本發(fā)明屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種新型葡聚糖蔗糖酶及其在催化制備水溶性葡聚糖中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：葡聚糖(glucan)是一種以葡萄糖為單體的聚合物，在醫(yī)藥、精細(xì)化工、石油開(kāi)采、食品、化妝品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，其中根據(jù)糖苷鍵的類型可分為α,葡聚糖和β-葡聚糖。α-葡聚糖中研究使用較多的為右旋糖酐(dextran)，右旋糖酐具有較高的分子量，主要由d-葡糖吡喃糖以α,1-6鍵連接，支鏈點(diǎn)有α,1-2、1-3、1-4糖苷鍵連接形成的。隨著微生物種類和生長(zhǎng)條件的不同，其結(jié)構(gòu)也有差別。由于結(jié)構(gòu)的不同，葡聚糖可分為水不溶性葡聚糖和水溶性葡聚糖。水溶性葡聚糖在保健品、化妝品、動(dòng)物養(yǎng)殖、醫(yī)藥等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用。葡聚糖蔗糖酶(glucansucrase，亦稱蔗糖-6-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶)(ec.2.4.15)是一種糖苷轉(zhuǎn)移酶，屬于糖苷水解酶第70家族。腸膜明串珠菌分泌的葡聚糖蔗糖酶屬于誘導(dǎo)型酶，誘導(dǎo)物和底物都為蔗糖，且在一定范圍內(nèi)，酶的產(chǎn)量與蔗糖濃度成正比。葡聚糖的生產(chǎn)方法有兩種：微生物直接發(fā)酵法和酶合成法。直接發(fā)酵生產(chǎn)葡聚糖時(shí)，發(fā)酵液成分復(fù)雜，導(dǎo)致產(chǎn)物分離困難、葡聚糖分子大小難以控制、細(xì)胞核蛋白類雜質(zhì)多等缺點(diǎn)，而利用純酶催化制備葡聚糖，可以克服這些不足，生產(chǎn)出高產(chǎn)品質(zhì)量的葡聚糖。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種新型葡聚糖蔗糖酶，以解決現(xiàn)有技術(shù)中直接發(fā)酵生產(chǎn)葡聚糖時(shí)，發(fā)酵液成分復(fù)雜，導(dǎo)致產(chǎn)物分離困難的問(wèn)題。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供編碼上述葡聚糖蔗糖酶的基因序列。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供包含上述葡聚糖蔗糖酶基因的重組質(zhì)粒、重組細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一株表達(dá)葡聚糖蔗糖酶基因的基因工程菌。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述表達(dá)葡聚糖蔗糖酶基因的基因工程菌在產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶中的應(yīng)用。本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供葡聚糖蔗糖酶在催化制備葡聚糖中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種葡聚糖蔗糖酶，其氨基酸序列如seqidno.1所示。一種編碼葡聚糖蔗糖酶的基因序列，其核苷酸序列如seqidno.2所示。包含seqidno.2所示核苷酸序列的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。一種表達(dá)葡聚糖蔗糖酶的基因工程菌，該菌株中包含seqidno.2所示核苷酸序列。上述表達(dá)葡聚糖蔗糖酶的基因工程菌，該菌株的構(gòu)建方法如下：(1)將seqidno.2所示核苷酸序列導(dǎo)入表達(dá)質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒；(2)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，得到表達(dá)葡聚糖蔗糖酶的基因工程菌。步驟(1)中，所述表達(dá)質(zhì)粒為pet28a。步驟(2)中，所述宿主菌為e.colibl21(de3)。上述葡聚糖蔗糖酶在制備葡聚糖中的應(yīng)用在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。具體的方法是：以蔗糖為底物，葡聚糖蔗糖酶為催化劑，得到水溶性葡聚糖。其中，催化反應(yīng)的ph為5.0～7.0，反應(yīng)時(shí)間6～8小時(shí)，葡聚糖蔗糖酶添加量6～10u，蔗糖濃度為50～200g/l有益效果：本發(fā)明提供了一種以來(lái)至于腸膜明串珠菌leuconostocmesenteroidesg123的葡聚糖蔗糖酶合成水溶性葡聚糖的方法。本發(fā)明涉及到的葡聚糖蔗糖酶命名為dsrs。該酶在特定的催化條件下可高效催化制備水溶性葡聚糖，同時(shí)葡聚糖得率高達(dá)90％以上。本發(fā)明提供的新型葡聚糖蔗糖酶應(yīng)用前景廣闊，和以其制備的水溶性葡聚糖的可被引用于保健品、化妝品、動(dòng)物養(yǎng)殖、醫(yī)藥等領(lǐng)域。附圖說(shuō)明圖1e.colibl21(de3)-pet28a-dsrs重組菌株鑒定，(第一泳道為dnamarker，第二泳道為重組菌菌落pcr產(chǎn)物)具體實(shí)施方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1：產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶重組大腸桿菌的構(gòu)建步驟1：將腸膜明串株菌leuconostocmesenteroidesg123進(jìn)行試管培養(yǎng)活化，試管裝液量為5ml，接種量為1％，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為10-12h，得到菌株生長(zhǎng)旺盛的菌液，10000rpm離心獲取菌泥，利用革蘭氏陽(yáng)性菌的提基因組試劑盒提取腸膜明串株菌leuconostocmesenteroidesg123的基因組作為pcr模板。步驟2：產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶基因dsrs的獲取上游引物：5’-cgcggatccgaattcatgttagtaacagctggtattttttc-3’下游引物：5’-acggagctcgaattcttatatagtatttaaacgctgtctctctc-3’以leuconostocmesenteroidesg123的基因組dna為模板，以上述引入pcr擴(kuò)增dsrs因片段，反應(yīng)條件為：94℃，5min；(94℃45s，50℃45s，72℃300s，35個(gè)循環(huán))，72℃，10min，擴(kuò)增出dsrs基因，將pcr反應(yīng)液進(jìn)行純化回收，備用。步驟3：將步驟2中構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入e.colibl21(de3)中。具體方法如下：將裝有200μl制作好的e.coli感受態(tài)細(xì)胞冰盒上解凍5-10min；加入20μl冷卻的一步克隆反應(yīng)液：手指輕彈，混勻，冰上放置30min；42℃，水浴90s，冰浴2min；加入900μl新鮮lb培養(yǎng)基，復(fù)蘇細(xì)胞，37℃，200rpm，培養(yǎng)1h。取100μl涂布在抗性平板上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-12h，挑取菌落，使用步驟2中的引物進(jìn)行pcr驗(yàn)證，能擴(kuò)增出目的基因片段的菌落即為pet28a-dsrs質(zhì)粒成功表達(dá)的菌株。如圖1所示，dsrspcr產(chǎn)物大小約為4500bp與預(yù)期一致，說(shuō)明構(gòu)建菌株正確。實(shí)施例2：構(gòu)建菌株發(fā)酵制備葡聚糖制糖酶dsrs種子培養(yǎng)基(g/l)：酵母粉5，蛋白胨10，nacl10，ph7.0，121℃滅菌15min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：酵母粉24，蛋白胨12，kh2po42,.31，k2hpo416.43，葡萄糖10，121℃滅菌15min。生產(chǎn)方法：取平板上單菌落接種于裝液量為5ml的試管中，30℃、200rpm培養(yǎng)12h。制備一級(jí)種子液，將一級(jí)種子液接種于裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)液的500ml三角瓶中，200rpm，30℃培養(yǎng)0～4h后加入0.1～1.0mmiptg誘導(dǎo)dsrs目的蛋白的表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)至24h，停止發(fā)酵后，將培養(yǎng)液于10000r/min離心10min，棄上清，用ph為6.2的磷酸緩沖液混懸沉淀，凍融后獲得粗酶液。如表1所示，不同iptg誘導(dǎo)條件下，dsrs最高酶活可達(dá)7.6u(粗酶液)。對(duì)粗酶液進(jìn)行分離純化，然后進(jìn)行酶活測(cè)定，dsrs最高酶活可達(dá)30u。表1不同iptg濃度誘導(dǎo)重組菌株對(duì)dsrs酶活的影響iptg濃度dsrs酶活(粗酶液)dsrs酶活(純化后)0.1mm0.8u/g-dcw3.4u/g-dcw0.3mm2.7u/g-dcw11.3u/g-dcw0.5mm4.9u/g-dcw20.6u/g-dcw0.7mm4.1u/g-dcw15.8u/g-dcw1.0mm1.2u/g-dcw5.1u/g-dcw酶的分離純化：步驟一：粗酶液中加入硫酸銨至80％飽和度，4℃靜置過(guò)夜。10000r/min離心15min，將沉淀溶解于ph8.0的50mmol/ltris-hcl緩沖液，hitrapdesalting脫鹽柱脫鹽。步驟二：離子交換層析:將脫鹽后的酶液加到用50mmol/lph8.0的tris-hcl充分平衡的deae陰離子交換柱上(deae柱料為ge公司產(chǎn)品)，然后用tris-hcl緩沖液平衡，之后用0－1.0mol/lnacl(50mmol/ltris-hclph8.0)進(jìn)行梯度洗脫，流速為2ml/min，合并含有甘露聚糖酶活力的組分。步驟三：凝膠過(guò)濾:將上述所得活力組分用超濾離心管濃縮至500μl。然后將樣品加到50mmol/lph8.0的tris-hcl預(yù)平衡的superdex20010/300gl柱(ge公司產(chǎn)品)進(jìn)行分子篩層析，用相同的緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min。酶活測(cè)定方法：步驟一：葡聚糖蔗糖酶的活力表示為在ph5.4，30℃的條件下，1min中內(nèi)反應(yīng)生成1μmol果糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位u。酶活反應(yīng)體系：30℃，20mm乙酸鈉緩沖液(ph5.4)，0.05g/lcacl2,1g/lnano3，100g/l蔗糖。具體方法為(1)取7支比色管編號(hào)0-7，分別加入濃度為1mg/ml的果糖標(biāo)準(zhǔn)液0ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，1.2ml，補(bǔ)足蒸餾水至2.0ml，加入1.5mldns試劑，配成不同果糖濃度的反應(yīng)液，將比色管搖勻后在沸水浴中加熱5min，取出，冷卻至室溫，蒸餾水定容至20ml，顛倒混勻，用0號(hào)管調(diào)零，540nm下測(cè)定吸光值，以吸光值為橫坐標(biāo)，果糖含量(μmol)為縱坐標(biāo)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)取500μl待測(cè)酶液與2.5ml反應(yīng)體系混合，混勻后放入30℃水浴中反應(yīng)20min，采用dns測(cè)定反應(yīng)體系中0min和20min的還原糖(即為葡聚糖蔗糖酶催化反應(yīng)生成的果糖)含量。(3)取葡聚糖蔗糖酶反應(yīng)體系的樣品500μl，加蒸餾水至2.0ml，加入1.5mldns，沸水浴5min，取出冷卻至室溫，蒸餾水定容至20ml，顛倒混勻，測(cè)定540nm下測(cè)定吸光值，對(duì)照標(biāo)曲計(jì)算得到相應(yīng)還原糖的含量(μmol)。(4)葡聚糖蔗糖酶活力(u,μmol/min)＝(20min反應(yīng)體系中還原糖總量-0min反應(yīng)體系中還原糖總量)/(20min*反應(yīng)體系中加入的酶液體積)。實(shí)施例3：葡聚糖蔗糖酶催化蔗糖生產(chǎn)可溶性葡聚糖步驟一：采用不同濃度的蔗糖制備葡聚糖，使反應(yīng)體系中蔗糖終濃度分別為50g/l，100g/l，150g/l，200g/l，30℃，反應(yīng)時(shí)間為6～12h，優(yōu)選8h；在反應(yīng)體系中加入磷酸緩沖液，控制反應(yīng)體系ph為5.0～7.0，優(yōu)選6.0；反應(yīng)溫度為30℃～40℃，優(yōu)選30℃；酶添加量為1～10u，優(yōu)選10u。表2利用蔗糖催化在優(yōu)選條件下制備葡聚糖蔗糖濃度葡聚糖產(chǎn)量葡聚糖得率*50g/l23.7g/l95％100g/l47.5g/l95％150g/l71.9g/l96％200g/l94.2g/l94％*得率按照生產(chǎn)每g葡聚糖消耗的蔗糖中的葡萄糖量計(jì)算得出。該新型酶具有高葡聚糖催化得率的特性，在50～200g/l蔗糖條件下，葡聚糖得率均大于90％。步驟二：向步驟2的反應(yīng)液中加入冷乙醇，加入冷乙醇的體積為反應(yīng)液的2～3倍，冰上靜置30～60min，9000rpm離心10～20min得沉淀物，棄上清，50～55℃下干燥至恒重(w1)得葡聚糖。步驟三：將所得的葡聚糖，加水于40℃溶解12h，將溶解液9000rpm離心10min后發(fā)現(xiàn)無(wú)沉淀物，收集上清，加入2～3倍體積的冷乙醇，冰上靜置30～60min，9000rpm離心10～20min，取沉淀物，50～55℃下干燥至恒重(w2)，經(jīng)比較，w2和步驟二中的w1值基本一致。由此可得，步驟三中所產(chǎn)生的葡聚糖為水溶性葡聚糖。對(duì)干燥后的葡聚糖進(jìn)行分子量測(cè)定，得到其分子量為3000。sequencelisting<110>南京工業(yè)大學(xué)<120>一種新型葡聚糖蔗糖酶及其在催化制備水溶性葡聚糖中的應(yīng)用<130>sg20170425<160>4<170>patentinversion3.<210>1<211>1505<212>prt<213>葡聚糖蔗糖酶氨基酸序列<400>1metleuvalthralaglyilepheseralavalilepheglyvalser151015ilealaasnvalseralaaspserileasnasnthrserilealaval202530alaglnserlysasnilealavalalathrthrthralathrmetasp354045lysvalthraspthrthralathrthrasplysvalthraspthrthr505560alathrthrasplysvalthraspthrthralathrthrasplysval65707580thraspthrthralathrthrasplysvalthraspthralaalathr859095thrasplysvalalaaspthrthralathrthrasplysvalthrasp100105110thrthralathrthrglylysvalthraspthrthralathrthrasp115120125lysvalalaaspthrthralathrthrasplysvalalaaspthrthr130135140alathrthrasplysvalthraspthralaalathrthrasplysala145150155160thraspthralaalathrthrasplysvalalaaspthrthralathr165170175thrasplysalaalaasnthrthrvalthrproserglulysserlys180185190serilelysglnileaspglylysthrtyrpheileglyaspaspgly195200205glnprolyslysasnphethralailevalaspglyglnvalleutyr210215220pheasplysaspthrglythrleuthrserasnserserglntyrthr225230235240aspglyleuvalasnileglyasngluhisasnalaalatyrserleu245250255serseraspserphethrglnvalaspglytyrleuthralaasnser260265270trptyrargprolysaspileleulysasnglythrthrtrpthrala275280285serthralaasnasppheargproleuleumetsertrptrpproasp290295300lysaspthrglnvalsertyrleulystyrmetglnservalglyleu305310315320leuseraspaspvalvalleuserasnlysaspsermetasnserleu325330335thralametalaleuthrvalglnlysasnilegluglulysilegly340345350leuleuglythrthrasptrpleulysthraspmetaspglnmetval355360365aspserglnserasntrpasnilesersergluserlysglythrasp370375380hisleuglnglyglyalaleuleutyrvalasnseraspleuthrpro385390395400asnalaasnserasptyrargleuleuasnargthrprothrasngln405410415lysglyglnilethrthraspglyasnglnglyglytyrglumetleu420425430leualaasnaspvalaspasnserasnproilevalglnalaglugln435440445leuasntrpleutyrtyrmetmetasnileglyserilevalglnasn450455460aspprothralaasnpheaspglytyrargvalaspalavalaspasn465470475480valasnalaaspleuleuglnilealaglyasptyrphelysalaala485490495tyrglythrasplysseraspalaasnalaasnasnhisileserile500505510leugluasptrpaspasnasnaspproalatyrvallysserglngly515520525asnasnglnserthrmetaspphepromethisleualaleulystyr530535540serleuasnmetproserseralaargserglyleugluproaspile545550555560valthrserleuvalasnargsergluaspserthrgluasngluala565570575glnproasntyrserpheileargalahisaspsergluvalglnthr580585590valilealaglnileilelysasplysileasnproserseraspasp595600605glyleuthrvalserthraspgluilealalysalaphegluiletyr610615620asnalaaspgluleulysalaasplysglutyrthralatyrasnile625630635640prosersertyralaleumetleuthrasnlysaspthrileproarg645650655valtyrtyrglyaspleuphethraspaspglyglntyrmetserala660665670lysserprotyrtyraspalaleuthrserleuleuglnserargval675680685lystyrvalserglyglyglnsermetasnmetalatyrleuhisasn690695700asnglnglyleuleuthrservalargtyrglylysglyalametthr705710715720alathraspthrglythrsergluthrargthrglnglyileglyleu725730735ilevalserasnlysthraspleuasnleuasnasnaspgluglnile740745750valleuasnmetglyalavalhislysasnglnalatyrargalaleu755760765metleuserthrlysaspglyleulysiletyrasnseraspaspasp770775780alaproleualatyrthraspaspglnglyargleuthrphelysser785790795800aspmetvalpheglyvalseraspalaglnvalserglytyrleuala805810815alatrpvalprovalglyalathraspaspglnaspalaargasngln820825830serserthrilealaserthraspglyasnthrtyrhisserasnala835840845alaleuaspserglnvaliletyrgluglypheserasnpheglnala850855860metprothrglnthrasnglutyrthrasnvallysilealaglnasn865870875880alaglnleuphelysasnleuglyilethrserphegluleualapro885890895glntyrargserserthraspasnserpheleuaspalavalvalgln900905910asnglytyralaphethraspargtyraspileglytyrasnthrpro915920925thrlystyrglythrvalaspglnleuleuaspalaleuargalaleu930935940hisalaglnaspileglnalaileasnasptrpvalproaspglnile945950955960tyrasnleuproserglugluilevalthralaserargthrasngly965970975serglylysileasngluthrservalileasnasnthrleutyrasp980985990serhisthrvalglyglyglyglutyrglnalaphetyrglyglyala99510001005pheleuasplysleulysglnasppheprogluleuphegluthr101010151020lysglnileserthrglyglualametasnproaspvallysile102510301035thrglutrpseralalystyrpheasnglyserasnileglngly104010451050argglyalatrptyrvalleulysasptrpalathrasnglntyr105510601065pheasnvalserserglyserlyspheleuprolysglnleuleu107010751080glyglulysthrserthrglyphethrasnvalaspasnglylys108510901095thrgluphetyrserthrserglytyrglnalalysasnthrphe110011051110ileglnaspasnaspasntrptyrtyrpheaspasnaspglytyr111511201125metvalvalglyglyglngluileasnglylyslystyrtyrphe113011351140leuproasnglyvalgluleuglnaspalatyrleuseraspgly114511501155thrasnvaltyrtyrtyrserserthrglyargglnilethrasn116011651170glntyrtyrargaspseraspserlystrphistyrphepheser117511801185aspglyhismetalavalglyleuthrthrilethralaaspasn119011951200glythralaasnglnglntyrpheaspvalasnglyileglnleu120512101215lysglyvalalavallysaspthraspglyasnvalargtyrphe122012251230aspglyasnthrglyasnleuvalvalserasntrpglylysthr123512401245alaaspglysertrpleutyrleuasnasplysglyilealaval125012551260thrglyglnglnasnileasnglyglnasnvaltyrpheasnglu126512701275aspglyvalglnvallysglyglualailethraspthrasngly128012851290asnvalhistyrtyraspargserthrglyasnmetvalthrasn129513001305sertrpalagluleuproaspsersertrpmettyrleuaspval131013151320asnglyvalalaalaileglyalaglnlysileasnglyleuglu132513301335phetyrpheaspasnasnglylysglnvallysasnasplysval134013451350ileasnaspaspglythrileasntyrtyrthrglymetsergly135513601365glulysleulysasnasppheglygluleuproaspglysertrp137013751380mettyrleuaspasnglnglyasnalavalileglyasplyslys138513901395ileasnglyglnasnleutyrphelysileaspglyglnglnval140014051410lysglygluthrtyrileaspglyvalglylysmetargphetyr141514201425glnalaalaserglyglumetvalthrasnglnphegluglnval143014351440alaaspglylystrpalatyrpheglyalaaspglyvalalaval144514501455thrglygluglntyrileaspglyglnaspleuphepheasppro146014651470thrglytyrglnvallysglyasplysargthrileaspserval147514801485leutyrserpheasplysaspserglygluargglnargleuasn149014951500thrile1505<210>2<211>4518<212>dna<213>葡聚糖蔗糖酶基因序列<400>2atgttagtaacagctggtattttttctgctgtgatatttggcgtttccatagctaacgta60agcgctgatagtattaacaatactagtattgcggtggcgcaatcaaaaaatatagcagtg120gccacaacgacagctacaatggacaaagtaactgatacgacagctacaacggacaaagta180actgatacgacagctacgacagataaagtaactgatacgacagctacaacggacaaagta240actgatacgacagctacgacagataaagtaactgacacggcagctacgacggacaaagtg300gctgacacgacagctacaacggacaaagtaactgatacgacagctacaacgggcaaagta360actgacacgacagctacgacggacaaagtggctgacacgacagctacgacagataaagtg420gctgacacgacagctacaacggacaaagtaactgacacggcagctacaacggataaagca480actgacacggcagctacaacggacaaagtagctgatacaacagctacgacagataaagca540gcgaacacaacagttacaccttcagaaaaatcaaaaagtattaagcaaatcgatggtaaa600acatatttcattggtgatgatggtcagcccaagaaaaattttacagccattgtggacggt660caagtattatatttcgacaaagataccggtactttgacatcaaatagtagtcaatatacc720gatggtttggtcaatataggaaatgagcataatgcggcttattcattgtcttcggacagt780tttacacaagttgatggctatctaacggctaacagttggtatcgacctaaagatatattg840aaaaatggtacaacatggacagcttcaacagcaaatgattttcgaccattgttgatgtct900tggtggccggataaagatacccaagtttcatacttaaaatatatgcaatctgttggatta960ttatcagatgacgttgtactatcaaacaaggatagtatgaatagtttgacagctatggca1020ctgactgttcaaaaaaatattgaagagaaaataggcctattaggtaccactgactggctt1080aagactgatatggaccaaatggttgactcacaatcaaattggaacattagtagtgagtct1140aaaggaacagatcatttgcaaggtggtgcgctcctatatgtgaatagtgatttgacacca1200aatgctaattctgattatcgtttattaaatcgaacgccaacgaaccaaaaaggtcaaatt1260acaacagacggtaatcaaggtggctatgagatgctgttggccaacgatgttgataattct1320aaccctattgttcaagctgaacaattgaattggttgtactacatgatgaatatcggtagt1380atcgtccaaaatgatccaacggcaaattttgatggttacagagttgatgctgttgacaac1440gtgaatgctgatttgttgcaaattgctggcgattactttaaggcagcgtatggaacggat1500aaaagtgatgctaatgcaaacaatcacatttctatcttagaagactgggataataatgat1560ccggcgtatgtaaaatcacagggaaataaccaatcaaccatggattttccaatgcatttg1620gcgttaaagtattcattaaatatgccaagtagtgctcgtagcgggttggaaccagatatt1680gtaacaagtctagtaaatcgctcagaagattcaacagaaaatgaagcacaaccgaactat1740tcatttattcgggcacatgatagtgaagtacaaaccgttattgcgcaaattattaaagat1800aaaattaatcctagttctgatgatggattgactgtttcaacggatgaaattgccaaagca1860ttcgaaatatataatgccgacgaattaaaagctgataaagagtacactgcatataatata1920ccctcatcatatgcattgatgttaactaacaaagatacaattcctcgtgtgtattatggt1980gatttgtttacggatgatggacaatatatgtctgctaagtcaccatattatgatgcactt2040acctcattgcttcagtcgcgagtaaaatatgtttcaggtggtcaatcaatgaatatggct2100tacctgcataataatcaaggccttttgacatctgtccgctatgggaaaggtgccatgaca2160gctactgatactggtaccagtgaaactcgtacacaaggtattgggttaattgtcagtaac2220aaaactgatttaaatctgaataatgatgagcaaattgtgcttaacatgggcgctgtacac2280aaaaatcaagcttaccgtgcattaatgttaagtactaaagatggattgaaaatttataat2340agtgatgacgatgcaccgctggcatatacagatgaccagggtcgtttgacttttaaatct2400gacatggtttttggtgtgagtgatgctcaggtttctggttatttagcagcttgggtgcca2460gttggcgcaacagatgatcaagatgctaggaatcaaagcagtacgatagcttcaacagat2520ggtaatacctatcattcaaacgctgctttggattctcaggttatttatgaaggtttttca2580aactttcaagcgatgccaactcagactaatgaatataccaatgttaaaattgctcaaaat2640gcgcaactattcaaaaatctcggtataactagttttgaattagcacctcaatatcggtca2700agcactgataatagtttcttagatgcagttgttcaaaatggttatgccttcacggatcga2760tacgacattggttataatacgcctacaaaatacggtacagttgatcaactattagacgct2820ttaagagcattacatgctcaagacattcaggctatcaatgattgggtcccagaccaaatt2880tataatttgcctagcgaagaaatcgtgactgctagtcgaacaaatgggtcaggaaagata2940aacgaaacttcggttattaacaatacgttatatgattctcatactgtcggtggcggagag3000tatcaggcattttatggtggtgctttcttagataagttaaaacaagattttcctgagtta3060tttgaaacaaaacaaatttcaaccggtgaagcaatgaaccctgatgtcaaaatcacagaa3120tggtcagctaagtattttaatggctcaaacattcaagggcgtggtgcatggtatgttctc3180aaggattgggcgacaaatcaatactttaatgtttcaagtggtagcaaatttttacctaaa3240caattattaggtgaaaaaacaagcacagggtttaccaacgttgataatggtaagactgag3300ttttactctacaagtggttaccaagctaagaatacctttattcaagataatgacaattgg3360tattattttgataatgatggttacatggttgttggtggtcaagaaattaatggtaaaaaa3420tattacttcctgccaaatggtgtagagttacaagatgcttatttgtcggatggtactaat3480gtatattattacagtagtacaggtcgtcaaattactaatcaatattatcgagattcagat3540agcaaatggcattacttcttctcagatgggcatatggccgttggtttaacaacaattact3600gcagataacggcacggctaatcaacaatattttgacgttaatggtatacaacttaagggt3660gttgctgttaaagacactgatggaaatgttcgttattttgatggtaacacaggaaacttg3720gttgtcagtaactggggtaaaacggctgatggttcatggttatacctaaatgataaaggg3780atagcagtaacgggacagcaaaatattaatggccaaaatgtctattttaacgaagatggt3840gttcaagtgaagggcgaagccattacggatactaatggcaatgtacattactatgatcgt3900agtactggaaatatggtgactaattcatgggcagagttaccggacagctcgtggatgtat3960ctagatgttaatggcgttgctgctattggtgctcaaaaaattaatggtctggaattttat4020ttcgataataacggtaaacaagttaagaacgacaaagtcattaatgatgatggaacaata4080aactattacacaggtatgagcggtgaaaaactaaaaaatgattttggtgaattgccagac4140ggatcatggatgtacttggataatcaaggtaatgctgtaataggcgacaaaaaaattaat4200ggtcagaatctatacttcaagatagacggacaacaggttaagggtgaaacctatatagat4260ggagttggcaagatgcgtttctatcaagctgccagcggtgaaatggtgacgaatcaattc4320gaacaagttgctgatggcaaatgggcttactttggtgctgatggtgtggctgtcactgga4380gagcaatatattgatggtcaggatcttttctttgacccaactggttatcaagtgaagggt4440gacaaacgcacaattgacagcgttctctatagctttgataaagacagtggagagagacag4500cgtttaaatactatataa4518<210>3<211>41<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物<400>3cgcggatccgaattcatgttagtaacagctggtattttttc41<210>4<211>44<212>dna<213>artificialsequence<220><223>下游引物<400>4acggagctcgaattcttatatagtatttaaacgctgtctctctc44當(dāng)前第1頁(yè)12