本發(fā)明涉及一株綠色木霉及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

木霉屬(Trichoderma)真菌作為一種植物真菌病害生防真菌，由于其分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)、成熟期短、生長快、能改良土壤及具有廣譜的抗菌抑菌特性等特點已經(jīng)在農(nóng)林業(yè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。木霉屬中的綠色木霉(Trichoderma viride)由于其良好的生防效果，在促進(jìn)植物生長發(fā)育、抑制病原菌生長等方面已經(jīng)被廣泛研究和應(yīng)用，世界上也已經(jīng)有市場化的木霉菌肥投入使用，但黑龍江省地處寒地地區(qū)，其它地區(qū)木霉很有可能因為低溫條件的限制，在寒地地區(qū)不能充分發(fā)揮其生防作用，所以需要分離鑒定適應(yīng)低溫條件的木霉菌株。

玉米(Zea mays)作為主要的糧食作物，在全國乃至全世界大規(guī)模種植，在我國，玉米種植面積近3800萬公頃，秸稈年產(chǎn)量近2.8億噸。收獲后的玉米秸稈，還田是其最好的利用方式，不僅能夠增加土壤養(yǎng)分，還能夠改善土壤結(jié)構(gòu)，達(dá)到減少使用化肥的目標(biāo)。目前主要是直接將玉米秸稈粉碎至5cm以下小段還田，輔助手段則用于堆漚間接還田。但直接粉碎還田未經(jīng)過高溫發(fā)酵，容易將大量病原菌帶入土壤；而間接堆漚還田雖然經(jīng)過高溫發(fā)酵，保證土壤不被帶入病原微生物，也能起到改良土壤的作用，但除了上述作用外，沒有附加產(chǎn)品產(chǎn)出，附加價值較低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株綠色木霉及其應(yīng)用。

本發(fā)明的一株綠色木霉為綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期是2015年07月15日，保藏編號為CGMCC No.11117。

本發(fā)明的一株綠色木霉的應(yīng)用是指綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006以玉米秸稈、麥麩和硫酸亞鐵為發(fā)酵料生產(chǎn)木霉菌肥上的應(yīng)用。

本發(fā)明在2013年秋季黑龍江省哈爾濱百盛家園旁野地的小薊(Cirsium setosum)根際土壤中分離得到綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006；該菌生長較快，28℃條件下培養(yǎng)48h菌落半徑為27mm，菌絲層較厚，后期產(chǎn)生分生孢子，深綠色，菌落呈同心輪紋。顯微鏡觀察有彎曲或鉤狀瓶梗。經(jīng)形態(tài)鑒定和分子鑒定相結(jié)合鑒定為綠色木霉(Trichoderma viride)，最終命名為綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006。

本發(fā)明的優(yōu)點：

1、本發(fā)明獲得的綠色木霉分離鑒定于黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱市氣候寒冷，條件惡劣，分布在當(dāng)?shù)氐哪久?，較其他地區(qū)木霉，有更好的適應(yīng)低溫的能力，在低溫條件下生防能力更加穩(wěn)定良好，也更適合于地處寒地的農(nóng)業(yè)地區(qū)；

2、玉米秸稈的優(yōu)良特性適合木霉菌肥的制備：與其它原料相比，玉米秸稈主要成分為纖維素、糖分、無機(jī)鹽和水，這些成分本身就是木霉生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)；玉米秸稈較其他原料有更強(qiáng)的透氣性，吸水性、保水性，更適用于培養(yǎng)木霉。玉米秸稈比重較低，粉碎后相對表面積較大，同等質(zhì)量可以得到更大的孢子產(chǎn)量，適于生產(chǎn)木霉菌肥；

3、發(fā)酵料的主料玉米秸稈成本低廉：主要利用難以完全充分處理的農(nóng)業(yè)廢棄物玉米秸稈進(jìn)行菌肥發(fā)酵。玉米作為主要的糧食作物，種植廣袤，種植玉米的地區(qū)均可取材，所以玉米秸稈極為豐富。在收獲玉米的同時就可以收獲秸稈，回收的成本很低廉，粉碎后的秸稈約100-200元/噸。本配方看重玉米秸稈蓬松質(zhì)稀的特點，因此運輸過程中，壓縮后同等質(zhì)量可以運送更大體積的玉米秸稈，成本更加低廉；

4、獲得高附加價值的產(chǎn)品-木霉菌肥：與其它應(yīng)用玉米秸稈的方式相比，制備木霉菌肥具有更高的附加價值，在一個長*寬*高為2m*5m*3m空間內(nèi)，可堆放約2*10*35＝700個托盤，用料61.6kg(46.9kg秸稈，14.7kg麥麩)，一周期12d可生產(chǎn)約9kg木霉干孢子粉(65億個孢子/g)，制備成合適的劑型,最終可獲得毛利潤近14500元；

5、分離木霉后的發(fā)酵料還田更加合理：在施肥時可以直接將已經(jīng)分離了孢子的玉米秸稈直接還田，一方面秸稈中原有的病原菌被木霉抑制殺死，不會向土壤中帶入病原微生物；另一方面還能為土壤帶來大量有益微生物；木霉對秸稈的分解作用使得發(fā)酵料營養(yǎng)更豐富，更好地促進(jìn)秸稈還田。

附圖說明

圖1為試驗1和對照試驗1～4綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006以玉米秸稈、麥麩和硫酸亞鐵為發(fā)酵料生產(chǎn)木霉菌肥的發(fā)酵狀態(tài)；

圖2為試驗1和對照試驗1～4中5種不同發(fā)酵配方的孢子產(chǎn)量。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式的一株綠色木霉為綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期是2015年07月15日，保藏編號為CGMCC No.11117。

本實施方式在2013年秋季黑龍江省哈爾濱百盛家園旁野地的小薊(Cirsium setosum)根際土壤中分離得到綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006；該菌生長較快，28℃條件下48h菌落半徑為27mm，菌絲層較厚，后期產(chǎn)生分生孢子，深綠色，菌落呈同心輪紋。顯微鏡觀察有彎曲或鉤狀瓶梗。經(jīng)形態(tài)鑒定和分子鑒定相結(jié)合鑒定為綠色木霉(Trichoderma viride)，最終命名為綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006。

本實施方式的綠色木霉分離鑒定于黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱市氣候寒冷，條件惡劣，分布在當(dāng)?shù)氐哪久?，較其他地區(qū)木霉，有更好的適應(yīng)低溫的能力，在低溫條件下生防能力更加穩(wěn)定良好，也更適合于地處寒地的農(nóng)業(yè)地區(qū)。

具體實施方式二：本實施方式一株綠色木霉的應(yīng)用是指綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006以玉米秸稈、麥麩和硫酸亞鐵為發(fā)酵料生產(chǎn)木霉菌肥上的應(yīng)用。

本實施方式的有益效果：

1、玉米秸稈的優(yōu)良特性適合木霉菌肥的制備：與其它原料相比，玉米秸稈主要成分為纖維素、糖分、無機(jī)鹽和水，這些成分本身就是木霉生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)；玉米秸稈較其他原料有更強(qiáng)的透氣性，吸水性、保水性，更適用于培養(yǎng)木霉。玉米秸稈比重較低，粉碎后相對表面積較大，同等質(zhì)量可以得到更大的孢子產(chǎn)量，適于生產(chǎn)木霉菌肥；

2、發(fā)酵料的主料玉米秸稈成本低廉：主要利用難以完全充分處理的農(nóng)業(yè)廢棄物玉米秸稈進(jìn)行菌肥發(fā)酵。玉米作為主要的糧食作物，種植廣袤，種植玉米的地區(qū)均可取材，所以玉米秸稈極為豐富。在收獲玉米的同時就可以收獲秸稈，回收的成本很低廉，粉碎后的秸稈約100-200元/噸。本配方看重玉米秸稈蓬松質(zhì)稀的特點，因此運輸過程中，壓縮后同等質(zhì)量可以運送更大體積的玉米秸稈，成本更加低廉；

3、獲得高附加價值的產(chǎn)品-木霉菌肥：與其它應(yīng)用玉米秸稈的方式相比，制備木霉菌肥具有更高的附加價值，在一個長*寬*高為2m*5m*3m空間內(nèi)，可堆放約2*10*35＝700個托盤，用料61.6kg(46.9kg秸稈，14.7kg麥麩)，一周期12d可生產(chǎn)約9kg木霉干孢子粉(65億個孢子/g)，制備成合適的劑型,最終可獲得毛利潤近14500元；

4、分離木霉后的發(fā)酵料還田更加合理：在施肥時可以直接將已經(jīng)分離了孢子的玉米秸稈直接還田，一方面秸稈中原有的病原菌被木霉抑制殺死，不會向土壤中帶入病原微生物；另一方面還能為土壤帶來大量有益微生物；木霉對秸稈的分解作用使得發(fā)酵料營養(yǎng)更豐富，更好地促進(jìn)秸稈還田。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式二不同的是：發(fā)酵料的配方為：按質(zhì)量份數(shù)將76份粉碎后的玉米秸稈和24份麥麩混合，得到混合物A，然后加入硫酸亞鐵和水，其中硫酸亞鐵和水的添加量為每一千克混合物A中添加0.3g硫酸亞鐵和3L的水。其他與具體實施方式二相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式二或三不同的是：所述的粉碎后的玉米秸稈是指粉碎至每段＜5cm。其他與具體實施方式二或三相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式二至四之一不同的是：每88g發(fā)酵料中接種30mL綠色木霉分生孢子懸浮液；其中綠色木霉分生孢子懸浮液的濃度為3×10⁶個孢子/mL。其他與具體實施方式二至四之一相同。

具體實施方式六：本實施方式綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006的分離鑒定方法為：

(1)木霉菌的分離：稱取土樣10g于100mL無菌水中溶解，搖勻，作為原液，把原液再依次稀釋成10^-1，10^-2，10^-3，10^-4倍。用移液器分別吸取不同稀釋倍數(shù)的土壤懸浮液0.15mL，用無菌涂布器分別均勻涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，1-2d后挑木霉單菌落轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上，5d后對其進(jìn)行進(jìn)一步純化培養(yǎng)；

(2)分離基質(zhì)：分離于黑龍江省哈爾濱百盛家園旁野地的小薊(Cirsium setosum)根際土壤；

(3)分離時間：2013年秋季；

(4)鑒定：

a、形態(tài)鑒定：生長較快，28℃條件下48h菌落半徑為27mm，菌絲層較厚，后期產(chǎn)生分生孢子，深綠色，菌落呈同心輪紋。顯微鏡觀察有彎曲或鉤狀瓶梗。

b、ITS分子鑒定：將純化后的木霉菌接種到PD液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm，搖瓶培養(yǎng)48h，無菌紗布過濾收集菌絲體。提取木霉菌絲體DNA。通過PCR、膠回收純化及測序后獲得ITS序列。測序結(jié)果通過木霉分類網(wǎng)站Trichoderma taxonomy(http://www.isth.info/)進(jìn)行TrichoBLAST和TrichOKEY在線比對，經(jīng)形態(tài)鑒定和分子鑒定相結(jié)合最終鑒定為綠色木霉(Trichoderma viride)。

對本實施方式的綠色木霉進(jìn)行功能性驗證：

試驗1、綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006以玉米秸稈、麥麩和硫酸亞鐵為發(fā)酵料生產(chǎn)木霉菌肥的方法為：

一、菌種的準(zhǔn)備：將綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006的分生孢子接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5d，得到培養(yǎng)后的分生孢子；

二、發(fā)酵料的準(zhǔn)備：按質(zhì)量份數(shù)將76份粉碎后的玉米秸稈和24份麥麩混合，得到混合物A,然后加入硫酸亞鐵和水，攪拌均勻分裝到滅菌袋后，在121℃條件下滅菌2h，得到滅菌后的發(fā)酵料；其中硫酸亞鐵和水的添加量為每一千克混合物A中添加0.3g硫酸亞鐵和3L的水；

三、接種：將培養(yǎng)后的分生孢子刮至滅菌水中，得到濃度為3×10⁶個孢子/mL的分生孢子懸浮液；將滅菌后的發(fā)酵料倒入托盤中平鋪，然后接種分生孢子懸浮液，蓋上保鮮膜，在28℃、濕度為50％的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；

四、培養(yǎng)：在步驟三的條件下培養(yǎng)4～5d后，在保鮮膜上打孔，然后加入滅菌水，繼續(xù)培養(yǎng)9d，再將托盤中的發(fā)酵料翻轉(zhuǎn)，培養(yǎng)2～3d，然后干燥，即完成。

對照試驗1、對照試驗1的方法為：

一、菌種的準(zhǔn)備：將綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006的分生孢子接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5d，得到培養(yǎng)后的分生孢子；

二、發(fā)酵料的準(zhǔn)備：按質(zhì)量份數(shù)將83份粉碎后的玉米秸稈和17份麥麩混合，得到混合物A，然后加入硫酸亞鐵和水，攪拌均勻分裝到滅菌袋后，在121℃條件下滅菌2h，得到滅菌后的發(fā)酵料；其中硫酸亞鐵和水的添加量為每一千克混合物A中添加0.4g硫酸亞鐵和3L的水；

三、接種：將培養(yǎng)后的分生孢子刮至滅菌水中，得到濃度為3×10⁶個孢子/mL的分生孢子懸浮液；將滅菌后的發(fā)酵料倒入托盤中平鋪，然后接種分生孢子懸浮液，蓋上保鮮膜，在28℃、濕度為50％的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；

四、培養(yǎng)：在步驟三的條件下培養(yǎng)4～5d后，在保鮮膜上打孔，然后加入滅菌水，繼續(xù)培養(yǎng)9d，再將托盤中的發(fā)酵料翻轉(zhuǎn)，培養(yǎng)2～3d，然后干燥，即完成。

對照試驗2、對照試驗2的方法為：

一、菌種的準(zhǔn)備：將綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006的分生孢子接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5d，得到培養(yǎng)后的分生孢子；

二、發(fā)酵料的準(zhǔn)備：按質(zhì)量份數(shù)將59份粉碎后的玉米秸稈和41份麥麩混合，得到混合物A,然后加入硫酸亞鐵和水，攪拌均勻分裝到滅菌袋后，在121℃條件下滅菌2h，得到滅菌后的發(fā)酵料；其中硫酸亞鐵和水的添加量為每一千克混合物A中添加0.3g硫酸亞鐵和3L的水；

三、接種：將培養(yǎng)后的分生孢子刮至滅菌水中，得到濃度為3×10⁶個孢子/mL的分生孢子懸浮液；將滅菌后的發(fā)酵料倒入托盤中平鋪，然后接種分生孢子懸浮液，蓋上保鮮膜，在28℃、濕度為50％的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；

四、培養(yǎng)：在步驟三的條件下培養(yǎng)4～5d后，在保鮮膜上打孔，然后加入滅菌水，繼續(xù)培養(yǎng)9d，再將托盤中的發(fā)酵料翻轉(zhuǎn)，培養(yǎng)2～3d，然后干燥，即完成。

對照試驗3、對照試驗3的方法為：

一、菌種的準(zhǔn)備：將綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006的分生孢子接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5d，得到培養(yǎng)后的分生孢子；

二、發(fā)酵料的準(zhǔn)備：按質(zhì)量份數(shù)將50份粉碎后的玉米秸稈和50份麥麩混合，得到混合物A，然后加入硫酸亞鐵和水，攪拌均勻分裝到滅菌袋后，在121℃條件下滅菌2h，得到滅菌后的發(fā)酵料；其中硫酸亞鐵和水的添加量為每一千克混合物A中添加0.3g硫酸亞鐵和3L的水；

三、接種：將培養(yǎng)后的分生孢子刮至滅菌水中，得到濃度為3×10⁶個孢子/mL的分生孢子懸浮液；將滅菌后的發(fā)酵料倒入托盤中平鋪，然后接種分生孢子懸浮液，蓋上保鮮膜，在28℃、濕度為50％的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；

四、培養(yǎng)：在步驟三的條件下培養(yǎng)4～5d后，在保鮮膜上打孔，然后加入滅菌水，繼續(xù)培養(yǎng)9d，再將托盤中的發(fā)酵料翻轉(zhuǎn)，培養(yǎng)2～3d，然后干燥，即完成。

對照試驗4、對照試驗4的方法為：

一、菌種的準(zhǔn)備：將綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006的分生孢子接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5d，得到培養(yǎng)后的分生孢子；

二、發(fā)酵料的準(zhǔn)備：按質(zhì)量份數(shù)將42份粉碎后的玉米秸稈和58份麥麩混合，得到混合物A,然后加入硫酸亞鐵和水，攪拌均勻分裝到滅菌袋后，在121℃條件下滅菌2h，得到滅菌后的發(fā)酵料；其中硫酸亞鐵和水的添加量為每一千克混合物A中添加0.3g硫酸亞鐵和3L的水；

三、接種：將培養(yǎng)后的分生孢子刮至滅菌水中，得到濃度為3×10⁶個孢子/mL的分生孢子懸浮液；將滅菌后的發(fā)酵料倒入托盤中平鋪，然后接種分生孢子懸浮液，蓋上保鮮膜，在28℃、濕度為50％的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；

四、培養(yǎng)：在步驟三的條件下培養(yǎng)4～5d后，在保鮮膜上打孔，然后加入滅菌水，繼續(xù)培養(yǎng)9d，再將托盤中的發(fā)酵料翻轉(zhuǎn)，培養(yǎng)2～3d，然后干燥，即完成。

試驗1和對照試驗1～4中所述的PDA斜面培養(yǎng)基的配方為：200g馬鈴薯加水1000ml煮沸20min，過濾后棄廢渣，向濾液中加入20g/L葡萄糖，15g/L瓊脂，攪拌均勻后分裝滅菌；步驟三所述的分生孢子懸浮液的接種量為每88g滅菌后的發(fā)酵料中接種30mL；步驟四打孔的數(shù)量為12個/0.1m²，孔徑為1mm；步驟三滅菌后的發(fā)酵料與步驟四的滅菌水的質(zhì)量體積比為88g:100mL。

試驗1和對照試驗1～4中所用托盤規(guī)格：長*寬*高：40cm*28cm*6cm。

記錄試驗1和對照試驗1～4綠色木霉(Trichoderma viride)NECC30006以玉米秸稈、麥麩和硫酸亞鐵為發(fā)酵料生產(chǎn)木霉菌肥的發(fā)酵狀態(tài)，結(jié)果如圖1所示，其中1號為對照試驗1、2號為試驗1、3號為對照試驗2、4號為對照試驗3、5號為對照試驗4；由圖1可知，孢子單位產(chǎn)量2號最高。經(jīng)過血球計數(shù)板對發(fā)酵好的木霉菌肥進(jìn)行測量，測量結(jié)果如圖2所示，由圖2可知，2號配方產(chǎn)孢量最大，約9.5億個/g發(fā)酵料。

與其它應(yīng)用玉米秸稈的方式相比，試驗1制備的木霉菌肥具有更高的附加價值，在一個長*寬*高為2m*5m*3m空間內(nèi)，可堆放約2*10*35＝700個托盤，用料61.6kg(46.9kg秸稈，14.7kg麥麩)，一周期12d可生產(chǎn)約9kg木霉干孢子粉(65億個孢子/g)，制備成合適的劑型,最終可獲得毛利潤近14500元。采用試驗1的方法分離木霉后的發(fā)酵料還田更加合理，在施肥時可以直接將已經(jīng)分離了孢子的玉米秸稈直接還田，一方面秸稈中原有的病原菌被木霉抑制殺死，不會向土壤中帶入病原微生物；另一方面還能為土壤帶來大量有益微生物；木霉對秸稈的分解作用使得發(fā)酵料營養(yǎng)更豐富，更好地促進(jìn)秸稈還田。