本發(fā)明涉及植物育種，具體涉及mir319在培育抗灰霉病菌植物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

番茄是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在很多國(guó)家都有種植，中國(guó)更是番茄的種植大國(guó)?；颐共∈墙?0年來危害番茄的主要病害之一，是由灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)引起的一種世界性重要病害，主要危害果實(shí)，也可以危害葉片和莖等部位，發(fā)病后迅速傳播^[1]。近年來，隨著保護(hù)地番茄栽培面積的不斷擴(kuò)大，為灰霉病菌在土壤中的大量積累及侵染提供了有利的環(huán)境，特別是冬春季大棚內(nèi)高溫、高濕的氣候條件，更有利于灰霉病的發(fā)生和流行，常導(dǎo)致番茄減產(chǎn)20％～40％，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)60％以上^[2-3]。因此，番茄灰霉病的危害日趨嚴(yán)重，已成為保護(hù)地番茄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素。

利用傳統(tǒng)的育種方法和物種間的現(xiàn)有遺傳基因通過基因重組技術(shù)來改良作物的抗病能力還存在很多局限，發(fā)展起來的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為改良作物的抗病性提供了新的途徑，通過外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)，可以提高許多轉(zhuǎn)基因植物對(duì)生物脅迫的耐性。因此，尋求灰霉病菌侵染誘導(dǎo)基因，研究抗病基因的表達(dá)、調(diào)控和功能，是利用基因工程技術(shù)獲得抗灰霉病轉(zhuǎn)基因植物的前提，也是生產(chǎn)上亟待解決的突出問題。

近年來，國(guó)內(nèi)外研究人員已經(jīng)開始在番茄mirna參與逆境脅迫應(yīng)答調(diào)控領(lǐng)域展開了相關(guān)的研究^[4]。2010年，gu等利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)番茄mir395、mir779.1、mir840和mir867在感染叢枝菌根的番茄葉片中特異性表達(dá)，而mir158、mir862-3p、mir319、mir394和mir399在感染叢枝菌根的番茄根部異常表達(dá)^[5]。2012年，zuo等人通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)外源乙烯刺激下分別有5個(gè)mirna在番茄果實(shí)成熟及軟化的過程中上調(diào)而有3個(gè)下調(diào)^[6]。feng等人分別在2009年和2011年對(duì)幾種病毒感染引起番茄mirna的差異表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)的研究，發(fā)現(xiàn)mir159、mir164、mir165/166及mir168等多個(gè)mirna的表達(dá)受cmv或tav病毒感染時(shí)而發(fā)生變化^[7-8]。afsar等人在2010年發(fā)現(xiàn)番茄mir159/319和mir172可能參與番茄縮葉病毒侵染的應(yīng)答反應(yīng)^[9]。2012年，chen等人利用mirnamicroarray技術(shù)對(duì)兩種花葉病毒(cmv和tomv)感染引起番茄mirna的表達(dá)譜進(jìn)行研究表明，發(fā)現(xiàn)至少有80個(gè)以上的植物已知mirna的表達(dá)受這兩種病毒侵染的影響^[10]。2012年，shivaprasad等人發(fā)現(xiàn)番茄mir482通過剪切(cc)-nbs-lrr類型的r基因產(chǎn)生的tasirna能夠抑制番茄對(duì)細(xì)菌性葉斑病(p.syringaedc3000)的免疫系統(tǒng)^[11]。2012年，jin等利用micorarray技術(shù)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)mirna在灰霉病菌侵染番茄過程中參與應(yīng)答調(diào)控^[12]。2015年，jin等利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)灰霉病菌侵染應(yīng)答相關(guān)的番茄mirna進(jìn)行了系統(tǒng)地識(shí)別分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有65個(gè)mirna在灰霉病菌侵染過程中表達(dá)異常，對(duì)其中的部分差異表達(dá)mirna進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證^[13]。

以上研究成果均表明，mirna可能在植物應(yīng)答生物脅迫的過程中扮演著重要的角色，因此，識(shí)別抗病mirna并研究其相應(yīng)的抗病調(diào)控機(jī)制將有望幫助我們更加深入揭示植物抗并的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為將來人工培育抗病作物奠定理論基礎(chǔ)。

目前已報(bào)道具有抗病相關(guān)的mirna基因還不夠多；這些抗病相關(guān)的mirna基因通過轉(zhuǎn)基因進(jìn)行抗病性鑒定，發(fā)現(xiàn)很多不具有抗病性，或?qū)D(zhuǎn)基因植物的抗病性提高不明顯。

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種mir319在培育抗灰霉病菌植物中的應(yīng)用；本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物對(duì)生物脅迫，特別是灰霉病菌脅迫的抗性。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供mir319在培育抗灰霉病植物中的應(yīng)用。

作為本發(fā)明的mir319在培育抗灰霉病植物中的應(yīng)用：用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物(例如擬南芥)，所述轉(zhuǎn)基因植物具有抗灰霉病的性能。

mir319是植物中保守的mirna，mir319序列(序列可在mirbase數(shù)據(jù)庫中查到)：uuggacugaagggagcuccuu。

本發(fā)明涉及的技術(shù)方案如下：

1、番茄灰霉病菌侵染處理及rna的提??；

2、過表達(dá)mir319擬南芥突變株的構(gòu)建；

3、mir319的抗病性分析。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：將mir319在擬南芥中過表達(dá)，可顯著提高擬南芥對(duì)灰霉病菌的抗性。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

圖1為定量pcr檢測(cè)灰霉病菌侵染番茄后不同時(shí)間點(diǎn)mir319的表達(dá)圖；

圖1中，縱坐標(biāo)代表相對(duì)表達(dá)量，橫坐標(biāo)代表時(shí)間。

圖2是mir319過表達(dá)載體圖解。

圖3是pcr檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽性植株；

wt代表非轉(zhuǎn)基因植株，line1～line15分別代表轉(zhuǎn)基因植株。

圖4是定量pcr檢測(cè)mir319在正常及轉(zhuǎn)基因擬南芥的表達(dá)；

wt：非轉(zhuǎn)基因植株野生型；line4、5、10、13：轉(zhuǎn)基因植株。

圖5為灰霉菌病侵染后野生型和轉(zhuǎn)基因植株葉片的癥狀和對(duì)應(yīng)的臺(tái)盼藍(lán)染色圖；

a.灰霉菌病侵染后野生型和轉(zhuǎn)基因植株葉片的癥狀，b：臺(tái)盼藍(lán)染色；

wt：非轉(zhuǎn)基因植株；line4、5、10、13：轉(zhuǎn)基因植株。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：番茄灰霉病菌侵染處理及rna的提取

本實(shí)施例對(duì)一月齡的番茄材料microtom進(jìn)行接種灰霉病菌處理，即用1×10⁶sporesml^-1孢子噴灑番茄幼苗，接菌后分別在0h、0.5h、1h、2h、6h和12h收集番茄葉片，并提取總rna。

本實(shí)施例采用trizol試劑盒提取番茄葉片總rna，其具體步驟如下：

1)、液氮速凍的葉片100mg用塑料棒于eppendorf管中磨碎，加入1ml的trizol，劇烈混勻后室溫放置5min。

2)、在管中再加入400μl酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)，劇烈混勻后室溫放置5min。

3)、4℃10000g離心10min，吸取上清液600μl至另一新的eppendorf管，加入600μl氯仿，輕柔混勻，室溫放置10min。

4)、4℃10000g離心10min，吸取上清液500μl至另一新的eppendorf管，加入850μl無水乙醇，輕柔混勻后，－20℃放置8h以上。

5)、4℃12000g離心10min，棄上清液，加入1000μl70％乙醇，輕柔顛倒eppendorf管，室溫放置5min。

6)、4℃12000g離心10min，棄上清液，放置超凈臺(tái)上自然風(fēng)干。

7)、用50μl經(jīng)depc處理后的ddh2o溶解沉淀，保存于－20℃。

8)、取1μldna樣品稀釋50倍，以紫外分光光度計(jì)測(cè)樣品的od260和od280，通過od260計(jì)算rna樣品濃度及純度。依據(jù)濃度，將樣品統(tǒng)一稀釋至50ng/ul，取1μl用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

實(shí)施例2：在灰霉病菌侵染脅迫下番茄mir319的表達(dá)動(dòng)態(tài)

本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例1提取的樣品總rna進(jìn)行定量rt-pcr分析，其具體步驟如下：

按照takara公司購買的試劑盒primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)說明書進(jìn)行操作，試劑盒中反轉(zhuǎn)錄引物為random6mers和oligodtprimer混合的rtprimermix，反應(yīng)條件為：37℃15min；85℃5sec。

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物取1μg作為模版，其他試劑及容量按照takara公司提供的sybrgreenii說明書配制反應(yīng)體系，使用abi的定量pcr儀，反應(yīng)條件：94℃3min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖1。

根據(jù)圖1，可得知：在灰霉病菌侵染后，通過rt-pcr檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)mir319的表達(dá)量有所下調(diào)，說明mir319有可能參與機(jī)體對(duì)灰霉菌病的應(yīng)答。

實(shí)施例3：過表達(dá)mir319擬南芥突變株的構(gòu)建

本實(shí)施例在實(shí)施例2的檢測(cè)結(jié)果基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建了過表達(dá)mir319的擬南芥突變株，其具體步驟如下：

1、mir319組成型表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

擴(kuò)增擬南芥mir319前體片段，通過分子克隆及dna測(cè)定鑒定正確后，通過與35s啟動(dòng)子融合構(gòu)建成目標(biāo)mirna的植物表達(dá)載體。構(gòu)建策略是：切除pcambia1301載體上的gus基因，然后將目標(biāo)片段(mirna前體片段)插入到原來gus基因的位置上。最終構(gòu)建的載體簡(jiǎn)圖如圖2所示。

2、mir319組成型表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擬南芥

(1)將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌gv3103，然后將含有表達(dá)載體的陽性農(nóng)桿菌菌落接種于5m含有25ug/mlrif、50ug/mlgen、50ug/mlkan抗性的lb液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)2d。

(2)按照1:100比例，移取上一步的培養(yǎng)物于500ml含有25ug/mlrif、50ug/mlgen、50ug/mlkan抗性的lb液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，28℃培養(yǎng)16-24h。

(3)測(cè)得此時(shí)菌液的od值在1.5-2.0之間，室溫4000g×10min離心收集菌體。

(4)用5％等體積的蔗糖溶液重懸菌體，并往其中加入100ulsilwet-l77，混勻，轉(zhuǎn)移至500ml大燒杯中。

(5)倒置處于花期的野生型擬南芥，將其花及莖部分浸入農(nóng)桿菌懸浮液中并輕輕攪動(dòng)10s左右。

(6)為了保持一定的濕度，用塑料袋將浸染過的擬南芥覆蓋住16-24h。

(7)將處理過的植物移回溫室中繼續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月，收集種子。

3、轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選

(1)將上述收集的種子經(jīng)過消毒后均勻涂布到含有50ug/mlkan抗性的1/2ms培養(yǎng)基上。

(2)將培養(yǎng)皿置于長(zhǎng)日照條件(16h光照/8h黑暗，22℃)培養(yǎng)2周，讓種子發(fā)芽和小苗生長(zhǎng)，然后篩選能夠正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因陽性苗轉(zhuǎn)移到濕土中。

(3)將土中的擬南芥置于溫室短日照培養(yǎng)3-4周，再轉(zhuǎn)換成長(zhǎng)日照條件誘導(dǎo)其開花。

(4)得到轉(zhuǎn)基因株系line1-line15種子t1代種子，經(jīng)過抗生素篩選后種植，得到t2代種子，再次使用抗生素對(duì)t2代種子進(jìn)行篩選后種植，收獲其中的t3代突變株種子，產(chǎn)生3:1的分離比，播種后待其長(zhǎng)大，通過pcr技術(shù)篩選出pcr陽性的轉(zhuǎn)基因植株，其中wt(野生型)為對(duì)照，如圖3所示。

實(shí)施例4：mir319在轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型中的表達(dá)鑒定

本實(shí)施例采用定量pcr來檢測(cè)實(shí)施例3所得轉(zhuǎn)基因擬南芥mir319的表達(dá)情況，野生型擬南芥作為對(duì)照。結(jié)果如圖4所示，目標(biāo)mirna在轉(zhuǎn)基因擬南芥中得到過量表達(dá)。

實(shí)施例5：灰霉病菌處理野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥

將野生型擬南芥和實(shí)施例4所得的mir319高表達(dá)的t3代突變株種子種到土里，一個(gè)月后進(jìn)行接菌處理，結(jié)果如圖5所示，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片沒有出現(xiàn)明顯癥狀；而在對(duì)照組的非轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片卻出現(xiàn)病斑。進(jìn)一步臺(tái)盼藍(lán)染色表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片中基本沒有菌絲或菌絲增殖較少；而在對(duì)照組的非轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片中菌絲增長(zhǎng)明顯。表明mir319是一個(gè)對(duì)灰霉病菌具有較強(qiáng)抗性的mirna基因。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

<110>浙江理工大學(xué)

<120>mir319在培育抗灰霉病植物中的應(yīng)用

<160>1

<210>1

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>mir319

<400>1

uuggacugaagggagcuccuu21