用限制性內(nèi)切酶draii(靶序列中包含的限制性酶切位點)對pcr產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并電泳檢測。結(jié)果如圖2所示：作為基因編輯陰性對照的gfp樣品，其pcr產(chǎn)物被完全酶切開，而轉(zhuǎn)化p286和p294質(zhì)粒的pcr產(chǎn)物不能被完全切開。通過imagej軟件計算未切開dna片段占酶切總dna量的百分比，即該樣品的突變效率。經(jīng)計算，p286樣品的突變率為2.6％，p294樣品的突變率為7.6％，p294樣品突變效率高于p286樣品，因此在小麥crispr-cas9轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，ubi-cas9編輯效率優(yōu)于2*35scas9。說明在針對小麥的crispr-cas9基因編輯系統(tǒng)中，用ubi啟動子驅(qū)動cas9表達(dá)，可以提高crispr-cas9基因編輯系統(tǒng)的編輯效率。實施例二選擇用于驅(qū)動sgrna表達(dá)的啟動子為了進(jìn)一步提高小麥crispr-cas9的編輯效率，我們在小麥原生質(zhì)體體系中比較了不同snorna啟動子驅(qū)動sgrna表達(dá)時，crispr-cas9載體對小麥基因組序列的編輯效率。目前植物中常用于驅(qū)動sgrna表達(dá)的snorna啟動子有tau3p(seqidno:10)、osu3p(seqidno:11)、tau6(seqidno:1)和osu6bp(seqidno:12)，也是本實驗重點比較的幾個啟動子。1.載體說明p342載體(圖3a)、p338載體(圖3b)、p295載體(圖3c)和p341載體(圖3d)均包含兩個表達(dá)框——sgrna表達(dá)框和cas9表達(dá)框。cas9表達(dá)框均包括ubi啟動子(seqidno:7)、cas9片段(seqidno:5)和camv終止子(seqidno:6)，靶序列均為小麥基因組序列l(wèi)475(seqidno:13)，其差別在于驅(qū)動sgrna表達(dá)的啟動子不同。p343載體用的是tau3啟動子(seqidno:10)，來源于中國春小麥；p339載體用的是osu3啟動子(seqidno:11)，來源于水稻中花11；p340載體用的是tau6啟動子(seqidno:1)，來源于小麥cb037；p333載體用的是osu6b啟動子(seqidno:12)，來源于日本晴水稻。2.不同載體的基因編輯效率比較利用peg法將p342、p338、p295、p341和gfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)化小麥葉片原生質(zhì)體，gfp質(zhì)粒作為原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的陽性對照和基因編輯的陰性對照。24℃培養(yǎng)48小時后，收集原生質(zhì)體。利用pcr/re(polymerasechainreaction/restrictiondigestion)方法對不同質(zhì)粒的基因編輯效率進(jìn)行檢測和比較，具體步驟如下：首先，提取原生質(zhì)體的基因組dna，擴(kuò)增包含靶序列l(wèi)475的dna片段。由于小麥?zhǔn)怯蒩、b、d三套基因組組成的異源六倍體，三套基因組均包含靶序列l(wèi)475(seqidno.13)，因此需要分別擴(kuò)增三套基因組中包含靶序列l(wèi)475的dna片段——l475a、l475b和l475d。擴(kuò)增引物如下：p3：5’-ttcggggttttgcatgtcagctagtacggag-3’(seqidno:14)p4：5’-gtggacacgaaccgctgc-3’(seqidno:15)p5：5’-gacgctgtgatgatcaatggtgccgtg-3’(seqidno:16)p6：5’-agcgcgtccgtgaagtgctcctggttc-3’(seqidno:17)p7：5’-gacgctgtgatgaccaatggtgccatac-3’(seqidno:18)p8：5’-cgacgtgtcggccagcgca-3’(seqidno:19)其中p3和p4用于l475a的擴(kuò)增，p5和p6用于l475b的擴(kuò)增，p7和p8用于l475d的擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增目的條帶均單一。然后，利用限制性內(nèi)切酶bani(靶序列中包含的限制性酶切位點)對pcr產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并電泳檢測。結(jié)果如圖4所示：作為基因編輯陰性對照的gfp樣品，其pcr產(chǎn)物被完全酶切開，而轉(zhuǎn)化p342、p338、p295和p341質(zhì)粒的pcr產(chǎn)物不能被完全切開。通過imagej軟件計算未切開dna片段占酶切總dna量的百分比，即該樣品的突變效率。經(jīng)計算，l475a的突變率依次為10.4％、4.5％、0.2％、4.6％；l475b的突變率依次為11.3％、4.2％、0、3.0％；l475d的突變率依次為9.1％、3.0％、0.3％、3.6％。說明在針對小麥的crispr-cas9基因編輯系統(tǒng)中，用tau3啟動子驅(qū)動sgrna的表達(dá)，可以進(jìn)一步提高crispr-cas9基因編輯系統(tǒng)的編輯效率。實施例三sgrna不同序列結(jié)構(gòu)的篩選在水稻crrispr-cas9基因編輯系統(tǒng)的研究中，利用trna轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)表達(dá)sgrna，可以提高sgrna的表達(dá)了，從而提高crrispr-cas9的基因編輯效率；而在人類細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，crispr-cas9系統(tǒng)采用不同sgrna序列結(jié)構(gòu)時的基因編輯效率差別非常大。在小麥中，還沒有關(guān)于sgrna表達(dá)方式及其序列結(jié)構(gòu)對基因編輯效率影響的研究和報道。為了進(jìn)一步優(yōu)化小麥crispr-cas9系統(tǒng)的載體，提高對小麥基因組序列的編輯效率，我們以小麥基因組序列l(wèi)475作為靶序列(seqidno:13),對含有不同sgrna序列結(jié)構(gòu)的crispr-cas9載體的基因編輯效率進(jìn)行了比較。1.載體說明p342載體(圖3a)、p345載體(圖5a)和p349載體(圖5b)和p341載體(圖3d)均包含兩個表達(dá)框——sgrna表達(dá)框和cas9表達(dá)框。cas9表達(dá)框均包括ubi啟動子(seqidno:7)、cas9片段(seqidno:5)和camv終止子(seqidno:6)，靶序列均為小麥基因組序列l(wèi)475(seqidno.13)，驅(qū)動sgrna表達(dá)的啟動子均為tau3啟動子，其區(qū)別在于sgrna的序列結(jié)構(gòu)不同。p342載體中的sgrna為目前最常用的sgrna序列(seqidno：3)；p345載體中的sgrna為sgrna4tmc+5(seqidno:20，人工合成)；p349載體中的sgrna前面加了trna(seqidno:21，來源于中國春小麥),靶序列位于trna和sgrna之間。2.不同載體的基因編輯效率比較利用peg法將p342、p345、p349和gfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)化小麥葉片原生質(zhì)體，gfp質(zhì)粒作為原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的陽性對照和基因編輯的陰性對照。24℃培養(yǎng)48小時后，收集原生質(zhì)體。利用pcr/re(polymerasechainreaction/restrictiondigestion)方法對不同質(zhì)粒的基因編輯效率進(jìn)行檢測和比較，具體步驟如下：首先，提取原生質(zhì)體的基因組dna，擴(kuò)增包含靶序列l(wèi)475的dna片段。由于小麥?zhǔn)怯蒩、b、d三套基因組組成的異源六倍體，三套基因組均包含靶序列l(wèi)475，因此需要分別擴(kuò)增三套基因組中包含靶序列l(wèi)475的dna片段——l475a、l475b和l475d。擴(kuò)增引物同實施例二，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增目的條帶均單一。然后，利用限制性內(nèi)切酶bani(靶序列中包含的限制性酶切位點)對pcr產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并電泳檢測。結(jié)果如圖6所示：作為基因編輯陰性對照的gfp樣品，其pcr產(chǎn)物被完全酶切開，而轉(zhuǎn)化p342、p345和p349質(zhì)粒的pcr產(chǎn)物不能被完全切開。通過imagej軟件計算未切開dna片段占酶切總dna量的百分比，即該樣品的突變效率。經(jīng)計算，l475a的突變率依次為12.1％、31.8％、8.2％；l475b的突變率依次為11.6％、22.8％、7.8％；l475d的突變率依次為7.7％、19.7％、4.9％。說明在針對小麥的crispr-cas9基因編輯系統(tǒng)中，sgrna為sgrna4tmc+5序列時(seqidno：20)，可以顯著提高crispr-cas9系統(tǒng)的編輯效率。綜上所述，本發(fā)明系統(tǒng)地比較了驅(qū)動cas9基因表達(dá)的啟動子、驅(qū)動sgrna表達(dá)的啟動子和sgrna的序列結(jié)構(gòu)對小麥基因編輯效率的影響，結(jié)果表明利用ubi啟動子優(yōu)于2*35s啟動子，tau3啟動子優(yōu)于osu3啟動子、tau6啟動子和osu6b啟動子，sgrna4tmc+5優(yōu)于傳統(tǒng)的sgrna和trna-grna結(jié)構(gòu)。綜合上述結(jié)果，最終獲得小麥crrispr-cas9的優(yōu)化載體tau3p::sgrna4tmc+5-ubi::cas9-puc19。此優(yōu)化載體將顯著提高麥crispr-cas9的編輯效率，克服小麥crispr-cas9轉(zhuǎn)化突變率低、獲得crispr-cas9轉(zhuǎn)基因突變株系難的問題，節(jié)約轉(zhuǎn)化時間，減少轉(zhuǎn)化成本。sequencelisting<110>未名興旺系統(tǒng)作物設(shè)計前沿實驗室（北京）有限公司<120>一種基于crispr-cas9系統(tǒng)的基因編輯載體及其應(yīng)用<130><160>21<170>patentinversion3.3<210>1<211>360<212>dna<213>小麥（triticumaestivuml）<400>1gaccaagcccgttattctgacagttctggtgctcaacacatttatatttatcaaggagca60cattgttactcactgctaggagggaatcgaactaggaatattgatcagaggaactacgag120agagctgaagataactgccctctagctctcactgatctgggcgcatagtgagatgcagcc180cacgtgagttcagcaacggtctagcgctgggcttttaggcccgcatgatcgggctttgtc240gggtggtcgacgtgttcacgattggggagagcaacgcagcagttcctcttagtttagtcc300cacctcgcctgtccagcagagttctgaccggtttataaactcgcttgctgcatcagactt360<210>2<211>20<212>dna<213>小麥（triticumaestivuml）<400>2ggagattgggtcctgcgtga20<210>3<211>112<212>dna<213>人工合成（artificialsynthesis）<400>3gctcgcaggtgaacacaacacctgcacacgttttagagctagaaatagcaagttaaaata60aggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt112<210>4<211>766<212>dna<213>人工合成（artificialsynthesis）<400>4cctactccaaaaatgtcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttc60aacaaagggtaatttcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttca120tcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaa180aggctatcattcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacga240ggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtg300acatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccacccctactccaaaaatgtcaaag360atacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatttcgggaa420acctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaagg480aaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcattcaagatgcct540ctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaag600acgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgacatctccactgacgtaaggg660atgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttc720atttggagaggacagcccaagcttccaccatggcgtgcaggtcgac766<210>5<211>4206<212>dna<213>人工合成<400>5atggcccctaagaagaagagaaaggtcggtattcacggcgttcctgcggcgatggacaag60aagtatagtattggtctggacattgggacgaattccgttggctgggccgtgatcaccgat120gagtacaaggtcccttccaagaagtttaaggttctggggaacaccgatcggcacagcatc180aagaagaatctcattggagccctcctgttcgactcaggcgagaccgccgaagcaacaagg240ctcaagagaaccgcaaggagacggtatacaagaaggaagaataggatctgctacctgcag300gagattttcagcaacgaaatggcgaaggtggacgattcgttctttcatagattggaggag360agtttcctcgtcgaggaagataagaagcacgagaggcatcctatctttggcaacattgtc420gacgaggttgcctatcacgaaaagtaccccacaatctatcatctgcggaagaagcttgtg480gactcgactgataaggcggaccttagattgatctacctcgctctggcacacatgattaag540ttcaggggccattttctgatcgagggggatcttaacccggacaatagcgatgtggacaag600ttgttcatccagctcgtccaaacctacaatcagctctttgaggaaaacccaattaatgct660tcaggcgtcgacgccaaggcgatcctgtctgcacgcctttcaaagtctcgccggcttgag720aacttgatcgctcaactcccgggcgaaaagaagaacggcttgttcgggaatctcattgca780ctttcgttggggctcacaccaaacttcaagagtaattttgatctcgctgaggacgcaaag840ctgcagctttccaaggacacttatgacgatgacctggataaccttttggcccaaatcggc900gatcagtacgcggacttgttcctcgccgcgaagaatttgtcggacgcgatcctcctgagt960gatattctccgcgtgaacaccgagattacaaaggccccgctctcggcgagtatgatcaag1020cgctatgacgagcaccatcaggatctgacccttttgaaggctttggtccggcagcaactc1080ccagagaagtacaaggaaatcttctttgatcaatccaagaacggctacgctggttatatt1140gacggcggggcatcgcaggaggaattctacaagtttatcaagccaattctggagaagatg1200gatggcacagaggaactcctggtgaagctcaatagggaggaccttttgcggaagcaaaga1260actttcgataacggcagcatccctcaccagattcatctcggggagctgcacgccatcctg1320agaaggcaggaagacttctacccctttcttaaggataaccgggagaagatcgaaaagatt1380ctgacgttcagaattccgtactatgtcggaccactcgcccggggtaattccagatttgcg1440tggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcacaccttggaacttcgaggaagtggtcgat1500aagggcgcttccgcacagagcttcattgagcgcatgacaaattttgacaagaacctgcct1560aatgagaaggtccttcccaagcattccctcctgtacgagtatttcactgtttataacgaa1620ctcacgaaggtgaagtatgtgaccgagggaatgcgcaagcccgccttcctgagcggcgag1680caaaagaaggcgatcgtggaccttttgtttaagaccaatcggaaggtcacagttaagcag1740ctcaaggaggactacttcaagaagattgaatgcttcgattccgttgagatcagcggcgtg1800gaagacaggtttaacgcgtcactggggacttaccacgatctcctgaagatcattaaggat1860aaggacttcttggacaacgaggaaaatgaggatatcctcgaagacattgtcctgactctt1920acgttgtttgaggatagggaaatgatcgaggaacgcttgaagacgtatgcccatctcttc1980gatgacaaggttatgaagcagctcaagagaagaagatacaccggatggggaaggctgtcc2040cgcaagcttatcaatggcattagagacaagcaatcagggaagacaatccttgactttttg2100aagtctgatggcttcgcgaacaggaattttatgcagctgattcacgatgactcacttact2160ttcaaggaggatatccagaaggctcaagtgtcgggacaaggtgacagtctgcacgagcat2220atcgccaaccttgcgggatctcctgcaatcaagaagggtattctgcagacagtcaaggtt2280gtggatgagcttgtgaaggtcatgggacggcataagcccgagaacatcgttattgagatg2340gccagagaaaatcagaccacacaaaagggtcagaagaactcgagggagcgcatgaagcgc2400atcgaggaaggcattaaggagctggggagtcagatccttaaggagcacccggtggaaaac2460acgcagttgcaaaatgagaagctctatctgtactatctgcaaaatggcagggatatgtat2520gtggaccaggagttggatattaaccgcctctcggattacgacgtcgatcatatcgttcct2580cagtccttccttaaggatgacagcattgacaataaggttctcaccaggtccgacaagaac2640cgcgggaagtccgataatgtgcccagcgaggaagtcgttaagaagatgaagaactactgg2700aggcaacttttgaatgccaagttgatcacacagaggaagtttgataacctcactaaggcc2760gagcgcggaggtctcagcgaactggacaaggcgggcttcattaagcggcaactggttgag2820actagacagatcacgaagcacgtggcgcagattctcgattcacgcatgaacacgaagtac2880gatgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaggtcatcaccttgaagtcaaagctcgtt2940tctgacttcaggaaggatttccaattttataaggtgcgcgagatcaacaattatcaccat3000gctcatgacgcatacctcaacgctgtggtcggaacagcattgat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