一、技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種caco-2和huvec細(xì)胞共培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
二、
背景技術(shù)：
人結(jié)腸癌細(xì)胞(humancolonadenocarcinomacelllines，簡(jiǎn)稱caco-2細(xì)胞)具有與小腸上皮細(xì)胞相同的微絨毛結(jié)構(gòu)和緊密連接，含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的代謝酶系、糖類、氨基酸、p450同工酶及各種主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的載體，是用于研究腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的經(jīng)典模型。
人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells，簡(jiǎn)稱huvec)是從正常人體臍帶分離得到的靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，含有大量的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物、平滑肌肌動(dòng)球蛋白、abg抗原，具有多種生理功能，能產(chǎn)生和分泌許多生物活性物質(zhì)，在維持血管舒縮，抗凝血等方面起重要作用，是循環(huán)系統(tǒng)和內(nèi)皮組織生理、藥理研究中廣泛應(yīng)用的細(xì)胞模型。
生物利用度(bioavailability)廣義說包括消化、吸收、代謝、分布、排泄以及發(fā)揮的生物活性(bioactivity)，而狹義的生物利用度是僅指營養(yǎng)物質(zhì)被機(jī)體吸收進(jìn)入循環(huán)的相對(duì)量和速率，應(yīng)是生物吸收率(bioaccessibility)。通常人們采用caco-2腸道細(xì)胞研究藥物的生物利用，然而這僅僅反映的是腸道的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，忽略了藥物在體內(nèi)代謝后真正達(dá)到的生理作用。生物利用首要的是吸收，但最關(guān)鍵的還是保證其在體內(nèi)發(fā)揮生物活性作用。因此，需要一種既可以反映吸收又可以反映生理活性的細(xì)胞模型來研究生物利用度。
細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)是將兩種或多種的細(xì)胞共同培養(yǎng)于同一環(huán)境中，由于具有更好地反映體內(nèi)環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)，這種方法被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代細(xì)胞研究中。細(xì)胞共培養(yǎng)體系主要通過兩種方式建立：①接觸共培養(yǎng)體系，即將兩種細(xì)胞同時(shí)或分別接種于同一載體上，不同種類的細(xì)胞之間直接接觸；②非接觸共培養(yǎng)體系，即將兩種細(xì)胞分別接種于不同的載體上，然后將這兩種載體置于同一培養(yǎng)環(huán)境之中，使不同種類的細(xì)胞共用同一種培養(yǎng)體系而不直接接觸。細(xì)胞共培養(yǎng)體系模擬細(xì)胞間相互作用，包括分泌生長(zhǎng)因子發(fā)揮作用，可以用于誘導(dǎo)細(xì)胞分化、維持細(xì)胞功能和活力、調(diào)控細(xì)胞增殖、促進(jìn)早期胚胎發(fā)育和提高代謝物產(chǎn)量。huvec/纖維母細(xì)胞共培養(yǎng)體系用于研究花青素對(duì)血管生成的影響，huvec/jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)體系用于研究葡萄籽原花青素對(duì)t細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附特性。尚未見把研究吸收的caco-2細(xì)胞模型與研究藥理功能的huvec細(xì)胞模型結(jié)合起來全面反映藥物生物利用度的體外細(xì)胞模型方面的報(bào)道。
三、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
技術(shù)問題本發(fā)明主要是涉及一種caco-2和huvec細(xì)胞共培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法，該共培養(yǎng)體系可以提供一種反映藥物生物利用度的體外細(xì)胞模型。
技術(shù)方案本發(fā)明包括了以下步驟：
1)將25～40代的caco-2細(xì)胞用dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，ph7.4)于37℃、5％co2環(huán)境培養(yǎng)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期caco-2細(xì)胞接種到transwell板上層，培養(yǎng)至細(xì)胞完全分化，采用電位儀監(jiān)測(cè)caco-2細(xì)胞層的電阻值teer大于550ω·cm2。
2)將2～6代的huvec細(xì)胞用dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、100μg/ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、2％青霉素-鏈霉素雙抗液，ph7.4)于37℃、5％co2環(huán)境培養(yǎng)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期huvec細(xì)胞接種到transwell板下層，至細(xì)胞長(zhǎng)滿80～90％。
3)將分化完全的caco-2細(xì)胞transwell上層小室插入到培養(yǎng)好的huvec細(xì)胞transwell下層小室中，微調(diào)整dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、100μg/ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、2％青霉素-鏈霉素雙抗液，ph7.4)，于37℃、5％co2環(huán)境非接觸共同培養(yǎng)。
有益效果
本發(fā)明旨在構(gòu)建一種caco-2/huvec細(xì)胞共培養(yǎng)體系，用于提供一種反映藥物生物利用度的體外細(xì)胞模型。
傳統(tǒng)的caco-2細(xì)胞模型適用于腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制與代謝研究，僅反映腸道吸收代謝，不考慮體內(nèi)活性。傳統(tǒng)的huvec細(xì)胞模型適用于循環(huán)系統(tǒng)和內(nèi)皮組織生理、藥理研究，僅反映活性機(jī)理，不考慮體內(nèi)消化吸收與代謝。本發(fā)明打破單一研究吸收代謝或生理活性的固有思路，把研究吸收的caco-2模型與研究藥理功能的huvec細(xì)胞結(jié)合起來，采用非接觸式共培養(yǎng)方式搭建caco-2/huvec共培養(yǎng)體系。通過微調(diào)整共培養(yǎng)所用的dmem培養(yǎng)基，既適于caco-2生長(zhǎng)，又適于huvec生長(zhǎng)。共培養(yǎng)體系包含兩種細(xì)胞的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)載體和代謝酶系、與生理活性相關(guān)因子與酶系，此外兩種細(xì)胞可以通過transwell跨膜交換胞外分泌物質(zhì)。caco-2模仿腸道層，huvec模擬循環(huán)系統(tǒng)血管層，適宜用來研究物質(zhì)的腸道與循環(huán)系統(tǒng)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制、代謝情況及生理活性。該體系能夠同時(shí)研究藥物的吸收代謝和生理活性，更好地模擬了藥物經(jīng)腸道吸收代謝后在循環(huán)系統(tǒng)的藥理作用，全面反映生物利用，提供了一種更真實(shí)反映藥物生物利用度的體外細(xì)胞模型。
附圖說明
圖1transwell非接觸式共培養(yǎng)示意圖
四、具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
實(shí)施例1
將25～40代的caco-2細(xì)胞用dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，ph7.4)于37℃、5％co2環(huán)境培養(yǎng)，隔天換液，每3天用0.25％胰酶/0.53mmol/ledta溶液消化細(xì)胞，按1∶3的比例傳代。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按1×105/ml接種到24孔transwell板上層，培養(yǎng)至21天，用電位儀測(cè)caco-2細(xì)胞層的電阻值teer大于550ω·cm2，細(xì)胞完全分化。將2～6代的huvec細(xì)胞用dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、100μg/ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、2％青霉素-鏈霉素雙抗液，ph7.4)于37℃、5％co2環(huán)境培養(yǎng)，隔天換液，用0.25％胰酶/0.1％edta溶液消化細(xì)胞，按1∶3的比例傳代。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按1×105/ml接種到24孔用明膠包被好的transwell板下層，至細(xì)胞長(zhǎng)滿至細(xì)胞長(zhǎng)滿80～90％。分化完全的caco-2細(xì)胞transwell上層小室插入到培養(yǎng)好的huvec細(xì)胞transwell下層小室中，微調(diào)整dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、100μg/ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、2％青霉素-鏈霉素雙抗液，ph7.4)，于37℃、5％co2環(huán)境非接觸共同培養(yǎng)，mtt法檢測(cè)細(xì)胞存活率大于95％，caco-2/huvec細(xì)胞共培養(yǎng)體系構(gòu)建完成，用于研究藍(lán)莓花青素經(jīng)腸道吸收后在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的生物利用度。