本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)
技術領域：
，尤其涉及了一種人脂肪間充質干細胞無血清完全培養(yǎng)基。
背景技術：
：人脂肪間充質干細胞(adipose-derivedstemcells，adscs)是目前廣泛應用于組織工程及再生醫(yī)學領域的一種成體干細胞，與骨髓間充質干細胞一樣具有多向分化潛能，具有治療疾病、使器官再生、甚至延年益壽的潛力。如何保證脂肪間充質干細胞的培養(yǎng)和傳代，是研發(fā)脂肪干細胞各項功能的前提。細胞培養(yǎng)基是培養(yǎng)細胞中供給細胞營養(yǎng)和促使細胞生殖的基礎物質，也是培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。細胞培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基，絕大多數人工合成培養(yǎng)基使用時需添加血清。無血清培養(yǎng)基，就是自細胞環(huán)境中不添加血清，但是在某些應用中需要添加生長因子或血清替代品，即血清的主要成分：粘附因子、生長因子、必需的營養(yǎng)物質和激素等。無血清培養(yǎng)基能減少血清帶來的不利因素，使細胞培養(yǎng)的條件更穩(wěn)定。因此，無血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)成為當今細胞培養(yǎng)領域的一大趨勢。無血清培養(yǎng)基的市場巨大、潛力無限，但是由于國產品質量和信譽問題，使得多年來國內一直購買進口的無血清培養(yǎng)基，如何能夠打破這種局面，占有市場，是急需解決的一大問題。中國專利，申請公告號cn102732477a，公開了一種人脂肪干細胞無血清基礎培養(yǎng)基，由高糖型dmem基礎培養(yǎng)基、人血清白蛋白、轉鐵蛋白、?；撬帷⑦€原型谷胱甘肽、銅藍蛋白、l-抗壞血酸-2-硫酸酯、α-生育酚琥珀酸單酯、亞油酸、α-酮戊二酸和硒組成；該無血清基礎培養(yǎng)基因能免除常規(guī)含血清培養(yǎng)基中動物血清給人體健康帶來的潛在威脅，其培養(yǎng)的脂肪干細胞更適于臨床應用。技術實現要素：基于
背景技術：
存在的技術問題，本發(fā)明提出了一種人脂肪間充質干細胞無血清完全培養(yǎng)基，避免了血清對細胞的毒性作用和血清源性污染，有利于體外培養(yǎng)人類脂肪間充質干細胞，保持干細胞的特性。一種人脂肪間充質干細胞無血清完全培養(yǎng)基，包括ultraculture無血清培養(yǎng)基、l-谷氨酰胺、bfgf、血清替代品、抗生素。優(yōu)選的，所述血清替代品為ultroserg。優(yōu)選的，所述抗生素包括青霉素和鏈霉素。優(yōu)選的，所述青霉素的濃度為0.01-0.05mg/ml，所述鏈霉素的濃度為0.05-0.15mg/ml。優(yōu)選的，所述l-谷氨酰胺的濃度為0.01-0.03mol/l。優(yōu)選的，所述bfgf的濃度為0.005-0.009ng/ml。優(yōu)選的，所述ultroserg與ultraculture無血清培養(yǎng)基的體積比為(1-5)∶50。一種人脂肪間充質干細胞無血清完全培養(yǎng)基可應用于培養(yǎng)人脂肪間充質干細胞。ultraculture通用型無血清培養(yǎng)基中，蛋白的含量為3mg/ml，不含l-谷氨酰胺。bfgf為堿性成纖維細胞生長因子，是一種促細胞分裂的肝素結合蛋白，可誘導多種細胞的增殖與分化，能延長培養(yǎng)液中多種中樞和外周神經元的存活。ultroserg可作為血清替代品，包含生物細胞生長所必須的物質，包括生長因子、粘附因子、荷爾蒙、結合蛋白、維生素、微量礦物元素等，它的生物活性是血清的5倍。ultroserg組分的一致性，批次的穩(wěn)定性，使實驗結果的可重復性提高。ultroserg一般做成凍干粉的形式，具有較長的保質期，可以批量采購，降低成本。該血清替代品兼容市場主流細胞培養(yǎng)基，同時提高細胞培養(yǎng)品質。無血清培養(yǎng)基中l(wèi)-谷氨酰胺是細胞生長的必須氨基酸，為培養(yǎng)的脂肪干細胞提供重要的能量來源，脫掉氨基后，l-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。l-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，降解率隨保存溫度而變，l-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性，所以l-谷氨酰胺的量要控制在最適的濃度。添加青霉素和鏈霉素可以防止樣本在采集的過程中污染以及運輸過程中細菌的滋生。與現有技術相比，本發(fā)明具有的有益效果在于：本發(fā)明提出的一種人脂肪間充質干細胞無血清完全培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基中加入能夠促進細胞生長的成分和含量都可以確定和控制，保證了實驗結果的準確性、可重復性和穩(wěn)定性；無血清培養(yǎng)基中還添加了添加青霉素和鏈霉素，防止樣本在采集的過程中污染以及運輸過程中細菌的滋生。本發(fā)明提出的無血清培養(yǎng)基，避免了血清對細胞的毒性作用和血清源性污染，有利于體外培養(yǎng)人類脂肪間充質干細胞，保持干細胞的特性。附圖說明圖1為市售無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人脂肪間充質干細胞的掃描電鏡圖；圖2為實施例3所得的無血清基培養(yǎng)人脂肪間充質干細胞的掃描電鏡圖。具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步解說。實施例1一種人脂肪間充質干細胞無血清完全培養(yǎng)基，選用ultraculture無血清培養(yǎng)基500ml、ultroserg為30ml，然后按照如下終濃度要求稱量各組分：l-谷氨酰胺的濃度為0.01mol/l；青霉素的濃度為0.02mg/ml；鏈霉素的濃度為0.15mg/ml；bfgf的濃度為0.009ng/ml。一種人脂肪間充質干細胞無血清完全培養(yǎng)基的制備方法：在無菌安全柜內，將ultroserg溶于ultraculture無血清培養(yǎng)基中；然后依次加入l-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素；待溶液混合均勻后加入bfgf；最后用0.22um濾器過濾備用。實施例2一種人脂肪間充質干細胞無血清完全培養(yǎng)基，選用ultraculture無血清培養(yǎng)基500ml、ultroserg為20ml，然后按照如下終濃度要求稱量各組分：l-谷氨酰胺的濃度為0.03mol/l；青霉素的濃度為0.01mg/ml；鏈霉素的濃度為0.05mg/ml；bfgf的濃度為0.007ng/ml。制備方法同實施例1。實施例3一種人脂肪間充質干細胞無血清完全培養(yǎng)基，選用ultraculture無血清培養(yǎng)基500ml、ultroserg為10ml，然后按照如下終濃度要求稱量各組分：l-谷氨酰胺的濃度為0.02mol/l；青霉素的濃度為0.03mg/ml；鏈霉素的濃度為0.10mg/ml；bfgf的濃度為0.008ng/ml。制備方法同實施例1。實施例4一種人脂肪間充質干細胞無血清完全培養(yǎng)基，選用ultraculture無血清培養(yǎng)基500ml、ultroserg為50ml，然后按照如下終濃度要求稱量各組分：l-谷氨酰胺的濃度為0.01mol/l；青霉素的濃度為0.05mg/ml；鏈霉素的濃度為0.08mg/ml；bfgf的濃度為0.005ng/ml。制備方法同實施例1。實施例5一種人脂肪間充質干細胞無血清完全培養(yǎng)基，選用ultraculture無血清培養(yǎng)基500ml、ultroserg為40ml，然后按照如下終濃度要求稱量各組分：l-谷氨酰胺的濃度為0.03mol/l；青霉素的濃度為0.04mg/ml；鏈霉素的濃度為0.13mg/ml；bfgf的濃度為0.006ng/ml。制備方法同實施例1。一、細胞增殖能力測試實驗方法：用cellcountingkit(cck-8)試劑盒比較實施例1-5培養(yǎng)基培養(yǎng)后的細胞增殖能力；1)在96孔板中接種細胞懸液(100ul/孔)，向培養(yǎng)板中加入不同配方培養(yǎng)基，放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24h(37℃，5％co2)；2)向每孔加入10ulcck-8溶液；3)將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內孵育3小時；4)用酶標儀測定在450nm處的吸光度。實驗結果：表一吸光值結果組別對照組實施例1實施例2實施例3實施例4實施例5吸光值0.5260.7030.7120.7210.7320.709注：對照組為市售無血清培養(yǎng)基。實驗結論：實施例1-5的吸光度值均高于對照組，吸光度值越高，細胞濃度越大，說明使用該本發(fā)明中的無血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，能夠使細胞具備較強的增殖能力。二、掃描電鏡結果分析根據圖1和2可得到以下結論：本發(fā)明所制得的無血清完全培養(yǎng)基與市售無血清培養(yǎng)基相比，更利于體外培養(yǎng)人類脂肪間充質干細胞，其細胞數量較多且生長狀態(tài)優(yōu)良。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術領域：
的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內，根據本發(fā)明的技術方案及其發(fā)明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。當前第1頁12