本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
：，尤其涉及一種以crispr/cas9介導(dǎo)的兔mstn基因編輯方法，應(yīng)用該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)mstn基因突變和基因敲除，獲得mstn表達(dá)缺失或降低的基因編輯兔，本發(fā)明可用于瘦肉型兔基因編輯育種。
背景技術(shù)：
：：肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin，mstn)是骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforminggrowthfactorβ，tgf-β)超家族成員，又稱(chēng)生長(zhǎng)分化因子8(growthdifferentiationfactor8，gdf-8)。mstn屬于tgf-β超家族成員，因此具有tgf-β超家族典型的結(jié)構(gòu)特征，包括n-末端的分泌信號(hào)肽、蛋白酶水解位點(diǎn)(proteolyticprocessingsite，rsrr)和成熟肽區(qū)的半胱氨酸結(jié)構(gòu)(cystineknot)。mstn基因的突變能夠引起骨骼肌的廣泛性增生與肥大，產(chǎn)生“雙肌癥狀”。目前已研究過(guò)的不同哺乳物種間的mstn基因結(jié)構(gòu)均含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，并且成熟肽氨基酸序列很保守，氨基酸差異很小，均在3個(gè)以?xún)?nèi)。前兩個(gè)外顯子共同編碼n端前肽，第三外顯子編碼c端多肽。c端多肽含有由9個(gè)半胱氨酸構(gòu)成的半胱氨酸結(jié)，該半胱氨酸結(jié)對(duì)mstn基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能的發(fā)揮起到關(guān)鍵作用，其結(jié)構(gòu)的破壞將抑制myostatin的信號(hào)傳導(dǎo)。皮埃蒙特牛中的雙肌表型牛就是由于半胱氨酸(c313y)突變導(dǎo)致的。小鼠、大鼠、人、豬、雞、牛、綿羊、狒狒、和斑馬魚(yú)等物種的mstn基因編碼序列發(fā)生點(diǎn)突變或移碼突變，則通常表現(xiàn)出肌肉量顯著增加的性狀。目前已經(jīng)在人、牛、綿羊、狗等多種物種中發(fā)現(xiàn)了自然發(fā)生的mstn基因的突變，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)mstn基因發(fā)生自發(fā)突變的有比利時(shí)蘭牛(belgianblue)、皮埃蒙特牛(piedmontese)等，表現(xiàn)出雙肌性狀，其突變均發(fā)生在exon3。發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物中mstn基因均含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，完整的mstncdna包括一個(gè)orf(openingreadfracture)和編碼375個(gè)氨基酸殘基(小鼠和大鼠為376個(gè)氨基酸殘基)的核苷酸序列。mstn是一種分泌型多肽，與tgf-β超家族有著相似的典型特征：n端作為分泌信號(hào)，與tgfβ超家族有著相同的氨基酸序列；c端有由4個(gè)氨基酸(rsrr，arg-ser-arg-arg)組成類(lèi)胰蛋白酶水解位點(diǎn)；在c端有6個(gè)半胱氨酸殘基形成“半胱氨酸結(jié)”結(jié)構(gòu)，并通過(guò)二硫鍵形成生物學(xué)活性二聚體。mstn成熟肽序列在不同物種上的同源性很高，小鼠、大鼠、人、豬、馬、狗，雞和火雞的同源性為100％，牛、綿羊，狒狒與山羊相比僅有1～3個(gè)堿基的差別。mstn前體蛋白包括信號(hào)肽、n端前肽和c端成熟肽，其中成熟肽均為c-末端的109個(gè)氨基酸殘基。前體蛋白質(zhì)需經(jīng)二次蛋白酶解活化，去除信號(hào)肽，切割前體蛋白質(zhì)產(chǎn)生n-端前肽和c-端多肽，c-端多肽通過(guò)二硫鍵相連形成二聚體，構(gòu)成mstn成熟蛋白分泌至血液循環(huán)，并與n-端前肽以非共價(jià)鍵形式形成lap(lantency-associatedpeptide，40kda)。有人用myostatin特異性抗體檢測(cè)到了牛成肌細(xì)胞提取物肌肉生長(zhǎng)抑制素前體肽(52kda)的存在和lap，證明mstn確實(shí)在成肌細(xì)胞中合成并且水解加工。對(duì)基因組進(jìn)行定向修飾一直是生物科學(xué)家研究的主題，通過(guò)對(duì)mstn基因進(jìn)行突變、缺失、敲除等遺傳修飾，獲得基因突變動(dòng)物，一方面可以構(gòu)建出具有“雙肌癥狀”的動(dòng)物模型用于生物學(xué)研究和疾病機(jī)理研究，另一方面可以達(dá)到改進(jìn)肌肉質(zhì)量和重量的目的，生產(chǎn)具有商業(yè)化性質(zhì)的優(yōu)良品種家畜?；蚪M編輯(genomeediting)技術(shù)是通過(guò)插入、缺失或替換的手段對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)改造，從而獲得能以突變基因代替正?；騺?lái)研究基因也能夠以正?；虼嫱蛔兓騺?lái)進(jìn)行基因治療的功能的科研技術(shù)。這種技術(shù)的原理是構(gòu)建一個(gè)人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷dna，切斷的dna在被細(xì)胞內(nèi)的dna修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生突變，從而達(dá)到定點(diǎn)改造基因組的目的。dna修復(fù)系統(tǒng)主要通過(guò)兩種途徑修復(fù)dna雙鏈斷裂(double-strandbreak，dsb)，即非同源末端連接(non-homologousendjoining，nhej)和同源重組(homologousrecombination，hr)?；蚪M編輯技術(shù)可以通過(guò)這兩種修復(fù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)三種基因組改造的目的，即基因敲除，基因敲入和定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因，因而基因組編輯技術(shù)具有廣闊的科研和疾病治療前景。人們一直在尋找簡(jiǎn)單高效的方法對(duì)基因組進(jìn)行靶向修飾。傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)依賴(lài)于細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體隨機(jī)重組交換，打靶效率極低，通常只有10-6-10-8，未被廣泛應(yīng)用。近年來(lái)核酸酶指導(dǎo)的基因組靶向修飾技術(shù)發(fā)展迅速。這類(lèi)核酸酶通常由一個(gè)dna識(shí)別結(jié)構(gòu)域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，由dna識(shí)別結(jié)構(gòu)域特異的識(shí)別靶位點(diǎn)，把核酸酶定位到需要進(jìn)行編輯的基因組區(qū)域，然后由非特異性核酸內(nèi)切酶切斷dna雙鏈，引起dna斷裂自我修復(fù)機(jī)制，從而引發(fā)基因序列的突變和促進(jìn)同源重組的發(fā)生。crispr/cas9系統(tǒng)是細(xì)菌長(zhǎng)期抵御外來(lái)質(zhì)?；蚴删w的入侵從而進(jìn)化出來(lái)的一種免疫機(jī)制，細(xì)菌宿主的cripsr基因座轉(zhuǎn)錄形成前體cripsrrna(pre-crrna)，在cas9和核酸酶(rnaseⅲ)的協(xié)助下，pre-crrna被加工成成熟的crrna，并與相關(guān)cas9蛋白特異性切割外來(lái)dna序列，鑒于此功能，crispr/cas9系統(tǒng)已成為新一代基因編輯技術(shù)。crispr/cas9是第三代基因編輯技術(shù)，與zfn和talen技術(shù)相比有明顯的優(yōu)勢(shì)，因其構(gòu)建簡(jiǎn)單、方便，使用時(shí)基因編輯效率高，而且成本較低，自2013年起已經(jīng)迅速成為基因編輯技術(shù)的研究熱點(diǎn)。crispr/cas9在基因組中的靶點(diǎn)分布頻率很高，平均每8個(gè)bp就有一個(gè)靶點(diǎn)，talen的靶點(diǎn)在基因組的分布頻率大概是1/125bp，而zfn的的分布頻率大概是1/500bp，有時(shí)不能用zfn和talens對(duì)某些基因組位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)編輯，用crispr/cas系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)該基因組的定點(diǎn)編輯。在細(xì)胞相同、載體結(jié)構(gòu)相似和位點(diǎn)相同的情況下，crispr/cas9在人ips細(xì)胞中的定點(diǎn)突變效率是talen的2倍以上，并且crispr/cas9產(chǎn)生雙等位基因突變的效率更高。crispr/cas系統(tǒng)更具有靈活性，因?yàn)閠alen和zfn技術(shù)對(duì)不同的靶點(diǎn)需要重新設(shè)計(jì)，而crispr/cas9只需要改變20bp左右的sgrna序列。而且還可以將幾個(gè)sgrna串聯(lián)在一起對(duì)同一基因的多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)編輯或多個(gè)不同基因同時(shí)編輯。在動(dòng)植物新品種培育方面，crispr/cas9具有很大優(yōu)勢(shì)。通過(guò)構(gòu)建crispr/cas9載體，體外轉(zhuǎn)錄獲得rna后，再顯微注射動(dòng)物受精卵而獲得打靶動(dòng)物。在整個(gè)打靶過(guò)程中不存在外源dna的整合，也就避免了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)致的生物安全問(wèn)題。crispr/cas9為人類(lèi)基因治療、新藥開(kāi)發(fā)等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域方面提供了一條全新的思路。crispr/cas9技術(shù)在基礎(chǔ)理論研究、臨床治療和農(nóng)牧漁業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用前景必將越來(lái)越有廣闊，并且將會(huì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種兔mstn基因編輯方法及其在兔mstn基因exon3第372，374位半胱氨酸敲除靶位點(diǎn)。本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)兔mstn基因是指肌肉生成抑制蛋白基因(myostatin)。為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案：一種兔mstn基因編輯方法，是利用crispr/cas9在兔mstn基因座定點(diǎn)實(shí)現(xiàn)基因修飾；具體是：(1)根據(jù)如seqidno.1所示的新西蘭兔mstn基因靶序列，針對(duì)4881-4903、4796-4818位核苷酸序列設(shè)計(jì)sgrna-1和sgrna-2的引導(dǎo)序列，(2)利用引導(dǎo)序列與ysycrispr/cas9二合一質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒構(gòu)建2種crispr/cas9二合一質(zhì)粒，將它們分別命名為mstn-sgrna1和mstn-sgrna2(3)mstn-sgrna1和mstn-sgrna2質(zhì)粒分別做為pcr擴(kuò)增sgrna-1、sgrna-2和cas9mrna的轉(zhuǎn)錄模板，根據(jù)轉(zhuǎn)錄模板體外轉(zhuǎn)錄出sgrna-1、sgrna-2和cas9mrna；sgrna-1或sgrna-2分別與cas9mrna的二合一復(fù)合物組成了激活新西蘭兔mstn基因4881-4903、4796-4818位核苷酸序列突變及新西蘭兔mstn基因基因敲除的分子生物學(xué)材料，(4)利用該分子生物學(xué)材料制備轉(zhuǎn)基因兔，誘導(dǎo)mstn基因編碼序列第3外顯子4881-4903及4796-4818位核苷酸序列的突變與缺失。本發(fā)明中，引導(dǎo)序列的設(shè)計(jì)如下：基因組靶序列seqidno.1中截獲的同源序列(4881-4900位核苷酸)作為sgrna-1的引導(dǎo)序列，4901-4903位核苷酸作為sgrna-1的pam序列，基因組靶序列seqidno.1的反向互補(bǔ)序列中截獲的同源序列(基因組靶序列seqidno.1的4796-4815位核苷酸反向互補(bǔ)序列)作為sgrna-2的引導(dǎo)序列，4816-4818位核苷酸反向互補(bǔ)序列作為sgrna-2的pam序列：sgrna-1的引導(dǎo)序列：5’-ccatggtagtagaccgctgt-3’(seqidno.2)sgrna-1的pam序列(pam-1)：5’-ggg-3’sgrna-2的引導(dǎo)序列：5’-atctttgtgggagtacagca-3’(seqidno.3)sgrna-2的pam序列(pam-2)：5’-agg-3’本發(fā)明步驟(3)中sgrna-1和/或sgrna-2和cas9mrna優(yōu)選按1：2-5比例配合使用。本發(fā)明兔mstn基因定點(diǎn)敲除方法，所述定點(diǎn)敲除方法為編輯兔mstn基因組靶序列的crispr/cas9基因敲除技術(shù)；所述兔mstn基因靶序列如seqidno.1所示核苷酸序列，4881-4903及4796-4818核苷酸為設(shè)計(jì)引導(dǎo)序列位點(diǎn)；所述的crispr/cas9基因編輯工具應(yīng)用于mstn基因敲除應(yīng)用本專(zhuān)利特征性材料：應(yīng)用mstn-sgrna1和mstn-sgrna2質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄獲得sgrna-1、sgrna-2，將獲得的sgrna-1和sgrna-2與cas9mrna按1：2-5比例配合使用用于受精卵顯微注射，其中mstn-sgrna1、mstn-sgrna2、pam-1、pam-2、sgrna-1、sgrna-2和cas9mrna是本專(zhuān)利特征性材料。本發(fā)明還公開(kāi)了所述方法在瘦肉型轉(zhuǎn)基因兔育種中應(yīng)用。本發(fā)明方法能有效地誘導(dǎo)mstn基因編碼序列第3外顯子4881-4903及4796-4818位核苷酸序列的突變與缺失，并產(chǎn)生新西蘭兔mstn表達(dá)受阻及肌肉生長(zhǎng)加強(qiáng)。附圖說(shuō)明圖1靶位點(diǎn)在mstn基因中的相對(duì)位置。圖2是sgrna質(zhì)粒的鑒定。圖3是sgrna質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果。圖4是sgrna和cas9mrna電泳圖。1:sgrna1；2:sgrna2；3:cas9mrna；m:λ-ecot14digestdnamarker。圖5是兔受精卵的胞質(zhì)顯微注射。圖6是兔mstn基因pcr產(chǎn)物電泳圖1：滅菌雙蒸水作為空白對(duì)照；2：正常陰性兔基因組作為陰性對(duì)照；3～9：m1～m7；10～18：m8～m16；m：dl2000dnamarker圖7是m5和正常兔mstn基因pcr產(chǎn)物測(cè)序圖譜wt：正常兔測(cè)序圖譜；m5：雙等位基因突變兔測(cè)序圖譜。圖8是m12和正常兔mstn基因pcr產(chǎn)物測(cè)序圖譜wt：正常兔測(cè)序圖譜；m12：mstn突變陰性兔測(cè)序圖譜。圖9是m10和正常兔mstn基因pcr產(chǎn)物測(cè)序圖譜wt：正常兔測(cè)序圖譜；m10：雙等位基因突變細(xì)胞樣品測(cè)序圖譜。圖10是mstn突變兔與正常兔的體型對(duì)比圖wt：正常兔；m3、m5、m6、m10：mstn基因突變兔。圖11是mstn基因突變兔肌肉圖片a、e：m9mstn突變兔腿部肌肉；b：m9mstn突變兔肩臂及后背肌肉；c：m9mstn突變兔；d：正常陰性兔。圖12是mstn基因突變兔與正常陰性兔的9-14周齡體重曲線圖。圖13是mstn突變兔基因組pcr產(chǎn)物ta克隆測(cè)序結(jié)果(sgrna-2)。其中，靶位點(diǎn)為sgrna-2,“-”表示堿基缺失，“+”等表示堿基增添，小寫(xiě)字母表示堿基替換，斜體的小寫(xiě)字母表示增添的堿基，“fs”表示讀碼框發(fā)生改變。圖14是mstn突變兔基因組pcr產(chǎn)物ta克隆測(cè)序結(jié)果(sgrna-1)。其中，靶位點(diǎn)為sgrna-1，“-”表示堿基缺失，“+”等表示堿基增添，小寫(xiě)字母表示堿基替換，加下劃線斜體的小寫(xiě)字母表示增添的堿基，“fs”表示讀碼框發(fā)生改變。具體實(shí)施方式一、crispr/cas9質(zhì)粒構(gòu)建及體外轉(zhuǎn)錄1.實(shí)驗(yàn)材料1.1主要儀器及器材高速臺(tái)式離心機(jī)及低溫高速離心機(jī)(德國(guó)eppendorf公司)；基因擴(kuò)增儀(s1000型，美國(guó)bio-rad公司)；dna電泳儀和電泳槽(dyy-6b型，南京新校園生物技術(shù)研究所)；數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(gis-1000型，上海天能科技有限公司)；恒溫培養(yǎng)搖床(is-rdv1，南京暢翔儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(pyx-dhs-350-bii型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；電熱恒溫水槽(dk60型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；制冰機(jī)(sim-f124型，日本三洋公司)；電子天平(fa1004，上海天平儀器廠)；ph檢測(cè)儀(ha405-k2型，梅特勒-托利多集團(tuán)上海分公司)；自動(dòng)雙重純水蒸餾器(sz-ii型，上海嘉鵬科技有限公司)；超凈工作臺(tái)(sj-cj-1bq型，蘇州凈化儀器設(shè)備廠)；–80℃超低溫冰箱(日本三洋公司)；核酸蛋白定量分析儀(onedroptmod-1000+,基因集團(tuán)，上海儀濤生物儀器有限公司)；實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器(eped-20tf型，南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)。1.2分子生物學(xué)試劑及試劑盒ysycrispr/cas9二合一質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒及annealingbuffer購(gòu)自南京堯順禹生物科技有限公司、t4dnaligase購(gòu)自promega公司、phantasuper-fidelitydnapolymerase購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司、endo-freeplasmidminikiti購(gòu)自omega(貨號(hào)：d6948-01)、胰蛋白胨(tryptone)及酵母提取物(yeastextract)購(gòu)自oxoid公司、2×powertaqpcrmastermix購(gòu)自bioteke(貨號(hào)：pr1700)、scriptmaxthermot7transcriptionkit(tsk-101)購(gòu)自東洋紡生物科技有限公司(貨號(hào)：tsk-101)、抗-反向帽類(lèi)似物(arca)購(gòu)自neb(貨號(hào)：01.neb.s1411s)、poly(a)聚合酶購(gòu)自neb(貨號(hào)：01.neb.m0276s)、easypurepcrpurificationkit及e.coiltrans5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：cd201-01)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，分別購(gòu)自上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司、南京生興生物有限公司、國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司等。1.3主要試劑的配制(1)lb液體培養(yǎng)基稱(chēng)取5g蛋白胨、2.5g酵母粉和10gnacl，溶于400ml雙蒸水，定容至500ml，調(diào)ph至7.5，高壓滅菌冷卻至常溫待用。(2)lb固體培養(yǎng)基稱(chēng)取1g蛋白胨、0.5g酵母粉、1gnacl和1g瓊脂粉，溶于90ml雙蒸水，定容至100ml，高壓滅菌，待溫度降至室溫，加入amp混勻后鋪板后待用。(3)氨芐青霉素(amp)用4ml滅菌雙蒸水溶解1g氨芐青霉素，配成濃度為250mg/ml的儲(chǔ)液，分裝，-20℃保存。(4)質(zhì)粒提取溶液溶液?。悍Q(chēng)取0.30285gtris、0.37224gna2edta和0.9008gglucose，加90ml雙蒸水溶解，定容至100ml，調(diào)ph至8.0，高壓滅菌，4℃保存。溶液ⅱ：分別配制0.2mnaoh和1％sds溶液，使用是1:1體積混勻。溶液ⅲ：3mnaac，以冰醋酸調(diào)至ph5.5。(5)50×tae貯存液稱(chēng)取242gtris和37.2gna2edta·2h2o，量取57.1mlhac，加雙蒸水定容至1l，室溫保存。使用時(shí)以雙蒸水稀釋成1×。(6)50×eb貯存液100ml雙蒸水溶解1g溴化乙錠粉末，配成濃度為10mg/ml的儲(chǔ)液，4℃保存，用時(shí)以雙蒸水稀釋成1×。(7)rnasea溶液rnasea溶于10mmol/ltris和15mmol/lnacl混合液中，配制濃度為10mg/ml，100℃煮沸15min，-20℃保存。(8)depc處理水：純水儀制備超純水，再雙蒸。用雙蒸的超純水配制0.1％depc水溶液，猛烈振搖，直到瓶底看不到油狀顆粒，37℃搖床過(guò)夜，第二天，121℃高壓40min取出放于超凈臺(tái)內(nèi)冷卻至常溫。用無(wú)rnase的槍頭分裝到無(wú)rnase的2ml的指形管中，-20℃凍存。(9)無(wú)rnase的70％乙醇：取3ml的depc水+7ml的無(wú)水乙醇即可。用無(wú)rnase的槍頭分裝到無(wú)rnase的2ml的指形管中，-20℃凍存。2.實(shí)驗(yàn)方法2.1mstn-sgrna1和mstn-sgrna2質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定采用ysycrispr/cas9二合一質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒構(gòu)建mstn-sgrna1和mstn-sgrna2質(zhì)粒，以該質(zhì)粒為模板，及南京堯順禹生物科技有限公司提供的引物擴(kuò)增sgrna-1和sgrna-2的轉(zhuǎn)錄模板。(引物1、引物2、引物3、引物4見(jiàn)表2-1)表2-1引物信息2.1.1設(shè)計(jì)sgrna單鏈退火引物針對(duì)兔mstn基因的sgrna-1和sgrna-2的引導(dǎo)序列設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的sgrna模板，形式為gnnnnnnnnnnnnnnnnnnn[ngg]?！癵”為sgrna模板的首個(gè)核苷酸；n為目標(biāo)基因的特異核苷酸。ngg為pam序列，其必須出現(xiàn)在基因組dna上但不出現(xiàn)在sgrna模板dna序列上。若20個(gè)核苷酸的sgrna模板首位不是“g”，請(qǐng)?jiān)谑孜患由稀癵”，此時(shí)模板長(zhǎng)為21個(gè)核苷酸。根據(jù)sgrna模板設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的退火引物，由引物合成公司合成。形式為：正向單鏈退火引物:tatagnnnnnnnnnnnnnnnnnnn反向單鏈退火引物:aaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnnc注意反向單鏈退火引物nnnnnnnnnnnnnnnnnnnc為gnnnnnnnnnnnnnnnnnnn的反向互補(bǔ)序列；若20個(gè)核苷酸的sgrna首位為“g”，則n的個(gè)數(shù)為19，正反向單鏈退火引物均為24個(gè)核苷酸長(zhǎng)；若20個(gè)核苷酸的sgrna首位不為“g”，則在前面加一個(gè)“g”，則n的個(gè)數(shù)為20，此時(shí)正反向單鏈退火引物為25個(gè)核苷酸長(zhǎng)。2.1.2合成sgrna單鏈退火引物sgrna-1的單鏈退火引物(5’-3’)：正向單鏈退火引物：tatagccatggtagtagaccgctgt(seqidno.8)反向單鏈退火引物：aaacacagcggtctactaccatggc(seqidno.9)sgrna-2的單鏈退火引物(5’-3’)：正向單鏈退火引物：tatagatctttgtgggagtacagca(seqidno.10)反向單鏈退火引物：aaactgctgtactcccacaaagatc(seqidno.11)2.1.3將正反向兩個(gè)引物進(jìn)行退火(1)將單鏈退火引物溶于超純水中，至100μm(2)在2個(gè)pcr管中按下述配方分別組成10μl反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如表1-1。表1-1引物退火體系(3)將反應(yīng)體系混勻，然后快速離心將溶液離心至pcr底部。(4)將混勻后的體系放入pcr儀進(jìn)行反應(yīng)，95℃孵育5min后，以每分鐘1.5℃逐漸從95℃降至22℃。2.1.4將退火產(chǎn)物與線性化的ysycrispr/cas9二合一質(zhì)粒連接(1)在pcr管中按下述配方組成10μl反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如表1-2。表1-2dna連接體系(2)混勻，然后將混合液快速離心至pcr管底部。(3)16℃過(guò)夜或室溫孵育30min。(4)從-80℃冰箱中取出trans5α感受態(tài)大腸桿菌，立即置于冰上。(5)待感受態(tài)細(xì)胞解凍后，將50μl感受態(tài)細(xì)胞輕輕加入10μl的(1)中的連接產(chǎn)物即可，不需要吸打混勻，冰浴30min。(6)42℃水浴熱激45s，后立即置于冰上孵育2min，不要晃動(dòng)離心管。(7)加入100μllb培養(yǎng)基(無(wú)抗生素，室溫)，于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)40min～1h(蓋緊管蓋)。(8)取所有菌液均勻涂布于含50μg/ml氨芐青霉素的lb瓊脂板上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過(guò)夜(14～18h)。2.1.5轉(zhuǎn)化平板的菌落pcr鑒定(1)準(zhǔn)備3個(gè)1.5ml的ep管，每管加入20μl含50μg/ml氨芐的lb液。(2)用高壓滅菌處理過(guò)的槍頭從lb瓊脂板上挑取單克隆直接放入準(zhǔn)備好的ep管中。每個(gè)板上挑取3個(gè)克隆。(3)蓋緊管蓋后，渦旋振蕩ep管。(4)準(zhǔn)備3個(gè)0.2ml的pcr管，在每一個(gè)管中按下列方法分別制備10μlpcr反應(yīng)體系，按如下體系加樣，反應(yīng)體系如表1-3。表1-3pcr體系pcr反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min；94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min，20℃5min；結(jié)束反應(yīng)。(5)2％瓊脂糖凝膠電泳，陽(yáng)性克隆應(yīng)出現(xiàn)113bp的條帶。2.1.6菌液測(cè)序送經(jīng)pcr驗(yàn)證有陽(yáng)性條帶的菌液去測(cè)序(測(cè)序引物選用引物3)，確認(rèn)sgrna-1和sgrna-2的引導(dǎo)序列(去除pam位點(diǎn))和骨架序列確實(shí)在質(zhì)粒中；同時(shí)，將同樣的菌接種在10ml含氨芐青霉素的lb管中，37℃條件下?lián)u菌過(guò)夜，以用來(lái)后續(xù)小量提取質(zhì)粒及保存菌種用，將確認(rèn)含有sgrna-1和sgrna-2的引導(dǎo)序列(去除pam位點(diǎn))和骨架序列的質(zhì)粒分別命名為mstn-sgrna1和mstn-sgrna2。骨架序列：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttt(seqidno.12)2.1.7mstn-sgrna1和mstn-sgrna2質(zhì)粒dna的小量制備使用omega的小提試劑盒提取陽(yáng)性質(zhì)粒，操作步驟如下：(1)1.5～5ml菌液以1000g/min，離心1min，室溫下操作。(2)除去上清，加入250μlsolutioni(預(yù)先加好rnasea)，并充分重懸沉淀。(3)向重懸液中加入250μlsolutionii輕柔混勻使細(xì)菌充分裂解。(4)向混合液中加入125μl冰預(yù)冷的buffern3并輕柔充分混勻直至出現(xiàn)白色絮狀混合物。(5)4℃或室溫以12000g/min，離心10min。(6)小心地將上清吸入到1.5ml離心管中，盡量不要吸到沉淀。再加入0.1倍體積的etrsolution。顛倒混勻7～8次，并置于冰上10min。(7)將(6)中溶液放于42℃孵育5min。25℃條件下以12000g/min離心3min。(8)吸取上清液至新的1.5ml離心管中，加入0.5倍體積的無(wú)水乙醇，并輕輕顛倒混勻6～7次。并室溫靜置1～2min。(9)吸取(8)中的混合液700μl至dna結(jié)合柱中，室溫下下以10000g/min離心1min。(10)棄去流出液，向結(jié)合柱中加入500μlbufferhb，室溫下下以10000g/min離心1min。(11)棄去流出液，向結(jié)合柱中加入700μldnawashbuffer，10000g/min離心1min，棄去流出液。(12)再重復(fù)步驟(11)。(13)以最大速度空離結(jié)合柱(≥13000g/min)離心2min。(14)將結(jié)合柱放入1.5ml離心管中，加入30～50μl的無(wú)內(nèi)毒素的elutionbuffer或水，以最大速度離心結(jié)合柱(≥13000g/min)離心1min。2.2mstn-sgrna1和mstn-sgrna2質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄2.2.1制備sgrna和cas9轉(zhuǎn)錄模板(1)制備sgrna1轉(zhuǎn)錄模板：在pcr管中按下述配方組成50μlpcr反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如表1-4。表1-4pcr體系pcr反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30sec；95℃變性5sec，52℃退火10sec，72℃延伸5sec，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min；結(jié)束反應(yīng)。(2)制備sgrna2轉(zhuǎn)錄模板：相關(guān)pcr試劑為vazymephantasuper-fidelitydnapolymerase，在pcr管中按下述配方組成50μlpcr反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如表1-5。表1-5pcr體系pcr反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30sec；95℃變性5sec，52℃退火10sec，72℃延伸5sec，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min；結(jié)束反應(yīng)。(3)制備cas9轉(zhuǎn)錄模板：在pcr管中按下述配方組成50μlpcr反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如表1-6。表1-6pcr體系pcr反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30sec；95℃變性10sec，56℃退火15sec，72℃延伸68sec，重復(fù)34個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min；結(jié)束反應(yīng)。2.2.2純化sgrna轉(zhuǎn)錄模板和cas9轉(zhuǎn)錄模板用transgenpcr純化試劑盒分別純化sgrna1、sgrna2和cas9轉(zhuǎn)錄模板：(1)100μlpcr產(chǎn)物加入5倍體積的bb，混勻加入離心柱中(可靜置1min)，10000g/min，離心1min，棄去流出液。(2)加入650μlwb，10000g/min，離心1min，棄去流出液。(重復(fù)一次)(3)10000g/min，離心1min，去除殘留的wb，并開(kāi)蓋揮發(fā)酒精。(4)向離心柱加入60～70℃預(yù)熱的30～50μl的depc處理水，室溫靜置1min，10000g/min，離心1min。(5)核酸蛋白定量分析儀測(cè)純化pcr產(chǎn)物溶度及od值，分裝純化后的pcr產(chǎn)物，5μl/管，-20℃凍存。2.3以2.2.2中的pcr產(chǎn)物為模板轉(zhuǎn)錄mrna2.3.1轉(zhuǎn)錄并純化sgrna(1)冰上解凍scriptmaxthermot7transcriptionkit(tsk-101)試劑盒中的相關(guān)液體，并表1-7體系加樣，加完樣后將樣品充分混勻，40℃孵育4h。孵育結(jié)束后，加入1μlturbodnase，充分混勻后37℃孵育15min。表1-7體外轉(zhuǎn)錄體系(2)純化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：a、上述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入30μlnuclear-freewater和30μllicl溶液，混勻，-20℃放置至少30min；b、4℃，16000g/min，離心15min；c、除上清，1ml70％乙醇(無(wú)rnase水配制)清洗沉淀，16000g/min，離心15min；d、除去70％乙醇，超凈臺(tái)放置5～10min，無(wú)rnase水溶解沉淀；e、核酸蛋白定量分析儀測(cè)溶度，無(wú)rnase水稀釋至20ng/μl，分裝成5μl/管，-80℃凍存?zhèn)溆谩?.3.2轉(zhuǎn)錄并純化cas9mrna(1)冰上解凍scriptmaxthermot7transcriptionkit(tsk-101)試劑盒中的相關(guān)液體，并按表1-8體系加樣，加完樣后將樣品充分混勻，40℃孵育4h表1-8體外轉(zhuǎn)錄體系孵育結(jié)束后，加入1μlturbodnase，充分混勻后37℃孵育15min。(2)cas9mrna加polya。冰上解凍e.coilpolymerase試劑盒中的相關(guān)試劑，按表1-9體系加樣，加完樣后將樣品充分混勻，37℃孵育45min。表1-9加polya體系(3)純化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：a、向2.3.2(2)中孵育結(jié)束的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入40μlnuclear-freewater和120μllicl溶液，混勻，-20℃放置至少30min；b、4℃，13000g/min，離心15min；c、除上清，1ml70％乙醇(無(wú)rnase水配制)清洗沉淀，13000g/min，離心15min；d、除去70％乙醇，超凈臺(tái)放置5～10min，無(wú)rnase水溶解沉淀；e、核酸蛋白定量分析儀測(cè)溶度，無(wú)rnase水稀釋至80ng/μl，分裝成5μl/管，-80℃凍存?zhèn)溆谩?.設(shè)計(jì)要求和鑒定分析3.1mstn基因敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)要求靶位點(diǎn)在兔mstn基因第三外顯子上的相對(duì)位置如圖1，sgrna的引導(dǎo)序列一般為20bp，pam序列(ngg)，這是設(shè)計(jì)靶序列所必須的。給設(shè)計(jì)的sgrna-1和sgrna-2的引導(dǎo)序列添加粘性末端(tatag)，即可合成sgrna-1和sgrna-2正反向單鏈退火引物，形式為：正向單鏈退火引物:tatagnnnnnnnnnnnnnnnnnnn反向單鏈退火引物:aaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnnc注意反向單鏈退火引物nnnnnnnnnnnnnnnnnnnc為gnnnnnnnnnnnnnnnnnnn的反向互補(bǔ)序列；sgrna-1的單鏈退火引物(5’-3’)：正向單鏈退火引物：tatagccatggtagtagaccgctgt反向單鏈退火引物：aaacacagcggtctactaccatggcsgrna-2的單鏈退火引物(5’-3’)：正向單鏈退火引物：tatagatctttgtgggagtacagca反向單鏈退火引物：aaactgctgtactcccacaaagatc3.2mstn-sgrna1和mstn-sgrna2質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定合成sgrna-1，sgrna-2的正反向單鏈退火引物后，分別退火，退火產(chǎn)物與ysycrispr/cas9二合一質(zhì)粒載體連接，構(gòu)建成crispr/cas9二合一質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)，涂布氨芐瓊脂板，隔夜生長(zhǎng)后挑取單克隆菌落做菌體pcr，pcr產(chǎn)物電泳出現(xiàn)113bp大小條帶的即為陽(yáng)性克隆(如圖1-2)。為進(jìn)一步確定crispr/cas9二合一質(zhì)粒的正確性，將擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶的菌液測(cè)序，進(jìn)行序列比對(duì)，鑒定正確連接的crispr/cas9二合一質(zhì)粒由圖2顯示，1、2、3和6泳道均出現(xiàn)113bp的陽(yáng)性條帶，分別將菌液測(cè)序，然后與兔mstn基因的所設(shè)計(jì)的sgrna-1和sgrna-2的引導(dǎo)序列比對(duì)，結(jié)果均一致，如圖3。最終成功獲得能夠識(shí)別兔mstn基因sgrna-1和sgrna-2靶位點(diǎn)的質(zhì)粒，將它們分別命名mstn-sgrna1和mstn-sgrna2。4.mstn-sgrna1和mstn-sgrna2質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄以mstn-sgrna1，mstn-sgrna2質(zhì)粒為模板pcr擴(kuò)增sgrna-1、sgrna-2(引物3和引物4)及cas9mrna(引物1和引物2)的轉(zhuǎn)錄模板，其大小分別為224bp，224bp及4343bp。以pcr產(chǎn)物為轉(zhuǎn)錄模板，在t7rna聚合酶的作用下，體外轉(zhuǎn)錄sgrna-1，sgrna-2及cas9mrna。其中cas9mrna在細(xì)胞內(nèi)需翻譯成cas9蛋白，因此需在體外加上arca帽和polya結(jié)構(gòu)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)翻譯及防止mrna降解。由圖4顯示1、2泳道為體外轉(zhuǎn)錄的sgrna-1，sgrna-2，3泳道為體外轉(zhuǎn)錄并加arca帽和polya結(jié)構(gòu)的cas9mrna。二、mstn基因突變兔的制備1.材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本專(zhuān)利所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以是普通級(jí)新西蘭白兔或其它品種家兔，雌兔6～8月齡，體重3.5～5kg，種公兔10～12月齡。飼養(yǎng)條件：室溫18～25℃、濕度40％～50％、換氣良好，一天飼喂兩次，每次添加80g顆粒飼料，并提供充足的飲用水。1.2主要儀器體視顯微鏡(廈門(mén)麥克奧迪公司；tms，nikon，japan)；熒光倒置顯微鏡和顯微操作儀(leica公司，德國(guó)；eppendorftransfermannk2公司；ix-71，olympus，日本)；拉針儀(modelp-97,instrument,usa)；co2培養(yǎng)箱(mco-18mthermoforma)；基因擴(kuò)增儀(s1000型，美國(guó)bio-rad公司)；超凈工作臺(tái)(sj-cj-1bq型，蘇州凈化儀器設(shè)備廠)；dna電泳儀和電泳槽(dyy-6b型，南京新校園生物技術(shù)研究所)；數(shù)碼凝膠成像儀(gis-1000型，上海天能科技有限公司)；制冰機(jī)(sim-f124型，日本三洋公司)；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(pyx-dhs-350-bii型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；電子天平(fa1604，上海精密天平)；ph檢測(cè)儀(ha405-k2型，梅特勒-托利多集團(tuán)上海分公司)；電恒溫干燥箱(micro-4hybaid)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(biofuge公司，德國(guó)；eppendorf公司，德國(guó))；低速臺(tái)式離心機(jī)(80-2型，上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠)；實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器(eped-20tf型，南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)；電熱恒溫水槽(dk600型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；移液器(eppendorf公司，德國(guó))；普通冰箱(青島海爾公司)；–80℃超低溫冰箱(日本三洋公司)；恒溫培養(yǎng)搖床(is-rdv1，南京暢翔儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)；核酸蛋白定量分析儀(onedroptmod-1000+，基因集團(tuán)，上海儀濤生物儀器有限公司)；超聲波清洗器(kq-300de型，昆山市超聲儀器有限公司)。1.3主要器材小動(dòng)物常規(guī)保定架，玻璃毛細(xì)管(dcg-10，dc-10型，narishige，日本)，注射器，硅化平皿和玻片，自制移卵管和吸管，胚胎培養(yǎng)方杯，接卵杯等，臺(tái)秤。1.4主要試劑及藥品nah2co3、kcl、kh2po4、k2hpo4、na2hpo4、edtana2、nacl等細(xì)胞測(cè)試級(jí)試劑(均購(gòu)自sigma公司)；m16(m7292-100ml，sigma公司)；m2(m7167-100ml，sigma公司)；fsh(110044629，寧波市三生藥業(yè)有限公司)；hcg(091217b，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠)；penicillin-streptomycin(ps)和fetalbovineserum(fbs)購(gòu)自hyclone公司；pgem-teasyvector(a1360，promega)t-4ligase(購(gòu)自promaga公司)；dna聚合酶(dnapolymerase)、dntp、dnamarker(dl2000)均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，實(shí)驗(yàn)中其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，分別購(gòu)自南京生興生物有限公司，上海生工生物有限公司，南京諾唯贊生物有限公司，等。1.5主要試劑配制(1)沖卵液稱(chēng)取10gnacl、0.25gkh2po4、0.25gkcl和1.44gna2hpo4，加900雙蒸水溶解后定容至1000ml，高壓滅菌，分裝50ml/瓶，-4℃保存。(2)組織裂解液稱(chēng)取2.4228gtris-base、7.444gedtana2和1gsds，加150ml滅菌雙蒸水溶解后定容至200ml，高壓滅菌，分裝，-20℃保存。(3)lb液體培養(yǎng)基稱(chēng)取5g蛋白胨、2.5g酵母粉和10gnacl，溶于400ml雙蒸水，定容至500ml，調(diào)ph至7.5，高壓滅菌冷卻至常溫待用。(4)lb固體培養(yǎng)基稱(chēng)取1g蛋白胨、0.5g酵母粉、1gnacl和1g瓊脂粉，溶于90ml雙蒸水，定容至100ml，高壓滅菌，待溫度降至室溫，加入amp混勻后鋪板后待用。(5)氨芐青霉素(amp)用4ml滅菌雙蒸水溶解1g氨芐青霉素，配成濃度為250mg/ml的儲(chǔ)液，分裝，-20℃保存。(6)x-gal溶液稱(chēng)取20mgx-gal粉末加入到1ml二甲基甲酰胺溶液混勻，分裝，避光于-20℃保存。(7)iptg溶液稱(chēng)取2giptg粉末，加入雙蒸水，定容到10ml。分裝，避光于-20℃保存。(8)質(zhì)粒提取溶液溶液ⅰ：稱(chēng)取0.30285gtris、0.37224gedtana2和0.9008gglucose，加90ml雙蒸水溶解，定容至100ml，調(diào)ph至8.0，高壓滅菌，4℃保存。溶液ⅱ：分別配制0.2mnaoh和1％sds溶液，使用是1:1體積混勻。溶液ⅲ：3mnaac，以冰醋酸調(diào)至ph5.5。2.方法2.1供體兔超數(shù)排卵與供受體同期發(fā)情每組實(shí)驗(yàn)挑取兩只未發(fā)情的母兔作為超排供體兔，母兔外陰泛白，略干燥可認(rèn)為未發(fā)情。采用連續(xù)6次fsh劑量遞減法對(duì)每只供體母兔的腿部肌肉注射fsh，fsh的總量為60iu，上下午各注射一次(8:00和20:00)，遞減依次為15iu、15iu、10iu、10iu、5iu、5iu。在最后一次注射fsh12h后，每只供體兔耳緣靜脈注射100iuhcg，隨之與正常公兔配種。供體兔配種完成后隨即挑選受體母兔2～4只作為受體，發(fā)情良好母兔作為受體移植懷孕率高。為保證與供體兔同步發(fā)情，每只受體兔耳緣靜脈注射100iuhcg，作為受體兔。將供受體兔均做饑餓處理。2.2回收供體兔受精卵供體兔注射hcg后18～20h，常規(guī)輸卵管傘部回收受精卵，在體視顯微鏡下?lián)烊∈芫?，?jì)數(shù)并移至m16培養(yǎng)液中，置于38℃、5％co2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.3mrna顯微注射兔受精卵(1)制備顯微注射針(距針尖50μm處直徑10～15μm，針口0.5μm～1.5μm)，及制備持卵固定針(外徑120～150μm，內(nèi)徑10～20μm)。(2)從–80℃超低溫冰箱取出分裝好的cas9mrna和sgrna，等體積混合，cas9mrna和sgrna終溶度分別為40ng/μl和10ng/μl。(3)在倒置顯微鏡上組裝好注射針與固定針，用無(wú)rnase的虹吸管吸取cas9mrna和sgrnamrna混合物注入注射針內(nèi)，然后調(diào)試焦距，使注射針在視野內(nèi)清楚可見(jiàn)。(4)將受精卵移至m2操作液滴中，調(diào)整顯微鏡直到視野內(nèi)可清楚地觀察到受精卵。(5)輕輕落下注射針及固定針，對(duì)準(zhǔn)卵表面調(diào)焦，與受精卵基本在同一平面。(6)固定針輕柔地固定受精卵，注射針尖對(duì)準(zhǔn)卵中心位置調(diào)焦，使針尖清晰可見(jiàn)，然后小心地刺入受精卵的胞質(zhì)。(7)注射器稍稍施加壓力，觀察到注射針尖有液體流出，即完成了一次完射，重復(fù)該過(guò)程直至所有受精卵注射完畢，如圖5。2.4胚胎移植常規(guī)胚胎移植，移植前需觀察顯微注射卵的存活率，剔除死卵和狀態(tài)不好的卵。輸卵管和卵巢，觀察卵巢是否有排卵點(diǎn)或者濾泡即可移植。胚胎移入輸卵管，在輸卵管壺腹部注入受精卵。一般情況下，母兔懷孕30天左右會(huì)自然分娩，常規(guī)母兔產(chǎn)后護(hù)理及仔兔哺乳。3.技術(shù)效果判定和基因突變檢測(cè)3.1mstn基因突變檢測(cè)3.1.1兔基因組的提取(1)出生后2～3周的仔兔無(wú)菌剪取耳尖組織，并剪取正常兔耳組織，放入指形管內(nèi)并剪碎，加入750μl組織裂解液和7.5μl蛋白酶k(25mg/ml)，55℃旋轉(zhuǎn)消化，直至肉眼觀察不到組織塊為止。(2)12000rpm離心，10min，取黏稠上清于另一潔凈指形管，加入750μl苯酚，顛倒混勻，12000rpm離心，10min。(3)取上清于另一潔凈指形管。(4)加入750μl1:1的苯酚:氯仿混合物，顛倒混勻，12000rpm離心，10min。(5)取上清于另一潔凈指形管中，加入750μl氯仿，顛倒混勻，12000rpm離心，10min。(6)取上清于另一潔凈指形管中，加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇1ml，顛倒混勻，沉淀基因組dna(白色絮狀)。(7)挑取白色dna團(tuán)塊，加入1ml70％乙醇充分洗滌，12000rpm離心，5min。(8)棄上清，沉淀物質(zhì)經(jīng)37℃烘干。(9)根據(jù)基因組的量加入20～50μl滅菌雙蒸水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?.1.2仔兔mstn基因pcr檢測(cè)與測(cè)序?yàn)榱朔奖憧煽康貦z測(cè)兔的mstn基因敲除情況，應(yīng)用軟件primer5.0針對(duì)兔mstn基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，引物信息見(jiàn)表2-1。表2-1引物信息按表2-2制備pcr反應(yīng)體系，表2-2pcr體系pcr反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性50sec，48℃退火45sec，72℃延伸1min，共33個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃保存。取5μlpcr產(chǎn)物于1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，初步判定仔兔mstn基因突變情況。為了進(jìn)一步驗(yàn)證所獲得的仔兔的mstn基因是否發(fā)生突變，將pcr產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，并應(yīng)用dnastar序列分析軟件與擴(kuò)增模板標(biāo)準(zhǔn)序列作比對(duì)，用chromas軟件觀察測(cè)序峰圖套峰情況。3.1.3仔兔mstn基因pcr擴(kuò)增產(chǎn)物ta克隆為鑒定mstn基因突變陽(yáng)性兔的突變類(lèi)型，進(jìn)一步將pcr產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示為mstn基因突變pcr產(chǎn)物與pgem-t克隆載體連接。連接pgem-t克隆載體前用transgenpcr純化試劑盒純化pcr產(chǎn)物。純化獲得的pcr產(chǎn)物與pgem-t克隆載體按如下公式進(jìn)行量的計(jì)算：按照連接酶體系說(shuō)明，制備反應(yīng)體系，反應(yīng)體系見(jiàn)表2-3：表2-3dna連接體系反應(yīng)條件：4℃連接過(guò)夜。3.2本專(zhuān)利技術(shù)產(chǎn)生的效益及生產(chǎn)性能提高評(píng)判3.2.1評(píng)判方法從9周齡起逐日稱(chēng)取實(shí)驗(yàn)組兔(m1～m11)和正常陰性兔(wt1～wt10)的體重。做好記錄。用spss20.0統(tǒng)計(jì)軟件分別計(jì)算出9～14周齡的雄兔(包括mstn突變雄兔和正常陰性雄兔)、雌兔(包括mstn突變雌兔和正常陰性雌兔)和mstn突變兔(包括雄兔和雌兔)的體重周增量進(jìn)行系統(tǒng)方差分析并進(jìn)行duncan氏法進(jìn)行多重比較，以p<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。最初實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目的是制備具有雙肌表型的mstn基因突變兔。為了盡可能的使突變的mstn基因降或喪失生物活性，而且盡可能的使得對(duì)mstn基因的功能產(chǎn)生抑制作用，同時(shí)考慮到n-端的266個(gè)氨基酸發(fā)揮功能前是被切除的，避免將突變?cè)O(shè)計(jì)在切除的266個(gè)氨基酸內(nèi)而造成對(duì)成熟肽功能無(wú)影響的情況發(fā)生，因此將mstn基因靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)在成熟肽區(qū)域?？紤]到后期仔兔mstn基因突變檢測(cè)情況，用dnastar軟件分析兔mstn基因成熟肽區(qū)酶切位點(diǎn)，由于常用酶切位點(diǎn)稀少，且設(shè)計(jì)crispr/cas9靶位點(diǎn)需要pam序列，因此并未找適合于后期突變檢測(cè)的常用酶切位點(diǎn)的靶位點(diǎn)，使得后期的初步檢測(cè)只能使用基因測(cè)序手段。3.2.2本技術(shù)獲得效果與設(shè)計(jì)的一致性用設(shè)計(jì)的一對(duì)引物(cas9sg123-1和cas9sg123-2)對(duì)正常兔mstn基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到的目的條帶大小為498bp，同樣對(duì)本實(shí)驗(yàn)所獲得的16只仔兔mstn基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后1％凝膠電泳，eb染色，紫外光下拍照觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。若mstn基因缺失或增添?xiàng)l帶較大，與正常條帶對(duì)比即可區(qū)別開(kāi)來(lái)，即能初步判定仔兔mstn基因突變情況。對(duì)于缺失或增添?xiàng)l帶或僅僅發(fā)生堿基置換的情況，只有通過(guò)后續(xù)的pcr產(chǎn)物測(cè)序或pcr產(chǎn)物ta克隆后測(cè)序來(lái)鑒定。觀察mstn基因pcr電泳圖發(fā)現(xiàn)，第6、8、12泳道的電泳條帶明顯小于第2泳道的正常對(duì)照條帶，其余泳道條帶大小變化無(wú)法肉眼識(shí)別，只能后續(xù)基因測(cè)序判定。所獲得的仔兔中有3個(gè)仔兔可初步判定為mstn基因敲除成功，為進(jìn)一步鑒定所獲兔基因突變情況，將獲得的16只仔兔及正常對(duì)照兔的pcr產(chǎn)物測(cè)序。16只仔兔及正常兔的mstn基因組pcr產(chǎn)物測(cè)序完成后結(jié)果顯示：m1～m9、m11和m13～m16的pcr產(chǎn)物測(cè)序峰圖顯示套峰，m1～m7的測(cè)序圖譜在sgrna-1位點(diǎn)附近存在多種堿基信號(hào)，m8～m9、m11和m13～m16的測(cè)序圖譜在sgrna-2位點(diǎn)附近存在多種堿基信號(hào)，表明m1～m9、m11和m13～m16兔的mstn基因存在突變，為mstn基因突變兔。如圖7，8，9。m5兔pcr測(cè)序圖譜出現(xiàn)套峰結(jié)構(gòu)，與正常兔的pcr測(cè)序圖譜對(duì)比發(fā)現(xiàn)多個(gè)堿基突變，圖中黑色箭頭所指表示堿基置換，黑色三角所指表示堿基缺失，由圖9對(duì)比可見(jiàn)，m5產(chǎn)生了兩個(gè)堿基置換：t→a和g→a，一個(gè)堿基缺失。正常兔、m10和m12的pcr產(chǎn)物測(cè)序峰圖未見(jiàn)套峰結(jié)構(gòu)。通過(guò)m10和m12的pcr產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與正常兔mstn基因組比對(duì)，發(fā)現(xiàn)m12的測(cè)序序列與正常兔序列一致，即m12兔未發(fā)現(xiàn)mstn基因突變，為mstn基因突變陰性兔。m10測(cè)序序列與正常兔mstn基因組后發(fā)現(xiàn)其缺失136bp，6個(gè)堿基置換，而測(cè)序峰圖只有單一的堿基信號(hào)，表明m10的mstn基因的兩條染色體突變情況一致，即m10為純合子，m10與正常兔峰圖對(duì)比情況見(jiàn)圖9，黑色箭頭所指的堿基表示置換堿基位置，m12與正常兔的pcr產(chǎn)物測(cè)序峰圖對(duì)比可見(jiàn)，兩者結(jié)果一致，未見(jiàn)套峰。應(yīng)用本技術(shù)產(chǎn)生的仔兔mstn基因組pcr產(chǎn)物測(cè)序無(wú)法鑒定mstn基因的兩條等位基因的突變情況。因此，將仔兔mstn基因組pcr產(chǎn)物插入ta載體，通過(guò)ta克隆測(cè)序鑒定每個(gè)mstn基因突變兔的兩條等位基因的突變類(lèi)型。結(jié)果顯示，15只mstn基因突變兔的突變類(lèi)型有基因缺失、基因插入、堿基替換，主要以基因缺失為主，缺失堿基數(shù)在1～169bp之間，部分仔兔的mstn基因缺失同時(shí)還存在堿基替換或(和)堿基插入，共獲得10只mstn突變兔，詳見(jiàn)圖13和圖14。m1～m6的mstn基因組pcr產(chǎn)物ta克隆測(cè)序結(jié)果顯示這6只仔兔mstn基因的兩條染色體均發(fā)生突變，堿基突變情況詳見(jiàn)表2-4，表明mstn-sgrna1質(zhì)粒在兔mstn基因所設(shè)計(jì)sgrna-1靶位點(diǎn)是有活性的，且敲除效率極高，達(dá)到了100％。表2-4除了m6的第二條染色體上的mstn序列外其余序列均因靶位點(diǎn)突變?cè)斐砷喿x框移碼。m1一條mstn基因缺失10bp，另一條缺失2bp，替換3個(gè)bp，造成m1兔的mstn兩條等位基因編碼的第372，374位半胱氨酸均缺失，一條染色體的mstn基因編碼的第375位氨基酸成為半胱氨酸。m2兔的一條mstn基因缺失52bp，使得mstn基因編碼的第372，374位半胱氨酸缺失，第361位氨基酸成為半胱氨酸，另一條缺失2bp，替換1個(gè)bp，也使得mstn基因編碼的第372，374位半胱氨酸缺失，移碼突變后，第378位氨基酸成了半胱氨酸。m3兔的一條mstn基因缺失26bp，另一條增添7bp，替換1個(gè)bp，使m3兔的mstn兩條等位基因編碼的第372，374位半胱氨酸均缺失。m5兔的一條mstn基因替換5個(gè)bp，插入31個(gè)bp，另一條缺失1個(gè)bp，替換1個(gè)bp，翻譯后，兩條mstn基因編碼的第372，374位半胱氨酸均缺失，后者編碼的第378位氨基酸成為半胱氨酸。m6兔的一條mstn基因缺失10個(gè)bp，另一條缺失9個(gè)bp，兩條mstn基因編碼的第372，374位半胱氨酸均缺失，后者未發(fā)生移碼突變，僅僅缺失了3個(gè)氨基酸，包含2個(gè)半胱氨酸，前者發(fā)生移碼突變，除了缺失2個(gè)半胱氨酸，第375位成為半胱氨酸。m4兩條mstn基因均缺失較多，一條缺失159bp，替換1bp，另一條缺失169bp，使得兩條mstn基因編碼的第339、340、372，374位半胱氨酸均缺失，后者所編碼的第322位氨基酸成為半胱氨酸。mstn-sgrna1質(zhì)粒在兔mstn基因所設(shè)計(jì)sgrna-1靶位點(diǎn)是針對(duì)第372位半胱氨酸的，m1～m6的mstn基因組pcr產(chǎn)物ta克隆測(cè)序結(jié)果可知，m1～m6兔mstn兩條等位基因編碼的第372，374位半胱氨酸均缺失，達(dá)到sgrna-1靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)目的，又由于m1、m2、m4、m5、m6兔的一條或兩條基因移碼突變，形成新的半胱氨酸，但與野生型mstn基因編碼的氨基酸序列相比，形成的新的半胱氨酸與預(yù)先設(shè)計(jì)敲除的半胱氨酸位點(diǎn)是不同的。m8～m11的mstn基因組pcr產(chǎn)物ta克隆測(cè)序結(jié)果顯示這4只仔兔mstn基因的兩條染色體均發(fā)生突變，堿基突變情況詳見(jiàn)表2-6，表2-6除了m9-1和m11-1外其余序列均因靶位點(diǎn)突變?cè)斐砷喿x框移碼。m10兔是mstn基因突變純合子兔，它的mstn基因的兩條等位基因均缺失136bp，替換6bp，造成mstn基因編碼到第290位氨基酸即停止翻譯，導(dǎo)致剩余的85位氨基酸丟失，其中包括第309、313、339、340、372、374位半胱氨酸。m8兔的一條mstn基因增添2bp，另一條缺2bp，替換2bp，分別使得兩條基因編碼的第340、372、374位半胱氨酸缺失，第346、351位成為半胱氨酸和第340位半胱氨酸缺失。m9兔的一條mstn基因缺失12個(gè)bp，另一條插入1bp，1個(gè)堿基替換，前者使得mstn基因編碼的第339、340位半胱氨酸缺失，后者使得第340、372、374位半胱氨酸缺失。m11一條mstn基因缺失3個(gè)bp，另一條增添1bp，前者使得mstn基因編碼的第339位半胱氨酸缺失，后者使得第340位半胱氨酸缺失。由以上測(cè)序結(jié)果的氨基酸翻譯結(jié)果來(lái)看，m8～m11兔mstn兩條等位基因編碼的第309，340，372，374位半胱氨酸均有不同程度的缺失，表明mstn-sgrna2質(zhì)粒在兔mstn基因所設(shè)計(jì)sgrna-2靶位點(diǎn)是有活性的，而且活性較高，達(dá)到了88.9％。以上數(shù)據(jù)表明：本專(zhuān)利技術(shù)用于制備mstn基因編輯兔與設(shè)計(jì)要求是完全一致的，技術(shù)效果是可行、可靠和精準(zhǔn)的。3.2.3本技術(shù)的生產(chǎn)性能分析家兔在2～3月齡處于生長(zhǎng)旺盛期，選取mstn基因突變兔和正常陰性兔9～14周齡的生長(zhǎng)階段用于比較mstn基因突變兔和正常陰性兔的生產(chǎn)性能差異。mstn基因突變兔及正常兔的體型對(duì)比采集部分mstn突變兔與正常兔的體型對(duì)比照片，如圖10，m3、m5、m6和m10的肩部及臀部與正常兔相比均顯得寬闊且結(jié)實(shí)；圖11為剝離m9兔便可看到豐滿的肌肉。m9兔在18周齡因麻醉不當(dāng)死亡，對(duì)其進(jìn)行剝離皮毛觀察，可見(jiàn)其周身多處肌肉組織豐滿，表現(xiàn)出雙肌表型，從圖2-9中a、c、e可見(jiàn)m9豐滿的后軀肌肉和健美的臂部及肩背部肌肉。而d代表周齡相接近的正常陰性兔，其肌肉組織豐滿度與m9差異明顯，不表現(xiàn)雙肌表型。mstn基因突變兔及正常兔在9～14周齡的體重增長(zhǎng)情況在保持mstn基因突變兔和正常陰性兔飼養(yǎng)管理水平一致的情況下，從9周齡起逐日稱(chēng)取mstn基因突變兔和正常陰性兔的體重，一直稱(chēng)到14周齡。做好記錄。算出mstn基因突變兔和正常陰性兔的每周的平均體重。并整理成表格，如表2-6和2-7。表2-6mstn基因突變兔9～14周齡體重表(單位：g/只)表2-7正常陰性兔9～14周齡體重表(單位：g/只)用spss21.0軟件對(duì)mstn基因突變兔與正常陰性兔在9～14周齡的體重周增量進(jìn)行系統(tǒng)方差分析。該試驗(yàn)中，將總變異分解成處理(mstn基因突變與正常陰性兔)、性別、周齡(9、10、11、12、13、14周齡)、處理與周齡的相互作用、性別與周齡的相互作用、處理與性別間的相互作用以及處理、周齡與性別的相互作用。表2-8mstn基因突變兔與正常陰性兔9～14周齡體重變化方差表查f表，當(dāng)df1＝1，df2＝70時(shí)，f0.05(1，60)＝4.00，f0.05(1，80)＝3.96；當(dāng)df1＝1，df2＝70時(shí)，f0.01(1，60)＝7.08，f0.01(1，80)＝6.96；當(dāng)df1＝4，df2＝70時(shí)，f0.05(4，60)＝2.53，f0.05(4，80)＝2.49；當(dāng)df1＝4，df2＝70時(shí)，f0.01(4，60)＝3.65，f0.01(4，80)＝3.56。由表2-8可知處理(mstn基因突變與正常陰性兔)的f＞f0.01，表明mstn基因突變與正常陰性兔在體重增長(zhǎng)方面存在極顯著差異；因?yàn)?～14周齡正為兔生長(zhǎng)旺盛期，周齡的f必然大于f0.01，性別、周齡(9、10、11、12、13、14周齡)、處理與周齡的相互作用、性別與周齡的相互作用、處理與性別間的相互作用以及處理、周齡與性別的相互作用的f＜f0.05，表明，性別，周齡及處理之間的相互作用不顯著，表明mstn基因突變兔與正常陰性兔在體重增長(zhǎng)方面的極顯著差異是由mstn基因突變的因素造成。同時(shí)運(yùn)用duncan法對(duì)mstn基因突變兔和正常陰性兔進(jìn)行多重比較以及對(duì)mstn基因突變兔的不同個(gè)體進(jìn)行多重比較，結(jié)果以體重周增量平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。表2-9雄兔9～14周齡體重平均周增長(zhǎng)表(單位：g/只)注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05)，有相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著。由表2-9、2-10可知mstn基因突變雄兔(m2、m6和m8)與正常陰性雄兔(wt1～wt5)在9～14周齡的體重平均周增量存在顯著差異，同樣mstn基因突變雌兔(m1、m3、m4和m5)與正常陰性雌兔(wt6～wt10)在9～14周齡的體重平均周增量存在顯著差異，m10與正常陰性雌兔(wt6，wt8～wt10)在9～14周齡的體重平均周增量雖然差異不顯著，但體重平均周增量的平均值均高于正常陰性雌兔組。通過(guò)mstn基因突變兔的9～14周齡的體重平均周增量的多重比較發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)表2-11)，不論是雄性或雌性mstn基因突變兔，它們的9～14周齡的體重平均周增量差異不顯著。為整體分析mstn基因突變兔和正常陰性兔的兩個(gè)群體的體重生長(zhǎng)趨勢(shì)及兩者的生長(zhǎng)差異性，同時(shí)考慮性別對(duì)mstn基因突變兔和正常陰性兔個(gè)體的影響，因此分析同種性別的mstn基因突變兔和正常陰性兔的體重生長(zhǎng)情況，按表2-7和2-8分別整理出雌雄mstn基因突變兔和雌雄陰性兔9～14周齡平均體重情況，整理數(shù)據(jù)見(jiàn)表2-13，并依據(jù)表2-13的數(shù)據(jù)計(jì)算出mstn基因突變兔與正常陰性兔的每周的增重率見(jiàn)表2-14。表2-10雌兔9～14周齡體重平均周增長(zhǎng)表(單位：g/只)注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05)，有相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著。表2-11mstn基因突變兔9～14周齡體重平均周增長(zhǎng)表(單位：g/只)table2-12themstngenemutationrabbits'averageweeklygrowthofbodyweightfrom9to14weeksold(unit:g/each)注；不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05)，有相同小寫(xiě)字母或不標(biāo)字母表示差異不顯著。表2-12mstn基因突變兔與正常陰性的9～14周齡平均體重情況(單位：g/只)表2-13相同性別mstn基因突變兔比正常陰性兔的9～14周齡體重增重率注：-表示雄性mstn基因突變兔比雄性正常陰性兔體重增重率♀+/♀-表示雌性mstn基因突變兔比雌性正常陰性兔體重增重率從表2-12及圖12可以看出在同一周齡段雄性mstn基因突變兔平均體重?cái)?shù)值均比雄性正常陰性兔大，同樣雌性mstn基因突變兔平均體重均比雌性正常陰性兔大，表明在同一生長(zhǎng)期mstn基因突變兔體重值比正常陰性兔的大。從表2-13可看出在9～14周齡雄性mstn基因突變兔的平均體重比雄性正常陰性兔增重13.05～26.74％，雌性mstn基因突變兔的平均體重比雌性正常陰性兔增重1.63～17.91％，到14周齡時(shí)雌雄mstn基因突變兔的平均體重比雌雄正常陰性兔增重17.91％和26.74％。由圖2-9和表2-14可看出在9～14周齡階段mstn基因突變兔與正常陰性兔體重均隨著時(shí)間延伸而不斷增加，且相同性別的mstn基因突變兔與正常陰性兔的體重周增重率在9～14周齡間的增加趨勢(shì)越發(fā)明顯。以上數(shù)據(jù)表明：本專(zhuān)利技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)兔mstn特定位點(diǎn)的基因突變，設(shè)計(jì)的突變位點(diǎn)可實(shí)現(xiàn)肌肉增長(zhǎng)加速和個(gè)體肌肉總體含量顯著提高的目的，在畜牧生產(chǎn)和品種改良方面有較高的應(yīng)用價(jià)值。sequencelisting<110>揚(yáng)州大學(xué)<120>一種兔mstn基因的編輯方法<130><160>14<170>patentinversion3.3<210>1<211>6980<212>dna<213>新西蘭兔<400>1atgcaaaaactgcaaatctatgtttatatttacctgtttatgctgatcgtggctggccca60gtggatctaaatgaaaacagtgagcaaaaagaaaatgtggaaaaagacgggctgtgtaat120gcatgcacttggagacaaaacagtaaatattcaagaatagaagccataaagattcaaatc180ctcagtaaacttcgcctggaaacagctcctaacatcagcaaagatgctataagacaactt240ttacccaaagctcctccactccgggaactgattgatcagtacgacgttcagagggatgac300agcagtgatggctctttggaagatgacgattatcacgctacgacggaaacaatcattact360atgcctaccgagtgtaagtagtcctattagtgtatgtcaacagttctgctgactgttgtt420ctagtgtttatgggaaacagatctattttcaggctcttttaataagctgtcagcttttat480gtaagaagcaggaaagacagtctcttcttttcaagattttgtgagaaatatgttgaaact540gaaatctgtcacactgtctgtttccttaaaaagctaaaaagctaaaagataaaaagcttg600cacagcgttaatattatctagtttaattggcaaatacagcatgcttatgccttcacagcc660tcataccaaccagcaaggcgaggactggcagatactacagcaatgttaaaaactcacagg720gaattttataagtgcacttgtaaaccaaaatatgcatttattacaataagcttttcacta780gtaataaagaaaggaaggaacttgctagaattttaagcttctttgagcactgctgaacac840ctccagtgatttctgttattccaaactccttcacagtgttttgtgtgcttcacagattaa900aatgtttcctttcggaggctattacactgaggagcaagaaaatattttaaatactttatg960tattagtaagagcaatgacgaaataaaccgtgacttcaaattcagaaaatgtctaggaaa1020taaacacttcagttgggcaagttacggctcctgaagtcctctcgtaccttgaccatggtg1080ctattgttggcagtactgagtgtgtgtatttccaagcaggcgtactgcttaataaccttc1140gcgaatatttcattcttcataatggaacgactattacctgtagtatcaacgttgctcctg1200gaagaaaatgtatttcctacaattcctctttcggtaggctcgaaagaatactttcacccg1260gaaagggaaacagacaccttgacagagaaggcacggcaagaatgattttgaggccatgtg1320tctgtgatcttgctttaacacagttctttgtaagctttaaaccggactcaaaacagtttc1380atagtattgtttcccttattcagtaatcagattacagtgcaacaaataattttcctttaa1440gaatttcctaccaaatagtgctggagtagattgaccttatttatcaatgatttttgaaag1500ccaaaagaatttgttcatgcttgtctttagaatgacagctcagacataaaggcaaacttt1560tgagacagcctgaatataacatcaaacttctctcctaattacttgcttagttttgtttct1620ttaaaaggatattcctgagccaaaacctcccggaaatactatattttctactgtttccta1680aggctcagtaagttgctcagtgcgtcttgtccccaggtaattcaggcctgggggaagggt1740tccttcttccagactgatcggtacagctgctccgtcagcgtaactactcagattcccaaa1800gaattctaagtggatgttcctccacagtgtctcttgttctctctaatcatcatcattttc1860aaatttcatccactgctcattccttcccagaattttccttagcctgcagttccttggaag1920gggagcagattcttcacaaatggttgaaagtacctatgtctaaagaattctgaaaagcca1980gactaattattttccttgatattttctcggtattatgaatgaagttttacctagtatttc2040atttacatatgcatgcattatcccaatagaaaaaatacccaactattagtaaggagggat2100tttgttaacttattaatgaaaaataatttcaggaactcttgtcttattcgtttatagctg2160attttctaatgcaagtggaaggaaaacccaaatgttgcttctttaaatttagctctaaaa2220tacaatacaataaagtagtaaaggcacaactatggatatatctgagacccgtgaagactc2280ctacaacagtgtttgtgcaaatcctgaggctcatcaaacctatgaaagacggtacaaggt2340atactggaatccgatctctgaaacttgacatgaacccaggcactggtatttggcagagca2400ttgatgtgaagacagtgttgcaaaattggctcaaacaacctgaatccaacttaggcattg2460aaatcaaagctttagatgagaatggtcatgatcttgctgtaaccttcccaggaccaggag2520aagatgggctggtaagtgataactgaaaagaaccctctagtaaccttgttatgtttttgt2580tcctaatatgaatgaataaaagtgggaaacaactaccgatttcctatgctcatgagccag2640acaaaggtatcttactccaatggtagccctgtacccaataaaagtaggtgtccaatttca2700tatcctatgaaaaactcccttgatacccttcgtttgcatgagagtttataaaaacaatta2760taccatggttcttaacttcttaagaagttcttttgaattgagaatgaaatataaactgct2820tttcattgatatgctacatgcttatatgaataaaatatgaactgtatataatgaattcca2880gttcataccccaaaaatcagacttttcttttcctctccaaagggtgccaaatgtgttgac2940aagttctggcttagtataaagcaagaaaaaaacctaactttagtctgcttctttttatct3000ctgtctttcaaataaaatgaaaaaatgtaaagcatcataatgaaagtaaaatactttcat3060ttgtagcaattaactaattagtataaaaattatattataataaatatattatatttaagg3120tccctaatggtaagcatgttcattacttgatgcacttatctatggattattatgtgaaat3180accctctaaggacagttttagtttctaagccagttagcttttaccacttaacttatttct3240aagctggtttagcattcttgcacaagaatttgacaactaacttagtatcaggcaaaatag3300atggcaatattttgcatattataaaatgaataaaaactattttaaaacctagcataaatt3360tagggctactcttttggcctatctatgtttctgtttacttctgctttcaaaaacttattt3420aatatgacaatattttttcatggacatctactgacataattttcaatagaatatacttat3480aaaaatgaacattagttatctttttaatctctaactggtcttgtttataaacattatata3540ataagtaaatcagatctatttcaaatgaaaacattctttaaaagactatacaattttcta3600aatgacttgtttttcttatatgtattaatttaaatgctatgaattcccaaaaataacatt3660ggtttggactgggttaaataacagtaactatcacatctgttttcattttaataaaggaca3720aaagctattatcaattatttaaaaaagcattcttttttacaagtagtatcttaatgatca3780aagttgatgatatcacagcttttaattattaaacacgtggttaatatggtgcattcttat3840ctttccatataatacagaacaaaatctcaaatgcattagaagactgggagagtgacagta3900ctaacaaatgattatatgaatatgtgaatgaaaacattctgcaacacctacttttctgaa3960tttttctcataggggttctcttttcagtccaatatacacatcaccaccttcatcaatcac4020ttagctttcttttcccattataacttatacactgctgggaggtagctctagctttaatac4080ccaagtttccctgagtaaagatccacagatacagaggatagatgactatactcatccctc4140caggaatcatctcacatatttggccaacatattgaatcaacgcatgtgaagagaaggagc4200ccatctttttcttcctctgcctctccttccacctccccctccctttctcgccagacagat4260tttcaggacatctatcatgtgctaggcagttggatactacaactagggacaacaaaaatt4320aaaagcacatagaactggcctcagggggatttgcattactgctataatctttgagctatg4380aggggaaaatcaaaactattataaatcaaatccttagtatgatgccttttaaatataaag4440gtattccaagcaaaatgattcatttttcttaaggtaaaaaaagtgctttagaataaattg4500atatacttatcgttctttccttttcacacagaatccctttttagaggtcaaggtaacgga4560cacaccaaaaagatccagaagagattttggtcttgactgtgatgagcactcaacagaatc4620acgatgctgtcgctaccctctaactgtggattttgaagcttttggatgggattggattat4680tgcgcccaagagatacaaggccaattactgctctggagagtgtgaatttgtgtttttaca4740aaagtatcctcatactcatcttgtacaccaagcaaaccccagaggttcagcaggtccttg4800ctgtactcccacaaagatgtctccaattaatatgctatattttaatggcaaagaacaaat4860aatatatgggaaaattccagccatggtagtagaccgctgtgggtgctcatgagatttgca4920tttggtttttaacttcctaaaacatggaaggtcttcccctcaacaattttgaaactgtga4980aattatgtaccataggctataggcctagagtatgctatagtcacttaaacacaagttaca5040gtgtatgaactaaaagagagaatacatgcaatggttggcatttaaccatcaaaataaatc5100atacaataggaagttttatgatttccagagtttttgaactagaaggagatcaaattatat5160ttacattcaactatgttacaacctaatcaaaaaagtaaagcaattctccttgtgttctga5220tgaatcaaaggagtatgtgttaaagtttatttctttgcagttttgtttaatatttacagc5280aaaatccatgtatagtattggtaaaatgcaggactgttatatgccatcatttgaatcatc5340cttaaacacttgaacttttattttatgatagcatacttggtaagataaaattccacaaaa5400atagggatggtctaccatatgcaagtttccattcctattatgattggtaccatacattaa5460caatccatgccaatggtgctaggataataggctggatgactggtgttatcaggatttcaa5520atataaaacattcggtaaaatgagtttctccttttttcaggtgcattttcatacatctcc5580aaatgaggaatagattttctttaatcaaagaaggatcatttttctagaggtcaactttga5640attctgtagcatattggaggaactatactatattaagaggcagccaaataatattaattt5700taaatgaaattttaagaccacagcctgcctttgcaacactgcagtttttatgacaaaata5760atggaaatgattatatcaatattgtataaaaagactttaaaacaattgcatttatgtaat5820atgtatacaatattgttttgtaaataaatgtctccttttttatttactttggtatatttt5880tacactaaggacatttcaaattaagtattaaggcacaaaaatgtatcacagaaaagcaat5940tgctcatatttcagagcaaattagcagattaaatagtggtcttaaaacaccatatgttaa6000tggttagatggttatattacaatcattttatatttttttacattattaacattcactatg6060gattcataatgactgtataatgtgaatgtggaatttcaatggtttactgtcattgtattc6120aaatctcaacgttccattattttaatatgtataatattactaagtatatcaaaatgatta6180actccattatctgaaatgaagaataataaactgatgacatctcaacaaaaactgttactt6240tattttataatttgataatgaatatatgtctgcatttgtttacttctattctgtaaattg6300ggatttttgtcaatcaaattcattgtacttatgactaggtgaaattatttcttacatcta6360atatgtagacactattcaaattttattaaagttttcacatttttagaaaaatgtgttata6420aaattatgttataatgatgaattctagatttctgattttcactctattataagcctaatg6480ttttagaacaaaagtttgacttgagaattttaggtctgttgctcaagttctcacaagtaa6540aattcctgttgaattggtcttggtcaagtttctttacacatacaaaggcaaggactagtt6600atatctgtttcatttctctttatcttgacctgaaaactatttatatgttttcataggttc6660aatttccaaatgcattgcagttggcaaggatatatggtcctagagttacaagttcttctg6720aagccacagggacacaggggagctacgtctttttcctagcactaatgatactggtacctt6780catttgagctttggaagcattaattttcaaattgaatagcaaaaccattaaaaatcactt6840agaaatcattaaatgtgatattatacataaatatttttgaagtgatatctcctctccact6900ccccatcactttagcaacttagttataaagcaatgactattttactgttagggttcctaa6960ataatccacaattaatggca6980<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2ccatggtagtagaccgctgt20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3atctttgtgggagtacagca20<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列<400>4tgtaaaacgacggccagt18<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5tggcaccgagtcggtgcttt20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6attaaccctcactaaaggga20<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列<400>7aaaaaaagcaccgactcggtgccac25<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列<400>8tatagccatggtagtagaccgctgt25<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列<400>9aaacacagcggtctactaccatggc25<210>10<211>25<212>dna<213>人工序列<400>10tatagatctttgtgggagtacagca25<210>11<211>25<212>dna<213>人工序列<400>11aaactgctgtactcccacaaagatc25<210>12<211>82<212>dna<213>人工序列<400>12gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagt60ggcaccgagtcggtgctttttt82<210>13<211>18<212>dna<213>人工序列<400>13cttatcgttctttccttt18<210>14<211>18<212>dna<213>人工序列<400>14cctatagcctatggtaca18當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12