本發(fā)明設(shè)計農(nóng)業(yè)及微生物領(lǐng)域，特別是本菌株具有解磷解鉀效果可在一定程度上改善大棚土壤板結(jié)的現(xiàn)象。

背景技術(shù)：

磷和鉀都是植物生長所必須的營養(yǎng)要素，磷廣泛參與植物的光合作用和體內(nèi)的生化反應(yīng)，鉀與植物的新陳代謝及生長密切相關(guān)。土壤中的磷主要的以有機(jī)磷和無機(jī)磷形式存在，有機(jī)磷大部分以植酸、核酸、磷脂的形態(tài)存在，不能被直接吸收，必須在微生物作用下轉(zhuǎn)變成無機(jī)磷的形態(tài)才能被吸收。土壤中95％以上的磷不能被植物直接吸收利用。土壤中可溶性鉀含量比較低，但是土壤中含有大量的含鉀礦物，只是它們主要以穩(wěn)定的硅鋁酸鹽形式存在，90％以上的鉀不能為作物吸收利用。土壤中的含鉀硅酸鹽礦物只有在理化因素和微生物的作用下，通過分化和分解逐步釋放出速效鉀供作物生長利用。土壤中可溶性鉀的含量還在以很高的速度不斷下降，造成土壤中速效鉀的缺乏，導(dǎo)致土壤肥力下降。我們在農(nóng)業(yè)上通常通過施用化肥的方法進(jìn)行磷和鉀的補(bǔ)充。但是施加化肥容易造成土壤結(jié)構(gòu)的破壞，以及造成不必要的污染。而且施用化肥磷和鉀也不能充分利用，尤其是磷肥利用率低于30％，大部分的磷固化在土壤中不能被利用。

大棚蔬菜是一種能夠創(chuàng)造出優(yōu)質(zhì)高效的經(jīng)濟(jì)作物的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方法，是當(dāng)前農(nóng)民致富奔小康的一條非常重要的途徑。但隨著栽培時間的積累，施肥技術(shù)的不當(dāng)，很容易出現(xiàn)土壤板結(jié)的現(xiàn)象，嚴(yán)重地影響了溫室蔬菜的可持續(xù)發(fā)展。土壤板結(jié)非常大的一個原因就是氮肥施加過多，有效磷、速效鉀以及其他微量元素少。土壤中磷和鉀含量含量雖然豐富，但是不能直接被吸收，微生物對改良土壤根際環(huán)境，促進(jìn)土壤中有效磷和鉀的釋放，提高土壤肥力有很大作用，所以解磷解鉀菌株可有效地緩解土壤元素失衡，使土壤元素得到充分利用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是得到具有良好解磷解鉀功能的菌株。

本發(fā)明的第二個目的是所篩選菌株能夠?qū)Υ笈锇褰Y(jié)土壤起到一定的改善作用，增強(qiáng)作物的生長力，為開發(fā)相關(guān)菌劑提供技術(shù)支撐。相應(yīng)的減少相關(guān)經(jīng)濟(jì)損失，提高收益，有利于生態(tài)健康發(fā)展和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

實施例一、菌種篩選

芽孢桿菌jjmsh1分離自蔬菜大棚土壤，為實現(xiàn)該發(fā)明，初篩使用有機(jī)磷培養(yǎng)基富集，再使用無機(jī)磷培養(yǎng)基復(fù)篩，之后將具有解磷功能的菌株點(diǎn)接到硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基。故可同時獲得可能具有解磷解鉀效果的菌株。

首先使用有機(jī)磷培養(yǎng)基進(jìn)行富集，取1g大棚蔬菜根際土樣于100ml富集培養(yǎng)基中，28℃200r/min富集2d。之后取無菌生理鹽水稀釋梯度至10-8然后將-6，-7，-8三個梯度涂布于無機(jī)磷培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)，每天觀察長勢，觀察無機(jī)磷培養(yǎng)基水解圈，并記錄其溶磷圈與菌落直徑的直徑比(jjmsh1直徑比為4.1)，將具有水解圈的菌落點(diǎn)接于硅酸鹽培養(yǎng)基并注意觀察菌落形態(tài)，選取在培養(yǎng)基上長勢較旺盛的菌落，將獲得的菌株保存于lb斜面,最終選取5株水解圈較大在鉀礦石培養(yǎng)基上長勢良好的菌株

篩選、培養(yǎng)、保存用培養(yǎng)基

1.有機(jī)磷培養(yǎng)基，蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基加蛋黃液(1000ml)：葡萄糖10g，nh4so40.5g，nacl0.3g，kcl0.3g，7h2o.mgso40.3g，7h2o.feso40.03g，4h2o.mnso0.03g，caco35g,(nh4)3po40.5g，酵母膏0.4g，調(diào)ph7，121℃20min，之后加蛋黃液10ml(無菌生理鹽水與雞蛋黃1:1)(固體加20g瓊脂)

2.無機(jī)磷培養(yǎng)基，蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基加ca3(po3)2：葡萄糖10g，nh4so40.5g，nacl0.3g，kcl0.3g，7h2o.mgso40.3g，7h2o.feso40.03g，4h2o.mnso0.03g，caco35g，ca3(po3)22g，(固體加20g瓊脂)調(diào)ph7，121℃滅菌20min

3.硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基：蔗糖5g，mgs04·7h200.5g，fecl30.005g，na2hpo42g，鉀長石粉(800目，含k2o：9.8％)2g，水1000ml，(瓊脂20g)，調(diào)節(jié)ph7，121℃滅菌20min

4.lb：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，瓊脂(固)調(diào)節(jié)ph7，121℃滅菌20min，之后置于室溫傾斜15°左右自然冷卻凝固，置于4℃冰箱備用。

將分離到的菌株使用lb培養(yǎng)基進(jìn)行活化，之后分別接入三種液體培養(yǎng)基，分別為無機(jī)磷、有機(jī)磷、硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基，接種量為2％，200r/min，培養(yǎng)5d測定其磷鉀含量。

實施例二、有效磷速效鉀測定

本發(fā)明使用鉬銻抗比色法測有效磷含量，火焰光度法測速效鉀含量

鉬銻抗比色法測有效磷

鉬銻抗比色法原理：用2，4-二硝基酚作為指示劑，可溶性磷酸鹽可與鉬銻抗顯色劑反應(yīng)，生成磷鉬藍(lán)，于660nm波長處進(jìn)行比色測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出有效磷的含量，通過有效磷的濃度大小表示微生物溶磷能力的高低。

鉬銻抗比色法常用試劑

1.鉬銻抗貯存液：取98％濃硫酸153ml緩緩地傾入約400ml蒸餾水中，攪拌、冷卻。然后稱取l0.0g鉬酸銨溶于約60℃的300m1水中，冷卻。然后將上述硫酸溶液緩緩加入此鉬酸銨溶液中，再加入5g/l酒石酸銻鉀溶液100ml，最后用水稀釋至ll，盛于棕色瓶中，放于陰暗處保存

2.鉬銻抗顯色劑：抗壞血酸1.5g，溶于l00ml鉬銻抗貯存液中，現(xiàn)配現(xiàn)用

3.磷標(biāo)準(zhǔn)溶液(10mg/l)：磷酸二氫鉀于100℃烘箱烘干2h，冷卻，取0.439g，溶解于100ml蒸餾水中，加入5ml98％濃硫酸，定容至1l，稀釋10倍即為10mg/l磷標(biāo)準(zhǔn)溶液

磷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別吸取5mg/l磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2、4、6、8、10、12ml，分別加水稀釋至26.3m1，加入5ml鉬銻抗顯色劑，搖勻后定容，即得0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/l磷溶液，20℃下放置4h后，以0mg/l磷標(biāo)準(zhǔn)液為對照溶液，其余磷標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測液同時比色，并記錄在660nm下的吸光度。以測得的吸光度為縱坐標(biāo)，磷濃度(mg/l)為橫坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)磷曲線

取發(fā)酵液50ml，4000r/min離心30min，取上清液，用蒸餾水稀釋適50倍后，取25ml，滴加2～3滴2，4-二硝基酚指示劑溶液，用1mol/l氫氧化鈉溶液或硫酸溶液調(diào)節(jié)ph至溶液剛呈現(xiàn)微黃，加入鉬銻抗顯色劑5m1搖勻，定容至刻度?？瞻自囼灠l(fā)酵液做相同的處理。660nm處比色，測定吸光度，以空白試驗發(fā)酵液為對照液調(diào)零點(diǎn)，讀取吸光度值，在工作曲線上查出磷標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，計算得到。

通過檢測得到菌株jjmsh1菌株無機(jī)磷培養(yǎng)基有效磷含量為59.81mg/l培養(yǎng)基，其他四株菌jjmsh2、3、4、5分別為，23.10、41.32、39.28、65.45mg/l

菌株jjmsh1菌株有機(jī)磷培養(yǎng)基有效磷含量為41.23mg/l培養(yǎng)基，其他四株菌jjmsh2、3、4、5分別為，29.88、40.51、39.11、17.82mg/l

火焰光度法測速效鉀

1.1mol/l中性醋酸銨溶液：稱取純醋酸銨77.09g加水溶解，定容至近1l，檢測ph，用醋酸和氨水調(diào)節(jié)至ph7

2.鉀的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：kcl100℃攝氏度烘干2h，稱取0.1907g溶于1mol/l醋酸銨溶液中，定容至1l，即為含100ug/mlk標(biāo)準(zhǔn)液0,2.5,5,7.5,10,15,20ml放入50ml容量瓶中，用1mol/l醋酸銨溶液定容，即為0、5、10、15、20、30、40ug/mlk標(biāo)準(zhǔn)系列溶液

將菌液取25ml全部傾入蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上濃縮至5ml左右，加2ml過氧化氫繼續(xù)蒸發(fā)，不斷攪動，反復(fù)加幾次，直到粘液物質(zhì)完全消化為止。3500r/min離心10min，將上清液收集在50ml容量瓶中，用蒸餾水定容。對照培養(yǎng)基做相同處理。濾液和鉀的標(biāo)準(zhǔn)液一起在火焰光度計上測定

檢測得到菌株jjmsh1菌株無機(jī)磷培養(yǎng)基速效鉀含量為28.56mg/l培養(yǎng)基，其他四株菌jjmsh2、3、4、5分別為，23.11、7.32、19.18、22.37mg/l

選定菌株jjmsh1為較為理想菌株

實施例三、菌株jjmsh1菌種鑒定

菌落表面形態(tài)粗糙、不透明、顏色乳白色少許偏黃，類似于芽孢桿菌屬某些菌株菌落形態(tài)

革蘭氏染色以及芽孢染色

革蘭氏染色：涂片固定，結(jié)晶紫初染1分鐘，自來水沖洗，注意不要把菌體沖掉，碘液媒染約1分鐘，水洗，用吸水紙吸去水分，95％酒精一滴，15～20秒后水洗，吸去水分，蕃紅染色液復(fù)染1分鐘后，自來水沖洗，油鏡觀察。

本發(fā)明菌株經(jīng)過革蘭氏染色，鑒定為陽性菌，菌體為長桿狀，偶見有類似未著色芽孢產(chǎn)生。

芽孢染色

涂片、干燥、固定，滴加3—5滴孔雀綠染液，載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，勿使染液蒸干，約4—5分鐘，水洗至孔雀綠不再褪色為止，番紅復(fù)染1分鐘，水洗，干燥后，油鏡觀察

觀察到有少許綠色芽孢以及大量紅色菌體

本發(fā)明鑒定為芽孢桿菌

實施例四、芽孢桿菌發(fā)酵

菌株jjmsh1于100mllb液體培養(yǎng)基中活化，35℃200r/min活化，然后接種于10l發(fā)酵罐，培養(yǎng)基包括胰蛋白胨:5-10g/l,酵母提取物:5-10g/l,氯化鈉:2-10g/l，轉(zhuǎn)速300rpm,溫度25-35℃，培養(yǎng)12-24h，然后取合適梯度進(jìn)行菌落計數(shù)為100億/ml。

實施例四、大棚土壤應(yīng)用試驗

將菌液分別稀釋100、200、400倍。

大棚板結(jié)土壤4000目篩子過篩

取12個1l燒杯，分別標(biāo)號1～12，121℃滅菌20min，分別裝入相同的已過篩大棚板結(jié)土壤0.5kg，,1～3為對照組，4～12為實驗組，實驗組各噴50ml菌液，每3個為一個稀釋倍數(shù)，對照組每個噴相同體積的無菌水

25℃培養(yǎng)15d

土壤有效磷含量測定

每個樣品分別取土樣2g

加入50ml0.5mol/lnahco3溶液，25℃180r/min震蕩30min，8000r/min取上清25ml，相同的方法做一組空白用于標(biāo)零，具體見實施例二

對照組有效磷含量為9.75mg/kg,實驗組噴灑稀釋100倍菌劑土樣有效磷含量約為13.23mg/kg，噴灑稀釋200倍菌劑土樣有效磷含量約為12.11mg/kg，噴灑稀釋400倍菌劑土樣有效磷含量約為10.87mg/kg

稀釋100、200、400倍有效磷含量分別增加了35.7％、24.2％、11.9％

土壤速效鉀含量測定

每個樣品分別取土樣2g

加入50ml1mol/l醋酸銨溶液，25℃180r/min震蕩30min，8000r/min取上清25ml，相同的方法做一組空白用于標(biāo)零，具體見實施例二

對照組速效鉀含量為5.01mg/kg,實驗組噴灑稀釋100倍菌劑土樣有效磷含量約為6.32mg/kg，噴灑稀釋200倍菌劑土樣有效磷含量約為5.77mg/kg，噴灑稀釋400倍菌劑土樣有效磷含量約為5.27mg/kg

稀釋100、200、400倍速效鉀含量分別增加了26.1％、15.2％、5.2％

<110>中國科學(xué)院過程工程研究所

<120>一株解磷解鉀芽孢桿菌的篩選及其在改良大棚蔬菜土壤板結(jié)中的應(yīng)用

<130>2017

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<213>bacillussubtilisjjmsh1

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