一株明串珠菌突變菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明一株明串珠菌突變菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用方法，涉及細(xì)菌，是葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突變菌株，為腸膜明串珠菌Δdtsl（即Leuconostoc?MesenteroidesΔdtsl）菌株,其在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏日期是2013年12月29日，保藏號(hào)是CCTCC?No:M2013724；構(gòu)建方法是通過基因敲除手段使明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因失活而構(gòu)建成為明串珠菌突變菌株；將該菌株以1%轉(zhuǎn)接到MRS培養(yǎng)基中，于30℃下，以轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘的搖床培養(yǎng)20h，該明串珠菌突變菌株的甘露醇產(chǎn)率比原始腸膜明串珠菌提高了15.3%，蔗糖中果糖部分的轉(zhuǎn)化率提高了6.1%。
【專利說明】一株明串珠菌突變菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明的技術(shù)方案涉及細(xì)菌，具體地說是一株明串珠菌突變菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甘露醇被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工和電子等行業(yè)。全球甘露醇消費(fèi)量約占多元醇總量的11%，每年約為15萬噸。美國(guó)是甘露醇的最大消費(fèi)國(guó)。其它如歐洲國(guó)家，用于生產(chǎn)口香糖、口含片、嘴嚼片的用量均較大。我國(guó)目前甘露醇消費(fèi)主要是直接用于生產(chǎn)甘露醇注射液、藥品輔助添加劑和無糖型食品添加劑等。由于食品行業(yè)尤其是口香糖對(duì)甘露醇需求量快速增加，甘露醇市場(chǎng)容量迅速擴(kuò)大。甘露醇在醫(yī)藥行業(yè)用量較大，目前我國(guó)僅甘露醇注射液每年就要消耗甘露醇4500噸，2003年醫(yī)藥行業(yè)消費(fèi)甘露醇5600噸。近年來我國(guó)肥胖和糖尿病較為嚴(yán)重，而且有越來越嚴(yán)重的趨勢(shì)，因此對(duì)無糖并具有營(yíng)養(yǎng)的甜味劑甘露醇需求潛力巨大，2004年我國(guó)食品及其添加劑領(lǐng)域?qū)Ω事洞嫉男枨罅考s3000噸。
[0003]目前，雖然有多種生產(chǎn)甘露醇的方法，但其中以微生物發(fā)酵法有著明顯的優(yōu)勢(shì)。很多菌株以果糖為底物發(fā)酵產(chǎn)生甘露醇，而明串珠菌將果糖和蔗糖都可以作為底物產(chǎn)生甘露醇。廉價(jià)的蔗糖進(jìn)入明串珠菌胞內(nèi)后，分解成1-磷酸葡萄糖和果糖，果糖再轉(zhuǎn)化為甘露醇，反應(yīng)步驟相對(duì)少；而同型乳酸發(fā)酵的乳桿菌中葡萄糖經(jīng)6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖和1-磷酸甘露醇等中間產(chǎn)物最終轉(zhuǎn)化為甘露醇，反應(yīng)步驟相對(duì)多；因此明串珠菌實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)甘露醇的潛力比乳桿菌大。
[0004]然而，現(xiàn)有的明串珠菌發(fā)酵技術(shù)中，蔗糖既可以直接進(jìn)入胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為甘露醇，又可以在胞外葡聚糖蔗糖酶的作用下產(chǎn)生葡聚糖和果糖，果糖進(jìn)入胞內(nèi)參與碳代謝也可以轉(zhuǎn)化為甘露醇，因此在胞外葡聚糖蔗糖酶的作用使甘露醇的產(chǎn)率下降。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:提供一株明串珠菌突變菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用方法，該明串珠菌突變菌株是葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突變菌株，基于同源重組，通過把基因敲除手段使明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因失活，進(jìn)而阻礙葡聚糖合成途徑，從而克服了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘露醇中成本過高的瓶頸問題，結(jié)果使甘露醇產(chǎn)率比原始菌株提高了 15.3%，蔗糖中果糖部分的轉(zhuǎn)化率提高了 6.1%。
[0006]本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一株明串珠菌突變菌株，是葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突變菌株，為腸膜明串珠菌Adtsl，即LeuconostocMesenteroides Λ dtsl菌株，其在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2013 年 12 月 29 日，保藏號(hào)是 CCTCCM2013724。
[0007]—株明串珠菌突變菌株的構(gòu)建方法，通過基因敲除手段使明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因失活而構(gòu)建成為明串珠菌突變菌株即腸膜明串珠菌Adtsl (即LeuconostocMesenteroides Δ dtsl,保藏號(hào)是 CCTCCM2013724)菌株,步驟如下:[0008]第一步，明串珠菌葡聚糖蔗糖酶基因部分序列的克隆
[0009]將基因編碼序列長(zhǎng)度超過4kb的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides,保藏日期為2009年12月31日，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號(hào)為CGMCC1.10327)的葡聚糖蔗糖酶分成2段克隆后拼接成ORF內(nèi)的部分連續(xù)序列，具體操作步驟是:
[0010](I)保藏編號(hào)為CGMCC1.10327的腸膜明串珠菌總DNA的提取，
[0011](2) PCR擴(kuò)增葡聚糖蔗糖酶基因，
[0012](3)感受態(tài)大腸桿菌DH5a的制備和DNA轉(zhuǎn)化；
[0013]第二步，同源重組載體的構(gòu)建
[0014](I)設(shè)計(jì)二對(duì)引物Dtsqtl與Dtsqt2和Dtshtl與Dtsht2,分別以其中的一個(gè)片段的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
[0015](2)以純化的PCR產(chǎn)物混合物為模板，利用一對(duì)引物Dtsqtl和Dtsht2再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
[0016](3)將重疊延伸PCR產(chǎn)物和pUC19用KpnI和SalI進(jìn)行雙酶切后，兩者在T4-DNA連接酶的作用下連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組質(zhì)粒pUC19-Dtsqh,即構(gòu)建為同源重組載體；
[0017]第三步，葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突變菌株的構(gòu)建
[0018]以電擊轉(zhuǎn)化法將 第二步得到的同源重組載體導(dǎo)入到腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides,保藏日期為2009年12月31日，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號(hào)為CGMCC1.10327)中，從平板上篩選葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突變菌株，設(shè)計(jì)一對(duì)引物Dtsyl和Dtsy2，提取總DNA，以染色體DNA為模板進(jìn)行PCR，驗(yàn)證證明構(gòu)建得到葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突變菌株，即腸膜明串珠菌Δ dtsl (Leuconostoc Mesenteroides Δ dtsl,保藏號(hào)是 CCTCCM2013724)菌株。
[0019]一株明串珠菌突變菌株的應(yīng)用方法，將明串珠菌突變菌株即腸膜明串珠菌Adtsl(Leuconostoc Mesenteroides Δ dtsl,保藏號(hào)是 CCTCCM2013724)菌株以重量百分比 1% 轉(zhuǎn)接到MRS培養(yǎng)基中，于30°C下，以轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘的搖床培養(yǎng)20h，檢測(cè)代謝產(chǎn)物，通過對(duì)比試驗(yàn)證明，該明串珠菌突變菌株的甘露醇產(chǎn)率比原始腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides,保藏編號(hào)為CGMCC1.10327)提高了 15.3%,鹿糖中果糖部分的轉(zhuǎn)化率提高了 6.1%。
[0020]上述一株明串珠菌突變菌株的應(yīng)用方法，所述MRS培養(yǎng)基的的組成為:酵母浸粉2克、蔗糖20克、檸檬酸銨2 克、乙酸鈉5克、K2HP042克、MnSO4.H2O0.039克、吐溫80 0.4毫升和水1000毫升，用乙酸調(diào)pH到6.2，在121°C，滅菌20分鐘。
[0021]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步是，
[0022](I)通過把基因敲除手段使明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因失活，進(jìn)而阻礙葡聚糖合成途徑，從而克服了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘露醇中成本過高的瓶頸問題，因此構(gòu)建好的腸膜明串珠菌突變菌株可以直接應(yīng)用于生產(chǎn)中。
[0023](2)葡聚糖蔗糖酶基因敲除的腸膜明串珠菌突變菌株使甘露醇產(chǎn)率比原始腸膜明串珠菌提高了 15.3%，蔗糖中果糖部分的轉(zhuǎn)化率提高了 6.1%，即提高了發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0025]圖1為本發(fā)明一株明串珠菌突變菌株的構(gòu)建方法的構(gòu)建同源重組載體中同源前臂和同源后臂的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0026]圖2為本發(fā)明一株明串珠菌突變菌株的構(gòu)建方法的構(gòu)建同源重組載體中重疊延伸PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0027]圖3為本發(fā)明一株明串珠菌突變菌株的構(gòu)建方法的構(gòu)建同源重組載體中驗(yàn)證重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0028]圖4為本發(fā)明一株明串珠菌突變菌株的構(gòu)建方法的通過PCR驗(yàn)證突變菌株的瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]圖1本發(fā)明構(gòu)建同源重組載體中同源前臂和同源后臂的瓊脂糖凝膠電泳圖中顯示，其中:左邊2列表示550bp的同源前臂，中間是Marker，右邊2列是460bp的同源后臂。
[0030]圖2本發(fā)明構(gòu)建同源重組載體中重疊延伸PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖中顯示，其中:左邊是Marker，右邊2列是1000bp的重疊延伸PCR產(chǎn)物，同源前臂和同源后臂通過重疊延伸PCR連接在一起的 ，就是說與相應(yīng)的原始序列相比中間少800bp。
[0031]圖3本發(fā)明構(gòu)建同源重組載體中驗(yàn)證重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖中顯示，其中:左邊是將重疊延伸PCR產(chǎn)物連接到pUC19上的重組質(zhì)粒，即構(gòu)建好的同源重組載體,右邊是pUC19。
[0032]圖4通過PCR驗(yàn)證突變菌株的瓊脂糖凝膠電泳圖中顯示,其中:左邊是Marker,中間是原始菌株1500bp的葡聚糖蔗糖酶基因部分序列，右邊是突變菌株700bp的對(duì)應(yīng)于原始菌株序列的葡聚糖蔗糖酶基因部分序列。
[0033]實(shí)施例1
[0034]通過基因敲除手段使明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因失活而構(gòu)建成為明串珠菌突變菌株即腸膜明串珠菌Adtsl (Leuconostoc Mesenteroides Δ dtsl)菌株,步驟如下:
[0035]第一步，明串珠菌葡聚糖蔗糖酶基因部分序列的克隆
[0036]將基因編碼序列長(zhǎng)度超過4kb的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides,保藏日期為2009年12月31日，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號(hào)為CGMCC1.10327)的葡聚糖蔗糖酶分成2段克隆后拼接成ORF內(nèi)的部分連續(xù)序列，具體操作步驟是:
[0037](I)保藏編號(hào)為CGMCC1.10327的腸膜明串珠菌總DNA的提取
[0038]將在_80°C凍存的保藏編號(hào)為CGMCC1.10327的菌株劃線于MRS固體平板上，于30°C過夜培養(yǎng)；從固體平板上挑取一個(gè)單菌落接種到5毫升MRS液體培養(yǎng)基中，于30°C，轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘的搖床培養(yǎng)過夜；取2毫升的上述培養(yǎng)的菌液以轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，收集菌體；用為菌體體積0.1倍的TE，即2毫升TE洗兩次菌體；將菌體溶于380微升的TES溶液中；加入100微升的溶菌酶和5微升的濃度為10毫克/毫升的RNA酶A，在37°C的水浴中放置Ih ;加入30微升的20%的SDS和20微升的濃度為20毫克/毫升的蛋白酶K，在50°C的水浴中放置2h ;用酚-氯仿溶液2次，取上清；加入2倍體積的無水乙醇，在4°C放置2h后，以轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；用體積百分比為70%的乙醇清洗I次，于4°C以轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘；將沉淀溶于20微升TE (Tris-HCllOO毫摩爾/升、EDTAlO毫摩爾/升，pH8.0)溶液中。
[0039]上述MRS培養(yǎng)基的組成:酵母浸粉3克、蛋白胨10克、牛肉浸粉8克、葡萄糖20克、檸檬酸銨 2 克、乙酸鈉 5 克、K2HP042 克、MgSO4.7H20 2 克、MnSO4.H2O 0.039 克、吐溫 801.6毫升和水1000毫升，用乙酸調(diào)pH到6.2 ;121°C滅菌20min。固體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂。
[0040]上述TES溶液為用Tris-HC150毫摩爾/升、EDTAl毫摩爾/升和蔗糖6.7%配制的溶液。
[0041]上述酚-氯仿溶液為用酚:氯仿:異戊醇體積比為25:24:1配制成的溶液。
[0042]上述TE溶液為用Tris-HCl 100毫摩爾/升和EDTAlO毫摩爾/升配制，pH為8.0。
[0043](2) PCR擴(kuò)增葡聚糖蔗糖酶基因
[0044]設(shè)計(jì)一對(duì)引物Dtsql:5’-AGAGTTGGGTAGTTGGTGG-3’ 和 Dtsq2:5’ -TGGTATGGTGACTTTGTTG-3’，以上述腸膜明串珠菌總DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到為2200bp的片段，并用T4連接酶將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T上，重組質(zhì)粒命名為pMD19-T_Dtsq。
[0045]設(shè)計(jì)一對(duì)引物Dtshl:5’-GTTTCCGTTTTGTATCCTG-3’ 和 Dtsh2:5’ -GGCTCTATCTTTTGTTTGT-3’，以上述腸膜明串珠菌總DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到為2500bp的片段，并用T4連接酶將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T上，重組質(zhì)粒命名為pMD19-T_Dtsh。
[0046](3)感受態(tài)大腸桿菌DH5a的制備和DNA轉(zhuǎn)化
[0047]將在_80°C凍存的大腸桿菌DH5 a菌株劃線于LB固體平板上，37°C過夜培養(yǎng)；從固體平板上挑取一個(gè)單菌落接種到5毫升LB液體培養(yǎng)基中，于37°C以轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘搖床過夜培養(yǎng)；取0.2毫升上述培養(yǎng)得到的菌液轉(zhuǎn)接到10毫升液體培養(yǎng)基中，于37°C以轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)2~3h至菌液的OD6tltl為0.6 ;取上述OD6tltl為0.6的菌液1.0毫升加入到1.5毫升離心管中，冰浴10分鐘；于4°C以轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒，棄上清液；加入I毫升冰冷的0.1摩爾/升CaCl2溶液懸浮細(xì)胞，冰浴30分鐘；于4°C以轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒，棄上清液；加入100微升冰冷的0.1摩爾/升CaCl2溶液懸浮細(xì)胞，即為感受態(tài)細(xì)胞，也即感受態(tài)大腸桿菌DH5 α。
[0048]將重組質(zhì)粒10微升加入到在上述感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘；于42°C準(zhǔn)確熱激90秒；立即在冰上放置3分鐘；加入400微升LB液體培養(yǎng)基，于37°C振蕩培養(yǎng)45分鐘；將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上；將平板放置于37°C溫箱30分鐘，至液體被吸收；倒置平板，于37°C培養(yǎng)12~16h。
[0049]挑去單菌落，在氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序鑒定，將2段序列拼接后提交至NCBI并獲得接收號(hào)，為JF917108。
[0050]上述LB液體培養(yǎng)基:酵母浸粉5克，蛋白胨10克，NaCllO克，蒸餾水1000毫升，ρΗ7.0,121°C滅菌20分鐘。固體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂。
[0051]第二步，同源重組載體的構(gòu)建
[0052](I)設(shè)計(jì)一對(duì)引物 Dtsqtl:5’-GGATGGTACCTATGCGATGT-3’ 和 Dtsqt2:5’ -GGTATGGTGTGTTTGTTGTTGT-3’ (與 Dtshtl 互補(bǔ)配對(duì))，以 pMD19_T_Dtsq 為模板，PCR 擴(kuò)增得到為550bp的含有chi位點(diǎn)的片段。
[0053]設(shè)計(jì)一對(duì)弓丨物Dtshtl:5’-CAACAAACACACCATACCTACT-3’ 和 Dtsht2:5’ -CTTGTCGACCACCTTTACTT-3’，以 pMD19_T_Dtsh 為模板，PCR 擴(kuò)增得到為 460bp 的片段。
[0054](2)將上述(I)中得到的2個(gè)PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后混勻，以PCR產(chǎn)物混合物為模板，利用一對(duì)引物 Dtsqtl:5’-GGATGGTACCTATGCGATGT-3’ 和 Dtsht2:5’ -CTTGTCGACCACCTTTACTT-3’再進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到為1000bp的片段。進(jìn)行重疊延伸PCR獲得的含有一個(gè)chi位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度比相應(yīng)的葡聚糖蔗糖酶基因序列大縮短800bp。
[0055](3)將重疊延伸PCR產(chǎn)物和pUC19用KpnI和SalI進(jìn)行雙酶切后，兩者在T4-DNA連接酶的作用下連接，再將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組質(zhì)粒pUC19-Dtsqh,即構(gòu)建為同源重組載體。
[0056]第三步，葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突變菌株的構(gòu)建
[0057]將在_80°C凍存的保藏編號(hào)為CGMCC1.10327明串珠菌菌株劃線于MRS固體平板上，于30°C過夜培養(yǎng)；從固體平板上挑取一個(gè)單菌落接種到5毫升MRS液體培養(yǎng)基中，于300C以轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)過夜；以1%轉(zhuǎn)接到MRS含0.48微克/毫升氨芐的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，初始OD6tltl為0.048的保藏編號(hào)為CGMCC1.10327的明串珠菌菌液的OD6tltl達(dá)到0.5時(shí)收集菌體，用含溶菌酶濃度為100U/毫升的LiAc-DTT溶液重新懸浮菌體，于30°C孵育20分鐘，用冰冷的PBS溶液洗滌兩次，再用50微升冰冷的PBS溶液懸浮菌體，加入5微升第二步得到的同源重組載體質(zhì)粒，冰浴10分鐘后進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，所用電轉(zhuǎn)化儀為Bio-RadGene Pulser XCell?，電 擊參數(shù)為電擊杯間距0.1cm、1400V、25 μ F、300 Ω、電擊時(shí)間為4毫秒，之后加入I毫升MRS培養(yǎng)基,復(fù)蘇3h后,涂布于含MRS固體平板,培養(yǎng)36~48h后挑取單菌落驗(yàn)證，以證明從平板上篩選得到葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突變菌株，即腸膜明串珠菌 Adtsl (Leuconostoc Mesenteroides Δ dtsl,保藏號(hào)是 CCTCCM2013724)菌株。
[0058]設(shè)計(jì)一對(duì)引物Dtsyl:5’-TACGGCTTCTGACACTGG-3’ 和 Dtsy2:5’ -TACGGCTTCTGACACTGG-3’，提取總DNA，以染色體DNA為模板進(jìn)行PCR，上述明串珠菌突變菌株，即腸膜明串珠菌Adtsl (Leuconostoc Mesenteroides Δ dtsl，保藏號(hào)是CCTCCM2013724)菌株得到700bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，而原始腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides，保藏編號(hào)為CGMCC1.10327)得到1500bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0059]上述MRS液體培養(yǎng)基的組成:酵母浸粉3克、蛋白胨10克、牛肉浸粉8克、葡萄糖20克、檸檬酸銨2克、乙酸鈉5克、K2HP042克、MgSO4.7H20 2克、MnSO4.H2O 0.039克、吐溫801.6毫升和水1000毫升，用乙酸調(diào)pH到6.2 ;121°C滅菌20min。固體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂。
[0060]上述TES溶液為用Tris-HC150毫摩爾/升、EDTAl毫摩爾/升和蔗糖6.7%配制的溶液。
[0061]上述PBS溶液為K2HPO4-KH2PO4I毫摩爾/升、MgCl2I毫摩爾/升和蔗糖0.5摩爾/升配制的溶液，pH為6.9。
[0062]實(shí)施例2
[0063]用一株明串珠菌突變菌株即腸膜明串珠菌Adtsl (LeuconostocMesenteroides Λ dtsl，保藏號(hào)是 CCTCCM2013724)發(fā)酵生產(chǎn)甘露醇。
[0064]將明串珠菌突變菌株即腸膜明串珠菌Adtsl (LeuconostocMesenteroides Λ dtsl，保藏號(hào)是CCTCCM2013724)菌株以1%轉(zhuǎn)接到MRS培養(yǎng)基中，于30°C下，以轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘的搖床培養(yǎng)20h，檢測(cè)代謝產(chǎn)物，通過對(duì)比試驗(yàn)證明，該明串珠菌突變菌株的甘露醇產(chǎn)率比原始腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides,保藏編號(hào)為CGMCC1.10327)提高了 15.3%，蔗糖中果糖部分的轉(zhuǎn)化率提高了 6.1%。
[0065]上述一株明串珠菌突變菌株的應(yīng)用方法，所述MRS培養(yǎng)基的的組成為:酵母浸粉2克、蔗糖20克、檸檬酸銨2克、乙酸鈉5克、K2HP042克、MnSO4^H2O 0.039克、吐溫80 0.4毫升和水1000毫升，用乙酸調(diào)pH到6.2，在121°C，滅菌20分鐘。
[0066]表1列出了本實(shí)施例制得的明串珠菌突變菌株即腸膜明串珠菌Adtsl(Leuconostoc Mesenteroides Δ dtsl,保藏號(hào)是CCTCCM2013724)菌株和原始腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides,保藏編號(hào)為CGMCC1.10327)在生產(chǎn)甘露醇中各種代謝產(chǎn)物的量。
[0067]表1.各種代謝產(chǎn)物的量(單位:克/升)
[0068]
【權(quán)利要求】
1.一株明串珠菌突變菌株，其特征在于:是葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突變菌株，為腸膜明串珠菌Adtsl (Leuconostoc Mesenteroides Δ dtsl)菌株，其在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2014年01月03日，保藏號(hào)是CCTCCM2013724。
2.權(quán)利要求1所述一株明串珠菌突變菌株的構(gòu)建方法，其特征在于:通過基因敲除手段使明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因失活而構(gòu)建成為明串珠菌突變菌株即腸膜明串珠菌Δ dtsl (Leuconostoc Mesenteroides Δ dtsl,保藏號(hào)是 CCTCCM2013724)菌株,步驟如下: 第一步，明串珠菌葡聚糖蔗糖酶基因部分序列的克隆 將基因編碼序列長(zhǎng)度超過4kb的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides,保藏日期為2009年12月31日，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號(hào)為CGMCC1.10327)的葡聚糖蔗糖酶分成2段克隆后拼接成ORF內(nèi)的部分連續(xù)序列，具體操作步驟是: (1)保藏編號(hào)為CGMCC1.10327的腸膜明串珠菌總DNA的提取， (2)PCR擴(kuò)增葡聚糖蔗糖酶基因， (3)感受態(tài)大腸桿菌DH5α的制備和DNA轉(zhuǎn)化； 第二步，同源重組載體的構(gòu)建 (1)設(shè)計(jì)二對(duì)引物Dtsqtl與Dtsqt2和Dtshtl與Dtsht2,分別以其中的一個(gè)片段的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增， (2)以純化的PCR產(chǎn)物混合物為模板，利用一對(duì)引物Dtsqtl和Dtsht2再進(jìn)行PCR擴(kuò)`>曰， (3 )將重疊延伸PCR產(chǎn)物和pUC19用KpnI和Sal I進(jìn)行雙酶切后，兩者在T4-DNA連接酶的作用下連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組質(zhì)粒pUC19_Dtsqh，即構(gòu)建為同源重組載體； 第三步，葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突變菌株的構(gòu)建 以電擊轉(zhuǎn)化法將第二步得到的同源重組載體導(dǎo)入到腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides,保藏日期為2009年12月31日，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號(hào)為CGMCC1.10327)中，從平板上篩選葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突變菌株，設(shè)計(jì)一對(duì)引物Dtsyl和Dtsy2，提取總DNA，以染色體DNA為模板進(jìn)行PCR，驗(yàn)證證明構(gòu)建得到葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突變菌株，即腸膜明串珠菌Δ dtsl (Leuconostoc Mesenteroides Δ dtsl,保藏號(hào)是 CCTCCM2013724)菌株。
3.權(quán)利要求1所述一株明串珠菌突變菌株的應(yīng)用方法，其特征在于:將明串珠菌突變菌株即腸膜明串珠菌Adtsl (Leuconostoc Mesenteroides Δ dtsl，保藏號(hào)是CCTCCM2013724)菌株以重量百分比1%轉(zhuǎn)接到MRS培養(yǎng)基中，于30°C下，以轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘的搖床培養(yǎng)20h，檢測(cè)代謝產(chǎn)物，通過對(duì)比試驗(yàn)證明，該明串珠菌突變菌株的甘露醇產(chǎn)率比原始腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides,保藏編號(hào)為CGMCC1.10327)提高了15.3%，蔗糖中果糖部分的轉(zhuǎn)化率提高了 6.1%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述權(quán)利要求1所述一株明串珠菌突變菌株的應(yīng)用方法，其特征在于:所述MRS培養(yǎng)基的的組成為:酵母浸粉2克、蔗糖20克、檸檬酸銨2克、乙酸鈉5克、K2HP042克、MnSO4.H2O0.039克、吐溫800.4毫升和水1000毫升，用乙酸調(diào)pH到6.2，在121。。，滅菌20分鐘。
【文檔編號(hào)】C12N15/74GK103865863SQ201410065372
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月26日
【發(fā)明者】金紅星, 成文玉, 張舟 申請(qǐng)人:河北工業(yè)大學(xué)